127 mẫu thử Lao thưòng:
4.2.3. Phương pháp PCR.
- Do điều kiện thời gian tiến hành thí nghiệm của chúng tôi chỉ thực hiện trong vòng 5 tháng nên những số liệu mà chúng tôi có được cho đến giờ chỉ có thể so sánh vói kết quả của phương pháp soi trực tiếp và phương pháp nuôi cấy. Tuy nhiên để đánh giá bộ kit thử nghiệm một cách đáng tin cậy thì những số liệu mà chúng tôi có được cũng chưa thật sự đầy đủ để xem đây là một chuẩn trong cách so sánh, bởi vì để xem xét độ tin cậy và độ nhạy của thử nghiệm PCR đối với sự xác định M. tuberculosis trong các mẫu bệnh phẩm đã có một công trình nghiên cứu về vấn đề nầy với sự tham gia của 7 phòng thí nghiệm đã tiến hành xác định 200 mẫu bệnh phẩm và kết quả cho thấy có hai vấn đề lớn trong việc sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh lao đó là kết quả dương giả do ngoại nhiễm và âm giả do các yếu tố ức chế sự hoạt động của men ADN polymerase (Noordhoek G.T et al., 1994).
Trong nghiên cứu này khi áp dụng thử nghiệm PCR ở bước đầu của đề tài, chúng tôi chỉ có thể dùng các phương pháp đơn giản nhất để hạn chế tối đa việc ngoại nhiễm như thao tác cẩn thận trong quá trình ly trích ADN, pha PCR mix trong buồng thao tác PCR của biorad có hệ thống xử lý bằng tia cực tím uv sau mỗi buổi làm việc. Trong quá tình khuếch đại PCR chúng tôi luôn sử dụng một mẫu chứng âm và một mẫu chứng dương song song với các mẫu thử. Nhưng để xem xét độ đặc hiệu và độ nhạy của bộ kit thử nghiệm một cách khách quan và đáng tin cậy nhằm có thể ứng dụng ữong chẩn đoán bệnh
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học46 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
lao đòi hỏi phải có thời gian để thu nhận và thử nghiệm vói số luợng mẫu đủ lớn, cũng như các thông tin về bệnh nhân vói kết luận chẩn đoán cuối cùng của Bác sĩ lâm sàng. Phản ứng PCR phải được thêm vào các thành phần chuyên biệt để có thể kiểm soát một cách tốt nhất hai nhược điểm lớn của kỹ thuật PCR đó là vấn đề âm giả và dương giả.
Thử nghiệm PCR trong đề tài này của chúng tôi khi đem so với bộ kit thương mại có kết quả gần như phù hợp. Ở 40 mẫu bệnh phẩm là lao ngoài phổi có kết quả soi trực tiếp là 0%, kết quả PCR của bộ kit thương mại và của bộ kit thử nghiệm cũng đã không phát hiện, trong khi đem nuôi cấy đã có hai mẫu bệnh phẩm (5%) cho kết quả dương tính, điều này không phù hợp các nghiên cứu khác, vì ở các nghiên cứu này đã công bố với các loại mẫu bệnh phẩm là lao ngoài phổi PCR cho kết quả dương tính rất cao. Theo Nguyễn Ngọc Lan (2001) trong 317 mẫu thử là lao ngoài phổi: nuôi cấy 21,8 %, PCR là 46,7 %, soi trực
tiếp 3,5 % . Măc dù chúng tôi thu được số lượng mẫu bệnh phẩm lao ngoài phổi là 40 mẫu, đa số là dịch màng phổi có kết quả nuôi cấy dương tính hai mẫu trong khi cả hai bộ thử của phản ứng PCR đều cho kết quả âm tính, điều này có thể giải thích như sau: Có thể là do ở khâu qui trinh thu nhận mẫu trong đề tài này, nếu số lượng vi khuẩn lao có trong mẫu thử quá ít nên khi chia mẫu thử làm 3 phần có lẽ vi khuẩn chỉ hiện diện trong phần mẫu thử được đem nuôi cấy trong khi đối vói mẫu thử được đem thực hiện với phản ứng PCR đã không còn sót lại bất kỳ một vi khuẩn nào nên phản ứng PCR đã không có chuỗi ADN đích để khuếch đại. Đối với các trường hợp lao phổi trong tổng số 43 mẫu bệnh phẩm thu được đã cho kết quả soi trực tiếp là 0%, nuôi cấy là 30,2 % PCR bộ kit thương mại là 40% và PCR bộ kit thử nghiệm là 41,8 %. Cũng theo Nguyễn Ngọc Lan (2001) kết quả nuôi cấy 56,8%, PCR 75%, soi trực tiếp 32,8% trong tổng số 192 mẫu thử. Với kết quả phần trăm này có thể giải thích là do nếu đem soi trực tiếp mà cho kết quả dương tính thì khả năng bệnh phẩm chứa số lượng vi khuẩn lao rất lớn nên khi nuôi cấy và thực hiện PCR sẽ cho kết quả dương tính cao. Ngoài ra kết quả PCR luôn dương tính cao hơn so với phương pháp nuôi cấy do có một số lượng vi khuẩn lao bị chết đi ữong quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm cũng như trong mẫu bệnh phẩm có chứa những vi khuẩn lao đã chết trước khi cấy nên đã làm hạn chế khả năng mọc của vi khuẩn trên môi trường thích hợp. Trong khi đó ADN không bị phá hủy trong quá trình xử lý mẫu trước khi thực hiện kỳ thuật ly trích, vì vậy kết quả PCR không bị ảnh hưởng và điều này có thể giải thích đuợc nguyên
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học47 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
nhân của những trường hợp có kết quả PCR dương tính nhưng kết quả nuôi cấy lại âm tính.
Đối với mẫu bệnh phẩm là lao kháng thuốc thì đây là loại mẫu chúng tôi có thêm được các thông tin về mặt chẩn đoán lâm sàng nhưng lại không có kết quả của bộ kit thương mại, nhưng ở nhóm bệnh phẩm này bộ kit thử nghiệm PCR cho kết quả cao hơn hẳn với nhóm bênh nhân lao thường, cụ thể kết quả nuôi cấy ở nhóm này là 80% và PCR của bộ kit thử nghiệm là 77,2% và kết quả của soi trực tiếp là 0%. Như vậy kết quả này gần như phù hợp vói những nghiên cứu đã công bố trước đây.CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1.Kết luận.
- Qua kết quả đã đạt được, bộ kit PCR thử nghiệm bước đầu có thể đưa vào áp dụng trong chẩn đoán nhằm hổ trợ các phương pháp thường qui hiện nay.
-Trong 127 mẫu bệnh phẩm, bộ kit đã phát hiện 40,9%, trong khi đó soi trực tiếp là 0%, nuôi cấy là 39,37%.
-Bộ kit thử nghiệm đã cho kết quả tương đối phù hợp với các nghiên cứu trước đây và kết quả này gần như tương đương với bộ kit thương mại.
5.2.Đề nghị.
-Để có thể đưa bộ kit vào sử dụng trong chẩn đoán hổ trợ cho các xét nghiệm thường qui cần đánh giá bộ kit thử nghiệm với số lượng mẫu lớn hơn.
-Cần kết hợp với Bệnh viện lao và bệnh phổi cần Thơ trong thời gian dài hơn để có cơ sở so sánh với kết luận xác định bệnh lao của các bác sĩ lâm sàng.
-Phải xây dựng thêm qui trình chuẩn nhằm kiểm soát các thành phần chuyên biệt để có thể khắc phục hai nhược điểm lớn của thử nghiệm PCR như đã đề cập ở phần thảo luận đó là kết quả dương giả và âm giả.
-Với những trang thiết bị hiện nay và trên cơ sở kết quả của bộ kit thử nghiệm sẽ đưa thêm kỹ thuật realtime-PCR để có thể định lượng mẫu thử
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học48 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
.TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Âu Thanh Tùng. 2001. Vai trò thử nghiệm polymerase chain reaction (PCR) trong chẩn đoán lao màng phổi. Tạp chí y học TP Hỗ Chí Minh, Tập số 5, Phụ bản số 2.
Đái Duy Ban. 2006. Công nghệ gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
Khuất Hữu Thanh. 2006. Kỹ thuật gen, nguyên lý và ứng dụng, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
Mai Nguyệt Thu Hồng, Cao Minh Nga, Huỳnh Thanh Bình. 2005. Phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn lao trên một số đối tượng khác nhau. Tạp chí y học TP Hồ Chí Minh, Tập số 9, Phụ bản số 1.
Nguyễn Ngọc Lan, Trần Ngọc Đường, Lê Quốc Thịnh,Phạm Hùng Yân. 1999. Chẩn đoán lao màng não ở ttẻ em bằng phương pháp polymerase chain reaction. Tạp chí y học TP
Hồ chí Minh, Tập số 3, số 2.
Nguyễn Ngọc Lan. 2001. Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) trong chẩn đoán lao. Luận văn tiến sĩ y học, chuyên ngành dịch tể học, Trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Văn Thanh. 2007. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội Nguyễn Việt cồ. 2006. (chủ biên) Bệnh học lao, Nhà xuất bản Y học Hà Nội
Phạm Hùng Vân. 1996. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR), một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử. Tạp chí y học TP Hồ Chí Minh, số đặc biệt :27-35.
Phạm Hùng Vân. 2001. cẩm nang các kỹ thuật PCR và RT-PCR phát hiện M. tuberculosis,
Hepatitis virus B, Hepatitis virus c, Dengue hemorrhagic fever.
Phạm Thành Hổ. 2005. Nhập môn công nghệ sinh học. Nhà xuất bản giáo dục..
Trần Thị Bích Liên, Cao Minh Nga, Đông Thị Hoài An. 2003. Chẩn đoán lao hạch ở bệnh nhân nhiễm HĨV/AĨDS bằng phương pháp PCR áĩạp chí y học TP Hồ Chí Minh. Tập số 7, Phụ bản số 3.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học49 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Trần Văn Sáng. 2000. Sinh học phân tử và miễn dịch học trong bệnh lý hô hấp. Nhà xuất bản y học Hà Nội.
Trần Thị Xô. 2004. Cơ sở di truyền và công nghệ gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
Trịnh Đình Đạt. 2007. Công nghệ sinh học, tập bốn, công nghệ di truyền. Nhà xuất bản giáo dục.
Tiếng Anh
Berenguer J., s. Moreno., F. Laguna., T. Vicente., M. Adrados., A. Ortega., J. Gonzâlez- LaHoz., E. Bouza 1992. Tuberculous meningitis in patients infected with the human immunodeficiency virus. N Engl JMed. ;326(10):668-72.
Boom R., C.J. Sol., M.M.S. Salimans., C.L. Jansen., P.M. Wertheim-van Dillen., Noordaa J van der 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin
Microbiol ; 28(3): 495-503.
Brisson-Noel A., c. Aznar., c. Chureau., s. Nguyen., c. Pierre., M. Bartoli., G. Bonete., G. Pialoux., B. Gicquel., G. Garrigue 1991. Diagnosis of Tuberculosis by DNA amplification in clinical practice evaluation. Lancet.338: 364-366.
Clamdge J.E., R.M.Shawar., T.M Shinnick., B.B. Plikaytis 1993. Large- scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31: 2049-2056.
DeWit D., M. Wooton, B. Allan, and L. Steyn. 1993. Simple method for production of internal control DNA for Mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction assays. J. Clin. Microbiol. 31:2204-2207.
Donnabella V., F. Martiniuk., D. Kinney., M. Bacerdo., s. Bonk., B. Hanna., W.N.Rom. 1994. Isolation of the gene for the beta subunit of RNA polymerase from rifampicin- resistant Mycobacterium tuberculosis and identification of new mutations. Am J Respir
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học50 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Cell Mol Biol. Dec; 11(6):639-43
Eisenach K. D., M. D. Sifford., M. D. Cave., J. H. Bates., and J. T. Crawford. 1991. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction. Am. Rev. Respir. Dis. 144:1160-1163.
Forbes B.A. and E.s. Karen. 1993. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction. J. Clin.
Microbiol. 1688.
Grosset J. 1996. Bacteriological diagnosis of tuberculosis. Rev Prat 46:1337- 43.
Hermans P.W.M., D. Van Soolingen., J. W. Dale., A.R.J. Schuitema., R.A. McAdam.,
D. Catty., and J.D. A. van Embden. 1990. “Insertion element IS 986 from
Mycobacterium tuberculosis a useful tool for diagnosis and epidemiology of
tuberculosis”, J. Clin. Micribiol., 28, pp. 2051-2058.
Imboden P., F. Marchesi., D. Lowrie., S. Cole., M.J. Colston. 1993. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet ; 341:647- 650. Kolk A H J., Paul R. Klatser., Sjoukje Kuijper., Cor W.van Ingen. 1998. Stabilized,
Freeze-Dried PCR Mix for Detection of Mycobacteria. J Clin Microbiol.', 36(6): 1798- 1800.
Kolk A.H.J., A.RJ. Schuitema., S. Kuijper., J. Van Leeuwen., P.W.M. Hermans., J.D.A. Van Embden., R.A.Hartskeerl. 1992. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a non radioactive detection system. J. Clin. Microbiol. 30:2567-2575.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học51 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
Kubica G.P., W.E. Dye., M.L. Cohn M.L.and G. Middlebrook. 1963. Sputum digestion and decontamination with N-Acetyl-l-cysteine sodium hydroxide for culture of bacteria. American Review of Respiratory Diseases 87, 775- 779.
Noordhoek G.T., J.A. Kaan., S. Mulder., H. Wilke., A.H.J. Kolk., G. Bjune., D. Catty., J.W. Dale., P.E.M. Fine. 1994. “Sensitivity and specificity of PCR for detection of
Mycobacterium tuberculosis: a blind comparison study among seven laboratories”, J. Clin. Microbiol., 32, pp. 277-284.
Noordoek G.T., J.A.Kaan., S. Mulder., H. Wilke., and A.H.J. Kolk. 1995. Routine application of the polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium
tuberculosis in clinical samples. J .Clin.Pathol., 48, pp. 810-814.
Samuel Ratnam., A. Florence Stead and Mary Howes. 1987. Simplified Acetylcysteine- Alkali Digestion-Decontamination Procedure for Isolation of Mycobacteria from Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 25 (8): 1428- 1432.
Schluger N. et al. 1994. Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of infections due to Mycobacterium tuberculosis. Chest. Apr; 105 (4): 1116-21.
Thiery D., A. Brisson-Noel., V. Vincent-Levy-Frebault., S. Nguyen., J. Guesdon., B. Gicquel. 1990. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis”, J. Clin. Microbiol. 28: 2668- 2673.
Yuen L.K.W., B.C. Ross., K.M. Jakson., B. Dwyer. 1993. Characterization of
Mycobacterium tuberculosis from Vietnamese patients by Southern blot hybridization. J. Clin. Microbiol. 31: 1615-1618.
Zhang Y., B. Heym., B. Allen., D. Young., S. Cole. 1992. The catalase- peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis Nature;358:591-3.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học52 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT
h tt //www.cimsi.ora.vn/Lao/home.asp h tt //wikipedia.org/wiki/Lao h tt p //www.freepatentonline.com/573 1 150.html PHỤ CHƯƠNG PHÀN I. DANH SÁCH BỆNH NHÂN Bảng 5. Danh
sách bệnh nhân nghi lao ngoài phổi
ST
T Mã số Tên họ bệnh nhân Nam Nữ Tuổi Ngày nhận mẫu