Một số kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn leptospira

Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi Trng i Hc Nụng Lõm Thnh Ph H Chớ Minh B mụn Cụng ngh sinh hc Lp DH06SH Bi tiu lun: MT S K THUT CHN ON VI KHUN LEPTOSPIRA Giỏo viờn hng dn: Sinh viờn thc hin: MSSV: Nguyn Ngc Hi Lý Sn Tựng 06126178 Thnh ph H Chớ M Trang1 of 133 Footer Page Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi LI M U Vi sinh vt l tỏc nhõn c rt nhiu nh khoa hc quan tõm, nghiờn cu khụng ch trc õy, hin ti m cũn c tng lai iu ny cú l l ba lớ do: th nht l s a dng ca vi sinh vt, th hai l nhng li ớch to ln m chỳng mang li cho ngi nhiu lnh vc, v cui cựng chỳng cng l nhng tỏc nhõn gõy nhiu bnh nguy him cho ngi v vt nuụi T xa ngi ó bit s dng vi sinh vt vic lờn men to nhiu mún n cú giỏ tr dinh dng cao, v sau ny cũn phỏt trin chỳng nhiu lnh vc khỏc nh phõn vi sinh, probiotic, x lớ cht thi, Nhng ng dng to ln ca vi sinh vt l khụng th ph nhn, nhiờn, kh nng gõy bnh ca vi sinh vt cng l mt ỏng quan tõm Cỏc tỏc nhõn gõy bnh cú th l vi khun, virus hay kớ sinh trựng, Virus cú l l tỏc nhõn nguy him nht v cỏc tỏc nhõn u li nhng hu qu nht nh cụng tỏc chn nuụi v sc khe ngi Nhiu k thut ó i, phỏt trin v khụng ngng hon thin cú th ỏp ng yờu cu chn oỏn phỏt hin cỏc nhúm vi sinh vt gõy bnh ny Trong lnh vc chn nuụi, cỏc nh khoa hc ó chỳ ý n mt loi xon khun l Leptospira Xon khun ny cú kh nng gõy bnh trờn ng vt v cú th lõy sang ngi Bnh xon khun gõy cũn gi l bnh vng da, nú gõy nh hng n cỏc c quan v cú th gõy sy thai thỳ nuụi Cỏch phũng bnh nht l tiờu hy dch trỏnh lõy nhim Vỡ vy, cn cú cỏc k thut phỏt hin nhanh xon khun ny trỏnh lõy lan gõy thit hi ln Trc õy, cỏch phỏt hin Leptospira l s dng phng phỏp nuụi cy, sau ú k thut Microscopic agglutination test (MAT) i v c s dng rng rói chn oỏn bnh Tip theo ú, khoa hc phỏt trin, cỏc k thut mi i v c hy vng l cú th khc phc c nhc im ca MAT v thay th nú Hai k thut c nhc n nhiu nht l ELISA v khuch i gene PCR Bi tiu lun ny s gii thiu qua v bnh xon khun Leptospira v cỏc k thut nuụi cy, MAT, ELISA v PCR vic chn oỏn Leptospira Trang2 of 133 Footer Page Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi TNG QUAN I Leptospira Phõn loi hc Theo Noguchi, 1917: Gii: Monera Ngnh: Spirochaetes H: Leptospiraceae Ging: Leptospira Cỏc loi gm cú: L alexanderi, L biflexa, L broomii, L borgpetersenii, L fainei, L inadai, L interrogans, L kirschneri, L licerasiae, L meyeri, L weilii, L noguchii, L santarosai, L wolbachii, L kmetyi, L wolffii, L genomospecies 1, L genomospecies 3, L genomospecies 4, L genomospecies Trong s ú, ngi ta phõn thnh cỏc loi gõy bnh, khụng gõy bnh v loi trung gian Cỏc loi gõy bnh Leptospira interrogans Leptospira kirschneri Leptospira noguchii Leptospira alexanderi Leptospira weilii Leptospira genomospecies Leptospira borgpetersenii Leptospira santarosai Leptospira kmetyi Cỏc loi trung gian Leptospira inadai Leptospira fainei Leptospira broomii Leptospira licerasiae Leptospira wolffii Cỏc loi khụng gõy bnh Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachii Leptospira genomospecies Leptospira genomospecies Leptospira genomospecies Trang3 of 133 Footer Page Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi c im sinh vt hc Hỡnh th: rt mnh, ng kớnh 0,1- 0,2àm, di 5- 25àm, di ng mnh Thng nhum theo phng phỏp nhum thm bc Fontana-Tribondeau mi phỏt hin c vi khun, ú vi khun nhỡn thy mnh nh si túc, hai u cong nh múc cõu Di kớnh hin vi in t phúng i khong x 10.000 ln mi thy cỏc vũng xon nh, sỏt Tớnh cht nuụi cy: õy l xon khun nht nuụi cy c iu kin hiu khớ Thng nuụi mụi trng lng cú thờm huyt ng vt (th) ti (sn xut theo Terskich hoc Korthoff); pH 7.2- 7.5; nhit 28-300C v giu oxy Leptospira mc chm, sau 6- 10 ngy mi phỏt trin tt (c im nuụi cy l lm nh mụi trng nh khúi thuc lỏ) Sc khỏng: núi chung cỏc Leptospira cú sc khỏng yu, song cao hn cỏc xon khun khỏc; cht nhanh mụi trng acid Leptospira cú th sng t t, nc ngt v mụi trng mn (sng c hng thỏng) nhng cú ỏnh sỏng mt tri thỡ nhanh cht Cu to khỏng nguyờn: da vo cu trỳc khỏng nguyờn m phõn loi thỡ Leptospira c chia lm 20 nhúm, mi nhúm cú nhiu type huyt Vit Nam thng gp 12 type huyt sau: L australis L ictero- haemorrhagiae L canicola L ponoma L autumnalis L mitis L grippothyphosa L saxkoebing L bataviae L poi L hebdomalis L sejroe Kh nng gõy bnh Leptospira gõy bnh xon khun, gi l Leptospirosis Xon khun cú cỏc loi ng vt (chut, ln, chú, súi, nhớm) Sỳc vt thng khụng cú triu chng bnh Ngi cú th b lõy trc tip qua da b xõy xỏt, qua niờm mc mt mi ming, b phn sinh dc tip xỳc Ngi cng cú th b lõy giỏn tip qua mụi trng (t cỏt, nc, rau ) b nhim xon khun nc tiu sỳc vt thi c im chung ca bnh: cú thng tn gan hay thn v cú bin chng mt, cú th gõy sy thai ng vt v ngi Trang4 of 133 Footer Page Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi Bnh ph bin khp th gii, nhng cú nhiu hn nhng vựng khớ hu núng m, t kim v cú nhiu mt nc Cỏc bnh lớ: 1) Bnh lớ bũ thng L pomona v L grippotyphosa ó thy nhiu vt cú khỏng th c hiu v khụng phỏt bnh lõm sng 2) Bnh lớ L icterohaemorrhagiae Chut l mụi gii truyn bnh; hoc lõy t sang 3) Bnh lớ ln L pomona, v cng L mitis v L icterohaemorrhagiae Bnh ln thng tim n, hoc phỏt di th gim nh 4) Bnh lớ nga L grippotyphosa, L pomona, L canicola 5) Bnh lớ ngi nhiu type nh L icterohaemorrhagiae, L grippotyphosa, L canicola, L pomona gõy (bnh L pomona l tip Leptospira ph bin ln gõy ra) cha bnh thng xuyờn l cỏc loi gm nhm (nh chut), chỳng luụn o thi Leptospira cha bnh khụng thng xuyờn l gia sỳc, trõu bũ, nga, V lõm sng, thy nhng bin lon nng mng nóo, gan, thn, v st cao Leptospira vo c th gõy bnh v din bin qua giai on: - Giai on I: st cao t ngt sau thi gian bnh 1-2 tun, ú mỏu cú nhiu vi khun, st thng kộo di t n ngy - Giai on II: st tr li cỏc c quan, nht l gan v thn b tn thng (biu hin trờn lõm sng l vng da, xut hin albumin niu); cú th cú hi chng mng nóo thn kinh trung ng b tn thng; cỏc mao mch dón (cú th xut huyt) v au c Xon khun nm li thn v c o thi theo nc tiu ngoi C ch sinh bnh: Sau xõm nhim, Leptospira mỏu nhõn lờn mnh m v gõy bi huyt sau ú chỳng n nh v nhng c quan a thớch, nht l gan, thn Leptospira giai on bi huyt cú th n c quan sinh dc gõy xỏo trn sinh sn c im bnh Leptospirosis trờn ng vt v ngi Chut l mụi gii truyn bnh chớnh cho cỏc loi ng vt khỏc v ngi, c bit l chut lang Ngoi cú th nhim ngun nc hoc thc n a Bnh Leptospirose trờn (thng xy trờn c) (21) Dng cp tớnh: Bi huyt phỏt trin nhanh sau vi gi nhim, st cao 40-410C v suy nhc nng Cú th chia lm th: Trang5 of 133 Footer Page Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi - Th thng hn: biu hin xut huyt trm trng viờm kt mc mt vi nhng im xut huyt da v niờm mc, mỏu v phõn sm mu cú mỏu, thỳ b mt nc rt nhanh v cht 24 ngy cựng vi gim thp thõn nhit, thng thp hn bỡnh thng - Th hong n : Chú bnh cú biu hin viờm kt mc mt, hong n, vng da khú th tng dn cựng vi kộm n, ma, nu khụng cha tr giai on cui cú s tng cao nhit khú th, hi th hụi Tiờu chy ụi xut huyt v nhng biu hin viờm nóo trc ht hi, thỳ cht khong 5-8 ngy mc bnh Hỡnh Chú b tiờu chy mỏu Th bỏn cp tớnh v tớnh: - Th ny tng ng vi s phỏt trin hi chng sinh urea huyt hu qu ca viờm thn m mt nhng biu hin l chng tiu nhiu, chng khỏt nc rt nhiu cựng vi ma v tiờu chy Sau mt thi gian hụn mờ urea huyt s cht - Th th khú cú mựi urea ming v xỏo trn hụ hp viờm mng múng mt, viờm c b Bnh ln ngh (24) Th ỏ lõm sng: biu hin triu chng lõm sng ớt thy nhng xột nghim huyt hc thỡ ph bin, cú b c n nht l ln v bộo v ln hu b Th cp tớnh: lỳc u ln b n, nm mt ch, st 40 40,5oC, a chy nhng khụng cú triu chng ca vng da hay ỏi mỏu Sau ú xut hin triu chng in hỡnh nng ca vng da, ỏi mỏu, xut huyt v triu chng thn kinh qu na thõn sau, viờm mng nóo, phự u rt nng, t l cht cao Th ri lon sinh sn cho thy ln b sy thai, hay cht lu thai, t l s sinh cht cao cựng vi st, mt sa v vng da ln nỏi Sy thai sau nhim vi khun ngy c Bnh trờn bũ (20) Th cp tớnh: Bũ thng cú v yu v st 40 410C, u oi, bing n, sn lng sa gim t ngt v thng cú xut huyt di niờm mc Lụng thỳ xự xỡ khụng búng mt, mt l , mt Niờm mc, da vng sm v tiu huyt sc t Trong vi trng hp cú viờm khp hoc viờm da hoi t cú viờm nóo, cú th sy thai bũ cỏi Th nh: St khong 39 400C, gim sn lng sa, bing n, vng da, niờm mc, nhp tim tng, nc tiu mu mi mt, mụi, di hm cú hin tng phự thng Con cỏi d b xy thai sau nhim khong thỏng Nu khụng c chm súc tt thỳ cú th cht hin tng thiu mỏu Th tớnh: thng xy ra, ớt thy triu chng, triu chng hay gp l a chy, nc tiu vng hay sm, gõy sy thai thỳ cỏi hoc yu t, non hoc cú th gõy khụng th thai Trang6 of 133 Footer Page Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi Ni cha nhiu vi khun l thn v ng sinh dc (ca c v cỏi) Thỳ bnh th cú th thnh mang trựng sut i, v bi trựng qa nc tiu, dch õm o d Bnh trờn ngi Thụng t ca liờn b y t, b lao ng thng binh v xó hi, tng liờn on lao ng Vit Nam s 29/TT-LB (25/12/1991) ó xp bnh Leptospira ngh nghip gõy c bo him (18) Nhng cụng vic cú th gõy bnh: - Cụng vic cỏc hm m, hm ho, hang h, cng rónh - Cụng vic lũ sỏt sinh, c bit l nhng ngi git, m sỳc vt - Cụng vic cỏc nh mỏy sn xut tht, cỏ hp, ch bin sa v phomỏt - Cụng vic phi tip xỳc vi sỳc vt nh: chn nuụi, thỳ y - Cụng vic cỏc nh mỏy sn xut bia, ru - Cụng vic cỏc hng tht, hng cỏ - Cụng vic vựng m ly, sui, rung, ao h - Cụng vic ngnh lõm nghip: o mng, kờnh, lm thu li Cỏc ngun lõy bnh cho ngi (19) V lõm sng, bnh cú th chia thnh th (23): Th vng da xut huyt: õy l th nng vi cỏc biu hin: st dao ng, da sung huyt, mt ngu, au c nng (ch yu c bp co búp) Cú ban xut huyt tha lng v ngc (vo ngy th hay th 7), thiu mỏu huyt tỏn Vng da v niờm mc Mt s ngi b sng au gan a s ngi tiu ớt hay vụ niu Cú th cú cỏc bin chng: viờm mng nóo dch, suy thn cp, xut huyt ng tiờu húa hoc hụ hp, viờm c tim, ri lon ý thc , b sy thai T l t vong th ny cao t 10% Trang7 of 133 Footer Page Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi Th khụng vng da: L th nh hn vi cỏc biu hin: st dao ng, da sung huyt, mt ngu, au c nng (ch yu c bp chõn, co búp) Mt s ngi cú hch sng, au, khụng núng Hi chng vng da v hi chng gan khụng rừ Th ny khụng cú t vong Phũng v cha bnh Leptospira (19) Phũng bnh: Phũng bnh khụng c hiu bng cỏch ct t dõy chuyn dch t nh dit chut, phũng bnh cho gia sỳc nhng ch yu l phũng h lao ng cho nhng i tng thng phi tip xỳc vi ngun lõy, cỏc i tng nguy c nh cỏc cụng nhõn lm vic ti cỏc tri gia sỳc, cụng nhõn v sinh cu cng, lm vic hm m, Núi chung, cú c hiu qu thỡ cn trin khai nhiu khõu vi s phi hp a ngnh chc nng mi c; Phũng bnh c hiu bng vaccin cht, song ch cho cỏc i tng phi tip xỳc vi ngun lõy Vn phũng bnh da trờn nguyờn tc an ton v sinh lao ng bng cỏc bin phỏp n gin nh mang giy c cao li rung, bựn sỡnh Mang thờm gng tay phi dựng n tay thao tỏc Dit chut, v sinh sch s cht thi ca cỏc loi thỳ nuụi Khụng c s dng nc hoc tm gi ti cỏc vựng nghi ụ nhim Leptospira Cha bnh: S dng khỏng sinh c tr iu tr Leptospira Khỏng sinh cn c iu tr sm, ỳng khỏng sinh nhy cm vi vi khun v ỳng liu lng II Cỏc k thut phỏt hin Leptospira Nuụi cy Leptospira 1) Quy trỡnh thc hin Ly mu: Tu theo tng thi k hoc giai on bnh m cú cỏch ly bnh phm v chn oỏn thớch hp: Giai on I: ly mỏu em nuụi cy hoc tiờm truyn vo chut lang, sau ú xỏc nh v nh danh vi khun Giai on II: Cú th ly nc tiu bnh nhõn, ly tõm, tiờm vo phỳc mc chut lang non ri ly mỏu tim chut nuụi cy tỡm vi khun Nuụi cy (2, 11): Mụi trng: mụi trng Ellinghausen, McCullough, Johnson, and Harris EMJH cú b sung 3% huyt th v 0.1% agarose mt ng 5ml Trang8 of 133 Footer Page Header Lý Page of 133 Sn Tựng GVHD: Nguyn Ngc Hi Tiờm vo ng mụi trng nuụi cy Leptospira: ng nhn git whole blood (mỏu khụng b bin i ngoi tr b sung cht chng ụng t anticoagulant), cũn ng l git Mt mu xột nghim huyt cho phộp vic kho sỏt huyt hc chng li cỏc khỏng th Leptospira Chỳ ý khụng lm lnh mu xột nghim Mu xột nghim phi c thc hin v chuyn xung quanh nhit khong 130C Gi mu qua ờm 20C s git cht Leptospira Nu mụi trng nuụi cy ó c gi lnh cn mụi trng cho ti nhit phũng trc s dng Mu xột nghim trỏnh tip xỳc trc tip vi ỏnh sỏng (tia cc tớm cú th phỏ hy cỏc mụ) 2) Kt qu Mt thớ nghim nhm ti u húa vic nuụi cy Leptospira ó s dng bn loi phng phỏp ly mu khỏc ú l: whole blood, surface plasma (huyt tng b mt), deposit from spun plasma v clotted blood (mỏu ngng ng li) (2) Kt qu thớ nghim cho bi bng sau (2): Kt qu nuụi cy Leptospira ti Leptospira Research Laboratory (26) Kt qu cho thy s dng whole blood cho t l phỏt hin cao (81.3%) Tuy nhiờn, i vi Leptospira mỏu thng ch tn ti 7-15 ngy nờn vic ly mu mỏu tt nht cho nuụi cy l vo khong ngy th nhim bnh Trang9 of 133 Footer Page Header Lý Page 10Tựng of 133 Sn 3) GVHD: Nguyn Ngc Hi Nhn xột u im: thng s dng cụng tỏc nghiờn cu bnh hc phũng thớ nghim Nhc im: Mt thi gian (khong 20 30 ngy nhn kt qu dng tớnh) nhy thp, kh nng thnh cụng khụng cao nuụi cy Sau ngy nhim bnh th 14, him thu c khun lc Cú th gõy nhim cho ngi thớ nghim Thng khụng s dng xột nghim bnh K thut Microscopic agglutination test (MAT) c mụ t bi Galton et al (1965) v c sa i bi Cole et al (1973) K thut MAT l mt phộp kim tra ó c chng minh v chp nhn vic chun oỏn, phỏt hin khỏng th Leptospira huyt ng vt v ngi Hin nay, õy l k thut c s dng thụng dng nht chun oỏn bnh Leptospirosis Nguyờn tc chung: S ngng kt c c trc tip di kớnh hin vi nn ti (3) Quy trỡnh thc hin (c cho bi Cole et al 1973)(4) Thit b chun (microtiter equipment) gm: a vi chun (microtitration plate), a truyn (transfer plates), khay ng a truyn (transfer plate holder), np khay ng (transfer plate lids), a (base plate), dng c lm loóng mu chớnh xỏc n 0.025 ml, vt kớnh Khỏng nguyờn l Leptospira sng (cha 108 Leptospires/ml) c nuụi cy ngy mụi trng nuụi cy thớch hp 1) Hỡnh nh dng c ca k thut MAT (3) Trang10 of 133 Footer Page 10 Header Lý Page 11Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi Hỡnh nh a cha a truyn v vt kớnh kớnh hin vi (3) Mu huyt ly t gia sỳc c pha loóng ban u (1/25) vi phosphate buffer saline (PBS) pH 7.2 trờn a vi chun to thnh dch pha loóng huyt Khong 25àl PBS c t vo tng cỏi ging ca a v mt lng dch pha loóng huyt ng u c cho vo hng u tiờn (qui c l hng A) ca a Dch pha loóng huyt (1/50) c pha loóng dn (2 ln) t hng A n hng H ca a Sau ú, 25àl khỏng nguyờn sng c thờm vo mi ging a c lc nh 15 20s trn u cỏc thnh phn, ri c che li bng np y trỏnh cỏc vt l v ngn s bay hi Sau ú a nhit 320C 370C Kt qu c t a truyn mt git t mi ging trờn vt kớnh kớnh hin vi Phng phỏp thụng dng (Cole et al 1973): Dch pha loóng huyt ca hn hp khỏng nguyờn/ huyt a chun v truyn c chuyn lờn vt kớnh bng pipette (3) Phng phỏp ci tin (Philip L Carter v Terence J Ryan 1975): t cỏc a truyn, a cha mu, vt kớnh lờn a Cỏc git mu chy xuyờn qua a truyn lờn vt kớnh Sau ú, vt kớnh s c ly a , trỏnh lm nghiờng khin cỏc git hũa vo (3) c kt qu di kớnh hin vi (X200), khụ, vi t sỏng l ti (4) 2) Kt qu Kt qu dng tớnh 50% khỏng nguyờn hay hn cú phn ng ngng kt im cui chun xỏc nh bi ging cui cựng m 50% khỏng nguyờn hay hn cú phn ng ngng kt quan sỏt thy (4) S ngng kt phng phỏp thụng thng v phng phỏp ci tin thu c l nh (3) Phng phỏp ci tin c ngh s dng v thay th phng phỏp thụng dng (1975) s dng phng phỏp ny khụng cú s mt mu chy qua cỏc l a chuyn Trong ú, s dng pipette thng cú s rũ r ca mu vỡ khụng hỳt c ton b dch mu (3) Trang11 of 133 Footer Page 11 Header Lý Page 12Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi Darkfield microscopy of leptospiral microscopic agglutination test (This image is in the public domain and thus free of any copyright restrictions Courtesy of the Centers for Disease Control/Mrs M Gatton) (27) 3) Nhn xột õy l k thut ó c s dng t lõu vic chn oỏn Leptospira Nú c dng rng rói nhiu nc (theo Thiermann v Garrett, 1983; Ellis, 1986), c bit l cỏc phũng thớ nghim u im: n gin Tit kim thi gian hn so vi nuụi cy t bo Thớch hp cho kim tra bnh mt nhúm hoc n gia sỳc (ớt nht l 30 hoc 10% s mt n ln) vi nhiu la tui khỏc Nhc im: Vn mt khỏ nhiu thi gian Cn lng mu ln Khụng phõn bit c chun sau tiờm vaccin v chun sau nhim trựng t nhiờn chun l ca cựng mt lng ging Cú th cy cỏc phn ng chộo gia cỏc nhúm huyt ging Vớ d: s nhim trựng bi L balcanica (Mackintosh et al., 1981) v L medanensis cú th to nhng phn ng L hardjo dng tớnh gi K thut indirect Enzyme-Linked-Immunosorbent Serologic Assay (ELISA giỏn tip) õy l k thut c kin ngh thay th cho phng phỏp MAT Ngoi chn oỏn thụng thng, nú cũn cú th thc hin cỏc test nhanh phỏt hin Leptospira Nguyờn tc chung (1): cỏc khỏng nguyờn ó bit c gn lờn cỏc giỏ th, dung dch mu chun v i chng c cho vo cỏc ging, iu kin nhit v thi gian xỏc nh (tựy theo b KIT ca nh sn xut), sau ú mu c v cho tỏc dng vi khỏng khỏng th cú gn enzyme, li mu iu kin nhit v thi gian nht nh, mu v cui cựng c cht tng ng vi enzyme c cho vo mu Phn ng gia enzyme v c cht tng ng nu xy Trang12 of 133 Footer Page 12 Header Lý Page 13Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi s to mu v cng mu t l thun vi lng khỏng th cú mu c hiu vi khỏng nguyờn ó bit 1) Quy trỡnh thc hin Cú nhiu k thut ELISA khỏc c s dng chn oỏn Leptospira õy l quy trỡnh thc hin c a bi WJ Terpstra et al (1980) v El Jalii et al (2002) (4) Phn ng ELISA thc hin trờn mt a vi chun (a ELISA) thng gm 96 ging ng u Khỏng nguyờn s dng ELISA l khỏng nguyờn c trng cho loi (lipopolysaccharide) thu t nuụi cy Leptospira ó un sụi (ó git cht Leptospira) Chun b i chng l mu huyt ó bit dng tớnh (ly t gia sỳc hoc ngi b bnh) v õm tớnh (ly t ngõn hng mỏu) Chun b mu huyt t ng vt hay ngi nghi nhim u tiờn ta ph mt lp khong 100àl khỏng nguyờn (ó c pha loóng khong 1/1600 cht m (buffer) carbonate/bicarbonate pH 9.6) vo cỏc ging, sau ú em 40C qua ờm (cng cú th tin hnh 370C gi) Sau ú tin hnh ln vi buffer cú cha 0.05% Tween 20 PBS pH 7.0 Tip theo, thờm vo cỏc ging 100àl BSA/PBS ngn cỏc kt dớnh khụng c hiu, ri tin hnh gi 370C Sau ln a ELISA, 100àl dung dch mu chn oỏn v i chng ó chun b c thờm vo cỏc ging, 370C gi Ra a ln, v thờm vo 100àl khỏng khỏng th cú gn enzyme (thng l peroxidase) vo tng ging Enzyme cú th gn vi IgG hay IgM PBS Tween 20, sau ú 370C gi Ra a ln, thờm vo 100àl dung dch nn vo mi ging (theo thớ nghim ny l 2,2azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) v hydrogen peroxide cht m citrate pH 4.0) Tin hnh ti nhit phũng 10 phỳt Kt qu c c nh mỏy o quang ph bc súng 405nm 2) Kt qu ELISA cho kt qu dng tớnh mt quang (OD) c c ca mu cao hn mt quang c c ca i chng õm cng vi sai s c bn (4) Cng cú th da vo t s S/P (Sample value related to Positive Control value) c kt qu: S/P = Kt qu: (10) - m tớnh: huyt 0.05, sa 0.03 Nghi ng: 0.05 < huyt 0.12, 0.03 < sa 0.10 Dng tớnh: huyt > 0.12, sa > 0.10 Trang13 of 133 Footer Page 13 Header Lý Page 14Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi Phn ng xy to mu (26) Hin nay, chun oỏn bnh Leptospirosis, ngi ta thng s dng k thut IgM hay IgG ELISA, k thut dot ELISA vi b KIT (Vớ d: b KIT Panbio ca Ustralia cú th s dng cho c k thut ELISA v Dip S TickTM (dot ELISA)) c thit k phự hp ELISA s dng b KIT c ng dng chn oỏn nhanh cỏc bnh Leptospirosis Sau õy l bng kt qu so sỏnh gia ELISA v dot-ELISA s dng b KIT Panbio (7): 3) Nhn xột u im: Phng phỏp bỏn t ng, d thc hin v d theo dừi kt qu Cú th s dng b KIT chun oỏn nhanh, cựng lỳc cú th thc hin c nhiu test trờn mi KIT Cú kh nng phỏt hin sm hn cỏc phng phỏp ó nờu trc ú nhy, c hiu cao (theo bng trờn), chớnh xỏc cng tng i cao S dng khỏng nguyờn ó c git nờn khụng gõy nhim cho ngi quỏ trỡnh thao tỏc Nhc im: Cn thi gian khỏng th xut hin Cú cn thc hin xột nghim ln liờn tip S dng IgM ELISA ch cn xột nghim ln (1) Cú th xy hin tng õm tớnh gi hay dng tớnh gi (1) K thut Polymerase chain reaction (PCR) K thut khuch i gene (PCR) c Kary Mullis (gii Nobel nm 1993) phỏt minh nhng nm 1980 K thut ny cú th xem l mt k thut phũng thớ nghim khỏ n gin (1) Trang14 of 133 Footer Page 14 Header Lý Page 15Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi Nguyờn tc chung (1): c thc hin da trờn c s c im ca s hi tớnh, bin tớnh v kộo di chui DNA iu kin nhit v cht xỳc tỏc thớch hp Giai on 1: bin tớnh chui DNA nhit 950C phỳt Giai on 2: nhõn bn gene vi khong 20 30 chu kỡ Giai on 3: hon thnh 720C 10 phỳt Mi chu kỡ gm bc: bin tớnh DNA (950C 30 giõy n phỳt), bt cp ca on mi vi DNA khuụn mu (30 650C 30 45 giõy), kộo di chui DNA (65 720C phỳt) 1) Quy trỡnh thc hin Tỏch chit DNA: thng t t bo mụ thn, mỏu hay nc tiu ng vt v ngi PCR thc hin vi cp primer (mi) c thit k c bit cho vic phỏt hin DNA Leptospira Hn hp phn ng bao gm Tris-HCl, cỏc loi deoxynucleoside triphosphates (dNTP), primers, DNA mu vi MgCl v DNA polymerase (Taq polymerase) Thi gian thc hin PCR i vi Leptospira thng l 35 chu kỡ Tng thi gian chy PCR thng khong 30 phỳt Sn phm PCR thu c em i din di trờn gel agarose c kt qu in di 2) Kt qu Di õy l mt s hỡnh nh v kt qu in di sn phm PCR: Kt qu PCR t mu nc tiu ca heo (13): L.pomoma L.grippothiphosa L.ballum E.coli B melitensis S aureus L patoc S abortus ovis M bovis 10 L infantum K-no DNA tamplate M-thang 100bp Trang15 of 133 Footer Page 15 Header Lý Page 16Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi Kt qu PCR t mu nc tiu ca ngi (14): L interrogans (i chng dng) v 14 Markers phõn t ỏnh du DIG n 10 Mu nc tiu t ngi bnh 11 n 13 Mu nc tiu ngi khe mnh Kt qu PCR t cỏc mu t kh (23): Thang DNA 100pb Nc tiu Thn Thn (1:10) i chng dng i chng õm Kt qu PCR t tinh dch bũ (15): Marker pGem i chng t bũ khụng nhim i chng t bũ tin nhim Nhim ngy th Nhim ngy th 10 Nhim ngy th 14 Nhim ngy th 21 Nhim ngy th 28 Nhim ngy th 35 10 Nhim ngy th 42 3) Nhn xột Hin nay, phng phỏp PCR c ng dng nhiu lnh vc: chn oỏn, xột nghim, gii mó di truyn, nghiờn cu s tin húa ca sinh vt mc phõn t, K thut PCR c ng dng test nhanh bnh Leptospirosis Nhiu b KIT ó c sn xut phc v tt hn cho k thut ny (Vớ d: Fast DNA Kit t Q BIO GENE (13)) Trang16 of 133 Footer Page 16 Header Lý Page 17Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi u im: n gin, nhanh, nhy, c hiu Chi phớ thp Nhc im: Cú th xy hin tng dng tớnh gi III So sỏnh gia cỏc k thut Bnh Leptospirosis cú nh hng nguy him n ngi v vt nuụi, vỡ vy rt nhiu ngi quan tõm n nú Nhiu nghiờn cu ó c thc hin nhm tỡm phng phỏp tt nht cho vic chn oỏn xon khun Leptospires Cỏc k thut thụng dng hin l k thut MAT, ELISA v PCR K thut MAT ó c a ra, ỏp dng t 1965 v dựng cho n ngy K thut ELISA v PCR i sau MAT v cú nhng u im nht nh vic chn oỏn nhanh Leptospira Hai k thut ny ó c nghiờn cu nhm phỏt trin hon chnh nht thay th cho MAT Gia ELISA v MAT, mt thớ nghim thc hin bi I.M El Jalii (2008) trờn 170 mu huyt bũ ó cho kt qu nh sau (4): 27.7% mu dng tớnh vi MAT, vi ELISA l 56.5% Tt c cỏc mu dng tớnh vi MAT u dng tớnh vi ELISA Khụng cú mu dng tớnh no ca MAT m õm tớnh vi ELISA 28.8% dng tớnh vi ELISA nhng õm tớnh vi MAT Nh vy k thut ELISA nhy hn v phỏt hin c nhúm huyt Leptospira gõy bnh nhiu hn k thut MAT Thớ nghim cụng b nm 1998 ca Eliete C Romero v ctv (8) (mu t dch nóo ty cerebrospinal fluid (CSF) ca 103 bnh nhõn) so sỏnh ba k thut vi nhau, cho kt qu nh sau: Trang17 of 133 Footer Page 17 Header Lý Page 18Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi Nh vy nhy ca PCR cao hn hn cỏc k thut khỏc, nhiờn mt s mu cho kt qu õm tớnh chỳng cú kt qu dng tớnh hai k thut cũn li Cng thớ nghim ny, k thut PCR c kt hp thờm vi lai phõn t (Hybridization) lm tng nhy phỏt hin ca k thut PCR (8) Túm li, k thut PCR nhy hn nhiu so vi k thut MAT v ELISA, v nú cng thun li hn vic chn oỏn nhanh Leptospira, nhiờn MAT, ELISA v nuụi cy t bo cú vai trũ quan trng nghiờn cu phũng thớ nghim Trang18 of 133 Footer Page 18 Header Lý Page 19Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi KT LUN Nh ó trỡnh by trờn, Leptospira l mt loi xon khun gõy bnh gi l Leptospirosis (hay bnh vng da) Ngun lõy bnh cho ngi v vt nuụi ch yu l chut, ngoi thng tip xỳc vi t cỏt hoc ngun nc cú xon khun Cỏch phũng bnh l tiờu hy vt nuụi mang bnh v cú th s dng khỏng sinh thớch hp cha bnh ny Cỏc k thut chn oỏn Leptospira a bi tiu lun ny gm cú nuụi cy, MAT, ELISA v PCR C bn k thut u cú nhng u v nhc im ca nú Nhng nhỡn chung, k thut PCR l cú nhiu u vit hn ba k thut cũn li K thut nuụi cy mt nhiu thi gian vic phỏt hin nhng nú li cú tm quan trng nghiờn cu bnh hc Leptospira K thut MAT ó c s dng rng rói t lõu vi nhy khỏ cao nhng nú khụng cho phộp vic chn oỏn nhanh K thut ELISA v PCR cho phộp chn oỏn nhanh bnh Leptospirosis v cú nhy cao hn hn so vi MAT Trong bn k thut ny thỡ nuụi cy, MAT, ELISA him xỏc nh c mu dng tớnh mu ly t sau ngy 14 ca quỏ trỡnh nhim Ch cú k thut PCR cho kt qu tng i vi cỏc mu ny Tuy nhiờn, ngoi nhng u im vt tri ca mỡnh thỡ PCR cú nhc im l hin tng dng tớnh gi khc phc iu ny cú th s dng cỏc k thut PCR ci tin ó v ang c phỏt trin hin V so sỏnh cỏc k thut thỡ PCR cho kt qu tt nht v nhanh nht Trang19 of 133 Footer Page 19 Header Lý Page 20Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi TI LIU THAM KHO Cụng ngh sinh hc thỳ y Nguyn Ngc Hi, nh xut bn nụng nghip Optimization of Culture of Leptospira from Humans with Leptospirosis - Vanaporn Wuthiekanun v ctv, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, thỏng 4/2007, trang 1363 1365 New Microtechnique for the Leptospiral Microscopic Agglutination Test - Philip L Carter v Terence J Ryan, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, thỏng 8/1975, trang 474 477 Comparison between ELISA and the Microscopic Agglutination Test for the Diagnosis of Bovine Leptospirosis - I.M El Jalii, Revue ẫlev Mộd vột Pays trop., 2008, s 61(2) trang 73-75 Bayesian inference for within-herd prevalence of Leptospira interrogans serovar Hardjo using bulk milk antibody testing - FRASER I LEWIS, GEORGE J GUNN, Biostatistics Advance Access thỏng 7/2009, trang 10 ELISA for the detection of Human Leptospirosis Ana Fuentes v ctv, Mem Inst Oswaldo Cruz, thỏng 9/1994, s 89, trang 365 Leptospirosis: diagnose with confidence Panbio diagnostics, www.panbio.com Detection of Leptospira DNA in Patients with Aseptic Meningitis by PCR - ELIETE C ROMERO, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, thỏng 5/1998, trang 14531455 Two Test Strategy for the Diagnosis of Leptospirosis - Vaishali B Dohe v ctv, Bombay Hospital Journal, Vol 51,(2009) 10 Linnodee Leptospira Hardjo ELISA LINNODEE, www.linnodee.com 11 Handbook for the Collection, Storage and Transport of Pathology Specimens in Rural and Remote Queensland Queensland Health, thỏng 12/2007, mc 9.9 trang 38 39 12 Pcr detection of Leptospira DNA in rodents and insectivores from Tanzania - G.F Mgode v ctv, Belg J Zool, thỏng 12/2005, 135 (phn b sung) : 17-19 13 Polymerase chain reaction method for leptospirosis, analysis on samples from an autochthon swine population in Sicily, Italy - Dr Maria Vitale v ctv, REV CUBANA MED TROP (2005), s 57(1): 25-27 14 Detection of Leptospires in Urine by PCR for Early Diagnosis of Leptospirosis A.E.Bal v ctv, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, thỏng 8/1994, trang 1894-1898 15 A Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Leptospira spp in Bovine Semen - Saad A Masri v ctv, Can J Vet Res (1997), s 61, trang 15-20 16 Application of Polymerase Chain Reaction Assay in detection of Leptospira icterohaemorrhagiae in experimentally infected mice O Sharina v ctv, Journal of animal and veterinary Advances (2007), trang 1197 1198 17 The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue - C Fearnley v ctv, Research in Veterinary Science 85 (2008), trang 816 www.sciencedirect.com 18 THễNG T C A L I ấ N B Y T , B L A O N G - T H N G B I N H V X HI, TNG LIấN ON LAO NG VIT NAM S 29/TT-LB NGY 25 THNG 12 NM 1991 B SUNG MT S BNH NGH NGHIP 19 CN Nguyn Th Liờn Hnh, Ths.Bs Hunh Hng Quang (Tng hp) - http://www.impeqn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066&ID=2240 thỏng 12/2008 Trang20 of 133 Footer Page 20 Header Lý Page 21Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi 20 http://www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=301&detail=16&ucat=43 21 http://www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=315&detail=16&ucat=45 22 Leptospira spp detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) in clinical samples of captive black-capped Capuchin monkey (Cebus apella) - Eliana Scarcelli, Brazilian Journal of Microbiology, thỏng 6/2003 23 http://bsgdvn.com/y-hoc/benh-truyen-nhiem/1349-bnh-do-leptospira-va-cach-dungthuc.html 24 Bỏo NNVN - S ngy 12/3/2009 25 Two Methods for Rapid Serological Diagnosis of Acute Leptospirosis - Paul N Levett v ctv, Clin Diagn Lab Immunol, thỏng 3/2001, s 8(2), trang 349351 26 http://leptolab.ut.ac.ir/en.htm Leptospira Research Laboratory 27 http://open-site.org/viewedit.cgi?cat=&edit_id=68748 Trang web www.google.com.vn vi t khúa: Leptospira, Leptospirosis, ELISA Leptospira, PCR Leptospira, Microscopic agglutination test, Leptospira blood culture tỡm mt s hỡnh nh v bi bỏo cú liờn quan Trang21 of 133 Footer Page 21 Header Lý Page 22Tựng of 133 Sn GVHD: Nguyn Ngc Hi PH LC Trang LI M U TNG QUAN I Leptospira Phõn loi hc c im sinh vt hc Kh nng gõy bnh c im bnh Leptospira trờn ng vt v ngi Phũng v cha bnh Leptospira II Cỏc k thut phỏt hin Leptospira Nuụi cy K thut Microscopic agglutination test (MAT) 11 K thut indirect Enzyme-Linked-Immunosorbent Serologic Assay (ELISA giỏn tip) 13 K thut Polymerase chain reaction (PCR) 15 III So sỏnh gia cỏc k thut 18 KT LUN 20 TI LIU THAM KHO 21 Chỳ thớch: ti liu tham kho c ỏnh s v chỳ thớch sau mi phn trớch dn Trang22 of 133 Footer Page 22 ... bệnh Các kỹ thuật chẩn đoán Leptospira đưa tiểu luận gồm có nuôi cấy, MAT, ELISA PCR Cả bốn kỹ thuật có ưu nhược điểm Nhưng nhìn chung, kỹ thuật PCR có nhiều ưu vi t ba kỹ thuật lại Kỹ thuật nuôi... Leptospires Các kỹ thuật thông dụng kỹ thuật MAT, ELISA PCR Kỹ thuật MAT đưa ra, áp dụng từ 1965 dùng ngày Kỹ thuật ELISA PCR đời sau MAT có ưu điểm định vi c chẩn đoán nhanh Leptospira Hai kỹ thuật ược... gian vi c phát lại có tầm quan trọng nghiên cứu bệnh học Leptospira Kỹ thuật MAT sử dụng rộng rãi từ lâu với độ nhạy cao không cho phép vi c chẩn đoán nhanh Kỹ thuật ELISA PCR cho phép chẩn đoán