Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008

Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

- -

PHẠM THẾ VŨ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT

CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH

TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

- -

PHẠM THẾ VŨ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT

CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH

TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LƯU THỊ KIM THANH

THÁI NGUYÊN - 2009

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác

Tác giả

Phạm Thế Vũ

Lời cảm ơn

Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô: Khoa Sau đại học, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Viện Khoa học – Công nghệ Việt Nam

- TS Lưu Thị Kim Thanh đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ giao đề tài, trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

- Bs Nguyễn Lê Minh giám đốc Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên đã giúp đỡ động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi về tinh thần cũng như vật chất trong quá trình học tập

- NCVC.Ts Nghiêm Ngọc Minh Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn tới :

- Cán bộ khoa xét nghiệm Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên, đặc biệt nhóm cán bộ xét nghiệm vi sinh đã không quản ngày, đêm cũng như các ngày nghỉ giúp đỡ tôi thu thập mẫu bệnh phẩm, phân lập vi khuẩn tả, pha chế các loại môi trường, xử lý sấy hấp dụng cụ

- Các Bác sỹ, kỹ thuật viên khoa lây, khoa xét nghiệm của các bệnh viện trực thuộc tỉnh Thái Nguyên (Bệnh viện Đa khoa Trung Ương, Bệnh viện A, Bệnh viện C, Bệnh viện Gang thép, Trung tâm y tế các huyện thành) đã cùng tham gia thu phập mẫu khi có bệnh nhân nhập viện

Thái nguyên, ngày 30 tháng 9 năm 2009

Tác giả Phạm thế Vũ

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam 4 1.1.1 Tình hình dịch tả trên Thế giới 4

Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.4.2 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 21

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.3.1 Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm 22

2.4.3.2 Các phương pháp chẩn đoán Vibrio cholerrae 24

2.4.3.3 Tiêu chuẩn đánh giá Vibrio cholerrae dương tính trong

nghiên cứu

27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu 29

3.1.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29

3.1.2 Phân bố lấy mẫu bệnh phẩm theo địa điểm lấy mẫu 33

3.2 Đánh giá phương pháp nghiên cứu phát hiện Vibrio cholerae O1

35

3.2.1 Nhận biết vi khuẩn di động bằng kỹ thuật soi tươi 34

3.2.2 Nhận biết hình thể và tính chất bắt maufcuar vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram

37

3.2.3 Phát hiện Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật nuôi cấy 38

3.2.4 Nhận biết Vibio cholerrae bằng phương pháp test nhanh 52

3.2.5 Chẩn đoán Vibio cholerrae bằng kỹ thuật PCR 54

3.3 Đánh giá các kỹ thuật chẩn đoán Vibrio cholerae O1

3.3.1 Kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu 56

3.3.2 Kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram 57

3.3.3 Kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy 58

3.3.4 Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy 58

3.3.5 Phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy 59

3.3.6 Kỹ thuật nuôi cấy với phương pháp PCR 60

3.4 Tổng hợp kết quả các phương pháp và thời gian 61

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CT Cholerae Toxi ( Độc tố tả )

RNA Acid deroxy ribonucleic

DNA Acid deoxy nucleic

E.coli Escherichia coli (Vi khuẩn Ecoli )

KIA Kligler Iron Agar ( Môi trường song đường )

N.A.G Non Aglutinable Vibrios

PCR Polymerase Chain Reaction ( Phát hiện độc tố V.cholerae)

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Môi trường chọn lọc nuôi cấy vi khuẩn tả )

theo giới tính

33

7 Bảng 3.4 Tỷ lên thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu 34 8 Bảng 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính 36 9 Bảng 3.6 Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dưới kính hiển

18 Bảng 3.15 Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đường

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Biểu đồ khu trú vi khuẩn tả ở ruột non 17 2 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập chẩn đoán Vibrio cholerrae O1 24 3 Biểu đồ 3.1 Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu 30 4 Biểu đồ 3.2 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính 32 5 Biểu đồ 3.3 Số mẫu thu thập tại 6 bệnh viện trong quá trình thu

thập mẫu

35

7 Hình 3.4 Hình thể Vibrio cholerrae soi tươi 36 8 Hình 3.5 Hình thể vi khuẩn nhuộm Gram 37 9 Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ dương tính Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật

cholerrae

63

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Dịch tiêu chảy cấp đang có chiều hướng gia tăng ở các địa phương, tính từ 23/10/2007 miền Bắc đã xảy ra ba đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm, số bệnh nhân tiêu chảy cấp đã lên đến 1.335 người, có 136 trường hợp dương tính với phẩy khuẩn tả tại 18 tỉnh / thành phố trong cả nước trong đó có tỉnh Thái Nguyên [13]

Khống chế dịch tả là mục tiêu lớn trong chương trình quốc gia phòng chống bệnh tiêu chảy của Việt Nam Với những thành tựu và kinh nghiệm phòng chống dịch tả trong nhiều năm qua, ngày nay bệnh tả không còn là nỗi khiếp đảm của mỗi người dân, của các tổ chức chính quyền và xã hội Các điều kiện chuẩn mực về kiểm soát môi trường ở nước ta còn lạc hậu Các vấn đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an toàn và vấn đề xử lý vệ sinh chất thải chưa làm được bao nhiêu, nhiều nơi còn bị buông lỏng hoặc quên lãng Trong thời kỳ giao lưu phát triển kinh tế và ngoại giao trong quan hệ hợp tác giữa các nước trong khu vực và toàn cầu ngày càng được mở rộng thì bên cạnh đó là những điều kiện rất dễ bùng phát các vụ dịch nói chung, trong đó có dịch tả nói riêng [30]

Thái Nguyên là tỉnh miền núi phía Bắc tiếp giáp với các tỉnh: Lạng Sơn, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Hà Nội, là cửa ngõ giao lưu Kinh tế - Văn hoá – Xã hội thuận lợi giữa các tỉnh miền núi phía Bắc với đồng bằng Bắc Bộ, là trung tâm đào tạo quan trọng đứng thứ 3 trong cả nước Trường Đại học Thái Nguyên với 6 trường đại học thành viên và trên 20 trường cao đẳng trung học dạy nghề Toàn tỉnh hiện có gần 4000 cơ sở sản xuất kinh doanh và chế biến dịch vụ phục vụ, trong số 1.150 cơ sở sản xuất kinh doanh công nghiệp có hàng ngàn bếp ăn tập thể của công nhân, học sinh, sinh viên… Hội tụ nhiều điều kiện thuận lợi như vậy tuy nhiên vẫn còn rất

nhiều khó khăn nếu không được quản lý chặt chẽ đó sẽ là nguồn lây nhiễm gây ngộ độc thực phẩm hoặc nguồn chứa mầm gây nên bệnh dịch

Thực hiện công điện khẩn của Cục Y tế dự phòng và Môi trường, Bộ y

tế gửi các Trung tâm y tế Dự phòng các tỉnh thành trong cả nước “Tăng

cường giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm trên địa bàn, giám sát chặt chẽ và phát hiện sớm nhất căn nguyên gây tiêu chảy, xử lý khoanh vùng ổ dịch và triển khai điều trị kịp thời, không để bệnh nhân tử vong” [30]

Cần phải báo cáo khẩn cấp khi có ít nhất một ca bệnh (kể cả ca đã xác định hoặc nghi ngờ), dù ở khu vực dịch xâm nhập hay bệnh lưu hành, y tế cơ sở nơi phát hiện phải báo cáo ngay theo chế độ báo cáo khẩn cấp của Bộ Y tế Bệnh nhân mắc bệnh tả nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ bị mất nước và chất điện giải dẫn đến tử vong Bệnh tả lây truyền rất nhanh qua đường tiêu hoá và môi trường (nước, chất nôn, phân, rác ) do vậy việc phát hiện sàng lọc mẫu âm tính ngay tại cơ sở có ý nghĩa hết sức quan trọng, không những giúp đỡ bệnh nhân có ngay phác đồ điều trị mà còn giúp các nhà dịch tễ có hướng xử lý khoanh vùng, chủ động trong phòng chống dịch, không để dịch lây lan rộng trong cộng đồng [4], [6]

Đáp ứng với tình hình thực tiễn kể trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

" Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae

gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008"

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V cholerae )

trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 7 năm 2008

- Đánh giá hiệu quả các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae (soi tươi, nhuộm

soi, test nhanh, nuôi cấy, PCR)

- Lựa chọn những kỹ thuật phù hợp để áp dụng sàng lọc chẩn đoán nhanh

Vibrio cholerae tại labo tuyến huyện khi có dịch tiêu chảy cấp

3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Đề tài nghiên cứu đã đánh giá các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae trên

mẫu phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên - Đáp ứng tính ứng dụng và hiệu quả tại labo tuyến huyện

4 GIỚI HẠN NGHIÊN CỨU

- Thời gian nghiên cứu ngắn nên ứng dụng đánh giá hiệu quả sau phân tích chưa có số liệu đánh giá cụ thể

5 CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN

Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận văn có 3 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam 1.1.1 Tình hình dịch tả trên thế giới

Bệnh tả được cho là xuất hiện cách đây hàng thế kỷ tại đồng bằng sông Hằng của các tiểu lục địa Ấn Độ Thế kỷ thứ XI những đợt dịch tả đã lan tràn tới nhiều vùng trên thế giới từ Nam Á theo con đường buôn bán, hành hương và di tản Trong thời gian có đại dịch, nhiều vụ dịch lớn có tỷ lệ tử vong cao đã xảy ra ở khắp thành thị châu Âu, châu Mỹ Năm 1849, có một cuộc điều tra nổi tiếng của John Snow (Bác sỹ người Anh) đã chứng minh nước là môi trường truyền bệnh tả [48], [51]

Năm 1817 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ Đến đầu thế kỷ 20 đã có 6 "làn sóng bệnh tả" lan khắp thế giới, tiếp đó đến những năm 60 phạm vi "tung hoành" của vi khuẩn tả đã được "khoanh vùng" và cho đến những năm gần đây chủ yếu bệnh xuất hiện ở Đông nam Á Năm 1961 týp "El Tor" gây dịch tại Philippin và tạo "làn sóng thứ bảy" Từ đó trở đi týp vi khuẩn này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần châu Âu [2], [5], [10], [57]

Năm 1883, Robert Koch (nhà vi sinh vật người Đức) phân lập thành công vi khuẩn từ phân của bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng của bệnh này Có tài liệu cho rằng trước đó 30 năm nhà giải phẫu học người Ý đã phát hiện ra phẩy khuẩn là nguyên nhân gây bệnh [43] Các vụ đại dịch đều bắt nguồn từ châu Á, sau đó lan tới các châu lục khác ở nhiều nước, trong nhiều năm Qua các vụ dịch, có một số ghi nhận đáng chú ý về dịch tễ học, sinh bệnh học, điều trị và phòng chống bệnh tả được tóm tắt như sau:

- Vụ đại dịch thứ nhất: Lần đầu tiên ghi nhận bệnh tả xảy ra dưới dạng một đại dịch, vụ đại dịch này bắt đầu vào năm 1817 tại khu vực châu thổ sông Hằng, sau đó lan tới nhiều nước thuộc châu Á vá châu Phi [5]

- Vụ đại dịch thứ hai: Lần đầu tiên bệnh tả gây dịch ở Bắc Mỹ năm 1832 tại khu vực Quebec ( Canada), New York, Philadelphia, Washington Trong vụ đại dịch này, đầu những năm 1930, O’Shaughnessy là người đầu tiên chứng minh phân của bệnh nhân bị bệnh tả có tính kiềm và có nồng độ điện giải rất cao sau phát hiện có ý nghĩa này, Latta đã điều trị thành công một số bệnh nhân tả mất nước nặng bằng phương pháp tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa muối và điện giải [5], [47]

- Vụ đại dịch thứ 3: Dịch tả lan tới nước Anh, tại Luân Đôn, John Snow đã phát hiện rất quan trọng về dịch tễ học là bệnh tả lan truyền theo đường nước sinh hoạt bị ô nhiễm và từ đó đã đề ra biện pháp chống dịch hiệu quả là loại bỏ nguồn nước sinh hoạt không hợp vệ sinh [17], [27], [61]

- Vụ đại dịch thứ 4: Dịch tả hoành hành dữ dội ở New Orleans và các thành phố, thị trấn dọc theo triền sông Missippi, Missouri và Ohio của nước Mỹ [1], [5], [62]

- Vụ đại dịch thứ 5: Dịch tả lan tới vùng trung cận đông, sau đó lan tới Nam Mỹ, gây ra các vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao ở các nước Argentina, Chilê và Peru Tại Ai Cập và Calcutta (Ấn Độ), Robert Koch đã phân lập được vi khuẩn tả từ phân của bệnh nhân bị bệnh tả , chỉ một năm sau khi Koch phân lập được vi khuẩn tả, Ferran là người đầu tiên đã gây miễn dịch dự phòng tả bằng vaccin [12], [45]

- Vụ đại dịch 6: Gây ra các vụ dịch lớn ở vùng Trung Cận Đông và bán đảo Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, ngoài một vụ dịch tả lớn xảy ra ở Ai Cập năm 1961 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả chủ yếu lưu hành ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á và châu Á, trong 6

vụ đại dịch đầu tiên tác nhân gây bệnh là V cholerae O1, typ sinh học cổ điển

do Pacini mô tả đầu tiên phân lập được năm 1854 và được nhà vi trùng học người Đức Robert Koch khảng định lại năm 1883[5], [46], [59]

- Vụ đại dịch thứ 7: Tác nhân gây bệnh là V cholerae O1, týp sinh học El

Tor, do Goschlich lần đầu tiên phân lập được năm 1905 được chia làm 4 giai đoạn sau: Từ năm 1961-1962 dịch tả khu trú ở các đảo thuộc Indonesia và các nước Đông Nam Á, với tổng số 13.393 người mắc, tử vong 1.977 người [49], [55] Năm 1963-1969 chỉ trong thời gian ngắn dịch xuất hiện nhiều nước châu Á: Ấn Độ, Pakistan, Liên Xô cũ, I-Rắc, Việt Nam bắt đầu có dịch tả El Tor vào tháng 1 năm 1964 Giai đoạn tiếp theo từ năm 1970-1990 theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới có 36 nước có dịch tả, điều đáng chú ý là tại Li Băng, Syri chủng gây dịch là El Tor Ogawa, trong khi đó ở các nước liền kề như Ả rập-Xê út, Israel chủng gây dịch lại là El Tor Inaba.Tiếp theo những năm 1991 đến nay điều đáng chú ý ở nước Trung Mỹ và Nam Mỹ 21/23 nước có bệnh tả, năm 1994 châu Mỹ La Tinh chiếm 50% số bệnh nhân tả trên toàn thế giới.Tháng 7/1994 xảy ra một vụ dịch tả thảm khốc tại trại tỵ nạn ở Uganda với 58.057 trường hợp bị bệnh tả, tử vong 23.800 người, năm 1996 số người mắc tả ở châu Phi chiếm 60% tổng số các trường hợp mắc tả trên thế giới [58], [60] Tháng 12 năm 1992 một vụ dịch lớn lại sảy ra ở nước này Vi

khuẩn gây bệnh được xác định là V cholerae O139 "Bengal" Về mặt di

truyền, O139 "Bengal" hình thành từ El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của chúng cũng biến đổi Tất cả mọi lứa tuổi (kể cả trong vùng đã có dịch ) đều có thể bị nhiễm Chủng O139 đã gây bệnh tại ít nhất 11 nước ở Đông nam Á (tính đến năm 2005) Không có số liệu chính xác số người bị bệnh do O139 vì các nước không thông báo cụ thể các trường hợp bệnh do O1 hay O139 riêng rẽ Trong những năm cuối thế kỷ 20 dịch tả ngày càng trở nên nghiêm trọng, bệnh tả xảy ra ở tất cả các châu lục, tập trung chủ yếu ở những nước đang phát triển, mặc dù y học có những hiểu biết đáng kể về sinh bệnh học và điều

trị bệnh tả nhưng tỷ lệ tử vong do bệnh tả vẫn ở mức độ cao, đặc biệt là khu vực châu Phi [3], [8], [53]

Những đặc điểm của týp El Tor giúp nó khẳng định khả năng "tiếp tục gây nguy hiểm" bao gồm: Tỷ lệ nhiễm El Tor thấp hơn nhiều so với tỷ lệ nhiễm týp cổ điển, thời gian mang trùng sau khi bị bệnh do El Tor dài hơn so với trường hợp nhiễm týp cổ điển, El Tor có khả năng tồn tại ngoài môi trường tốt hơn, dài hơn týp cổ điển Chính vì vậy El Tor có khả năng gây dịch tại cả những nơi Týp cổ điển từng "tung hoành" [7], [36], [50]

Tháng 4 năm 1997, dịch bùng phát trong cộng đồng 90 ngàn người tị nạn Ruanđa ở Cộng Hoà Công gô Chỉ trong 22 ngày đầu đã có 1.521 người chết Đa số các trường hợp chết đều do không được can thiệp kịp thời Tại Mỹ, dịch tả xuất hiện vào những năm 1800 sau đó được khống chế do đảm bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt Tuy vậy, giao thông và du lịch tạo điều kiện để bệnh xuất hiện lẻ tẻ Đa số trường hợp do đi du lịch tại các nước Mỹ La tinh, châu Phi, châu Á Một số trường hợp nhiễm bệnh do ăn thức ăn mang về từ các quốc gia còn lưu hành bệnh [44], [52]

Theo Nguyễn Anh Dũng, tính đến năm 1991, đại dịch tả lần thứ 7 đã có 91 nước có dịch [6], đến năm 1992 theo Tổ chức Y tế thế giới đã có ít nhất 98 nước có dịch tả Nhờ những hiểu biết đáng kể về căn nguyên gây bệnh, về điều trị và cơ chế miễn dịch bệnh tả mà tỷ lệ tử vong do tả đã giảm xuống một cách đáng kể chỉ còn 1% - 3% [6]

Phẩy khuẩn V cholerae O1 bao gồm hơn 60 nhóm huyết thanh, nhưng chỉ có một nhóm huyết thanh O1 là gây được bệnh tả, V cholerae O1 lại gồm

2 sinh týp là sinh týp cổ điển và sinh týp El-Tor, mỗi sinh týp lại gồm 2 týp huyết thanh (Ogawa và Inaba) [8], [22]

Sinh týp El-Tor gây nên hầu hết các vụ dịch tả gần đây, tuy vẫn còn nhiều vụ dịch xảy ra ở tiểu lục địa Ấn Độ là do sinh týp cổ điển Sinh týp El-

Tor có thể sống kết hợp với một sinh vật dưới nước, làm cho nước trở thành một kho tàng lưu trữ gây nhiễm [31], [54]

Từ cuối năm 1992, dịch tả do V cholerae O139 đã xuất hiện ở một số

nơi thuộc Đông nam Ấn Độ, sau đó nhanh chóng lan tới Đông Bắc nước này thuộc vịnh Belgan.Tháng 3/1993 dịch lớn sảy ra ở Bangladesh, tiếp đó xuất hiện ở Miama, Trung Quốc (Tân Cương,7/1993), Thailand (8/1993) đến tháng

9 cùng năm đã có nhiều trường hợp mắc tả V cholerae O139 ở Malaysia [34] Người ta đã phân lập được V cholerae non O1 ở các bệnh nhân tiêu chảy

nặng thuộc 2 cộng đồng ở Florida.Tính gây bệnh đường tiêu hoá ở người và sự đồng nhất hoá của những chủng này làm nảy sinh những câu hỏi về sự

tương quan của những chủng V cholerae O1 độc và không độc dọc bờ biển

Gulf của hoa Kỳ [39], [56]

Một đánh giá khảo sát trên tất cả các bệnh viện tư nhân ở Recife cho

kết quả trong 1.435 mẫu chỉ có 1 mẫu dương tính với V chlerae El-Tor Inaba (0.07%), 17 mẫu dương tính (1.2%) gồm V cholerae non O1, V fluvialis, V

fumissii, V parahaemolyticus, V spp và rất ít gặp ở những người có điều

kiện xã hội khá, ngay cả khi dịch đang xảy ra [49]

1.1.2.Tình hình bệnh tả ở Việt Nam

Bệnh tả là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy cấp ở Việt Nam từ hơn một thế kỷ qua với 2 triệu trường hợp mắc bệnh tả được thông báo Năm 1937-1938 dịch tả từ Hồng Kông theo đường biển xâm nhập vào các tỉnh miền Bắc là Hải Phòng, Móng Cái, từ đó dịch lan sang theo đường sắt và đường bộ tới nhiều tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Trung Bộ Số người mắc lên tới 20.678 người, trong đó số chết là 14.992 người, tỷ lệ tử vong tới 70% Bệnh tả Eltor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam năm 1964 với 20.009 người mắc bệnh, trong đó 821 người tử vong Từ đó đến nay, ở miền Trung và miền Nam bệnh tả xảy ra dưới dạng lưu hành, hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả được thông báo Năm 1994 sau hàng chục năm vắng bóng, bệnh tả xuất

hiện lại ở khu vực Tây Nguyên ( các tỉnh Đắc Lắc, Lâm Đồng, Gia Lai ) với 1.459 bệnh nhân mắc bệnh tả được thông báo [5], [11], [16]

Dịch tả hiện nay vẫn là gánh nặng đối với ngành y tế và toàn xã hội năm 1993 dịch xảy ra ở 21 tỉnh với 3.460 người mắc bệnh Năm 1994 dịch xuất hiện ở cả miền Bắc, Trung, Nam và Tây Nguyên với 4.123 trường hợp bị bệnh Năm 1995 có 29 tỉnh, thành phố báo cáo có bệnh nhân mắc tả với 6.088 trường hợp mắc bệnh tả Năm 1996, cả nước có 630 trường hợp mắc bệnh tả ElTor ở 19 tỉnh, thành phố Vài năm gần đây từ 2001-2002 nước ta vẫn có các trường hợp tả xảy ra, tuy nhiên bệnh không bùng phát thành các dịch lớn mà

Tập trung nhiều nhất tại Hà Nội Hà Nội Hà Nội

Ngày kết thúc 06/12/2007 5/2/2008 22/5/2008 (Nguồn số liệu: Cục Y tế Dự phòng và Môi trường Việt Nam)

Nguyễn Phú Quý (1993) đã thông báo về những đặc điểm sinh học của

V cholerae O139 và quy trình kỹ thuật phân lập xác định mầm bệnh với

kháng huyết thanh đặc hiệu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [36]

Kết quả xét nghiệm phân lập được V cholerae El-Tor có sự dao động

lớn giữa các tác giả, thấp nhất là 1,52 % và cao nhất là 45,70 % Phan Đạo và cộng sự cho rằng thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập cao trên 50% [9] Một số tác giả còn đưa ra tỷ lệ phân lập theo nhóm tuổi, tỷ lệ phân lập vi khuẩn tả dương tính ở nhóm tuổi 6-16 tuổi là 15,08 %, 17-50 tuổi là 44,56 %, điều này càng chứng tỏ dưới 50 tuổi có tỷ lệ mắc tả cao [6], [7] Tỷ lệ người lành mang trùng, khi phân lập vi khuẩn tả ở những người lành trong các vụ dịch, các tác giả trong nước cho thấy rất thấp là 1% và cao nhất là 15% [9], [14]

So với nhiều dịch bệnh mới xuất hiện và đang diễn biến phức tạp hiện nay, bệnh tiêu chảy cấp nguy hiểm không phải là bệnh khó kiểm soát, dịch bệnh có thể bùng phát khi có đủ ba mắt xích liên kết với nhau (nguồn bệnh, đường lây, sức cảm thụ), cả 3 mắt xích này đã được xác định rất rõ bởi các nhà dịch tễ học Mặc dù chưa khẳng định được nguyên nhân gây bệnh, nhưng qua số liệu nghiên cứu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, có thể khẳng định vi khuẩn tả xuất phát từ thực phẩm Chưa bao giờ có một vụ dịch nào phức tạp như bây giờ, gần như đồng loạt tất cả các Quận huyện của Hà Nội đều có dịch Trong khi đó các ổ dịch lại không liên quan đến nhau, các bệnh nhân không sống cùng nhau, không ăn cùng nhau [13]

Tại tỉnh Thái Nguyên, sau nhiều năm không xuất hiện bệnh tả, đến

ngày 13/11/2007 có 23 bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp trong đó có 01

bệnh nhân dương tính với V cholerae O1 Dịch bệnh xuất hiện sau khi đã

được phát hiện tại nhiều tỉnh lân cận, hầu hết các trường hợp mắc bệnh là do đến các vùng có dịch ăn uống phải thức ăn nhiễm khuẩn sau đó về địa phương và phát bệnh, tuy vậy dịch đã được khống chế thành công không lan rộng thêm và không truờng hợp nào tử vong

1.2 Căn nguyên gây bệnh

1.2.1 Ổ chứa và nguồn bệnh

Người là ổ chứa vi khuẩn tả quan trọng và cũng là nguồn bệnh, bao gồm người mắc bệnh thể điển hình hoặc các thể nhẹ, không điển hình và người mang mầm bệnh không triệu chứng (còn gọi là người lành mang trùng) Sau vụ dịch tả có một tỷ lệ nhỏ (khoảng 3-5%) bệnh nhân các thể có khả năng mang vi khuẩn tả kéo dài một vài tháng, đôi khi kéo dài hàng năm nếu không được điều trị đặc hiệu đúng quy định Vi khuẩn tả có thể tồn tại lâu dài ở một số loài nhuyễn thể (trai, sò, ngao ) vùng cửa sông hay ven biển Đây là ổ chứa thiên nhiên của vi khuẩn tả ngoài ổ chứa quan trọng là người [15], [24]

1.2.2 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh tả là V cholerae lần đầu tiên được Pacini người Ý

mô tả năm 1854 khi ông tìm thấy rất nhiều vi khuẩn hình cong trong ruột của bệnh nhân bị tả Năm 1883 Robert Koch cũng tìm thấy tác nhân có hình thể tương tự khi ông nghiên cứu bệnh tả ở Ai Cập, ông mô tả vi khuẩn có hình

dấu phẩy và Koch đặt tên là Vibrio comma, tên này được dùng mấy chục năm trước khi người ta đổi tên là V cholerae, để tưởng nhớ ông Pacini, V

cholerae được xác định rất rõ thông qua các tính chất sinh vật, hoá học và sự

đồng nhất của DNA, tuy nhiên chúng không đồng nhất về khả năng gây bệnh, điều này đặc biệt quan trọng vì các chủng gây bệnh mới có khả năng sinh độc

tố ruột và gây dịch Một sự phân biệt đơn giản trong y tế cộng đồng là V

cholerae thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh được độc tố, còn lại tất

cả các nhóm khác thì không có khả năng gây bệnh hoặc rất hiếm khi gây

bệnh V cholerae O1 thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố và

gây thành đại dịch tả, tuy nhiên có một số ít chủng không sinh ra độc tố và không có gen mã hoá độc tố Các chủng ở môi sinh không có khả năng sinh

độc tố và không gây bệnh, ngoại lệ có một só chủng V cholerae O1 phân lập

được ở một số bệnh nhân tiêu chảy hoặc nhiễm trùng ngoài đường tiêu hóa,

V cholerae O1 gồm 3 týp huyết thanh là Inaba, Ogawa và Hikojima và bao

gồm hai sinh týp khác nhau là sinh typ cổ điển và sinh týp El tor [23], [35]

Những năm gần đây, khi các vụ dịch tả do V.cholerae O139 gây ra, việc định danh tất cả các chủng V cholerae đều dựa trên tính chất sinh vật

hoá học, sau đó nếu chủng nào không ngưng kết với O1 thì được gọi là

“Vibrio cholerae - không O1”, sau này được đổi thành Vibrio không gây tả hoặc “nhóm Vibrio không ngưng kết” Hiện nay các nhóm này thuộc các nhóm huyết thanh từ O2 - O138, không có khả năng gây dịch tả Nhóm Vibrio

này đôi khi gây tiêu chảy do liên quan đến ăn hải sản, hoặc các nhiễm trùng ngoài đường tiêu hoá như vết thương

Vụ dịch tả xảy ra vào đầu năm 1993 tại Ấn Độ và Bangladaesh do một

loại Vibrio non O1 gây ra, đó là V cholerae O139 còn gọi là Vibrio Bengal Nhìn chung đây là một chủng lai giữa V cholerae O1 và Vibrio cholerae -

non O1 và điều quan trọng là độc lực của nó là độc tố ruột và kháng nguyên nhung mao đồng điều hoà độc tố, tuy nhiên chủng O139 giống với sinh týp ElTor hơn [38], [41]

Dựa vào độc tính vi khuẩn V cholerae O1 có thể chia thành 2 nhóm

chính theo huyết thanh (serogroups) đó là O1 và O139 Nhóm O1 có hai týp sinh học (biotype) ElTor và cổ điển, El Tor là tên của một trạm y tế ở Ai cập nơi mà týp vi khuẩn này được phát hiện trong đại dịch năm 1907, hiện nay Eltor là thủ phạm chính của các trận dịch tả trên thế giới Mỗi týp sinh học Eltor hay cổ điển có thể chia thành 3 nhóm nhỏ theo huyết thanh là Ogawa, Inaba, Hikojima, mỗi nhóm còn có thể chia thành nhóm nhỏ hơn dựa vào kháng nguyên (antigen) A, B hay C [21], [33], [40]

1.2.3 Phương thức lây truyền

Bệnh tả lây theo đường tiêu hóa, chủ yếu qua ăn uống Vi khuẩn tả xâm nhập vào đường tiêu hóa của người lành từ 2 nguồn chính: Thức ăn, nước

uống ô nhiễm phân có vi khuẩn tả và thức ăn có nguồn gốc thủy hải sản cửa sông, ven biển có chứa các thể tiềm sinh lâu dài của vi khuẩn tả

Bệnh tả lây mạnh nhất ở giai đoạn toàn phát của bệnh Thời gian thải vi khuẩn thường kéo dài khoảng 1 tuần sau khi hết tiêu chảy cấp Một số ít bệnh nhân có thể gây nhiễm sau mắc bệnh nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng do khả năng đào thải vi khuẩn tả từng đợt theo phân Các yếu tố lây truyền vi khuẩn tả là nước, thực phẩm tươi sống, thực phẩm đã qua chế biến, bàn tay, dụng cụ ăn uống, đồ dùng cá nhân và ruồi nhặng bị nhiễm phẩy khuẩn tả Những yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng lan truyền bệnh tả là mật độ dân cư đông đúc, đời sống kinh tế, xã hội và dân trí thấp, điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm không đảm bảo, nguồn nước sinh hoạt khan hiếm, thiếu nhà vệ sinh hợp tiêu chuẩn, vệ sinh môi trường không tốt, thực hành vệ sinh cá nhân kém, khu vực bị lũ lụt và sau lũ lụt [32], [41]

1.2.4 Tính cảm nhiễm

Mọi người đều có thể nhiễm vi khuẩn tả Cơ thể sau khi mắc bệnh tả hoặc nhiễm khuẩn không triệu chứng có miễn dịch đặc hiệu với chủng tả gây nhiễm nhưng thời gian miễn dịch thường ngắn, trung bình 6 tháng, không có

miễn dịch chéo giữa nhóm V cholerae O1 với nhóm O139 Những nhóm

người có nguy cơ cao với tả là những người tiếp xúc gần gũi (cùng ăn, uống, sinh hoạt) với bệnh nhân tả, dân cư tại vùng có tập quán ăn uống không hợp vệ sinh, sử dụng thức ăn đường phố, hải sản chưa chín, nước chưa qua khử trùng, dùng phân tươi trong trồng trọt, khu vực đồng bằng cửa sông, ven biển, vùng bị ngập lụt [31]

1.2.5 Diễn biến bệnh

Thời kỳ ủ bệnh từ vài giờ tới 5 ngày, thường từ 2-3 ngày, thời kỳ khởi phát rất ngắn, bệnh nhân bắt đầu cảm thấy đầy bụng và sôi bụng; tiếp theo đó tiêu chảy, lúc đầu có phân, sau chỉ toàn nước và kiệt sức nhanh chóng Bệnh nhân thường chỉ nôn sau khi đã tiêu chảy nhiều lần, thời kỳ toàn phát thường

có các triệu chứng tiêu chảy liên tục, nhiều lần, phân toàn nước, nước phân lờ lờ đục như nước vo gạo, trong đó có những vẩy màng màu trắng (là mảnh tế bào thượng bì niêm mạc ruột lẫn phẩy khuẩn tả) Bệnh nhân không đau bụng, mót rặn và không có nhày máu mũi Số lần tiêu chảy và số lượng nước mất thay đổi tùy từng trường hợp nặng nhẹ khác nhau như nôn dễ dàng, lúc đầu nôn ra thức ăn, sau chỉ toàn nước trong hoặc vàng nhạt, tiếp theo các triệu chứng khác bệnh nhân không sốt, người mệt lả, có thể bị chuột rút, biểu hiện tình trạng mất nước từ độ I đến độ III như khát nước, da khô, nhăn nheo, hốc hác, mắt trũng, mạch nhanh, huyết áp hạ, có khi không đo được, tiểu tiện ít hoặc vô niệu, chân tay lạnh Ngoài ra bệnh nhân có thể bị rối loạn thăng bằng điện giải như hạ kali máu [5], [19]

1.2.6 Kháng nguyên và cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn

Sự thay đổi tính chất kháng nguyên là yếu tố quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ và độc lực của vi khuẩn Đối với vi khuẩn tả, khả năng gây thành dịch của chủng Bengal nói trên là môt ví dụ minh hoạ Nhiều loại vi khuẩn khác trong môi trường nước cũng có kháng nguyên roi như vi khuẩn tả vì vậy không thể căn cứ vào loại kháng nguyên này để phân biệt Týp huyết thanh phẩy khuẩn đã được phân biệt dựa trên đặc điểm vào kháng nguyên O ( kháng nguyên vỏ) Hầu hết các chủng vi khuẩn tả đều không có độc tính Chủng Bengal gây thành dịch được định danh là O1 Tuy vậy có tới 3 týp sinh học của O1 được gọi tên Ogawa, Inaba và Hikojima Mỗi chủng trong 3 loại này có khả năng thể hiện đặc tính của chủng cổ điển hay của El Tor Chủng Bengal O139 là chủng huyết thanh mới có kháng nguyên O đặc thù Đặc tính kháng nguyên đặc thù của Bengal O139 có thể giúp chúng ta giải thích vì sao cơ thể không có miễn dịch sau khi bị bệnh [5]

Các kháng nguyên vỏ của phẩy khuẩn gồm: Týp Ogawa có kháng nguyên A và B; Týp Inaba có kháng nguyên A và C;

Nội độc tố có mặt trong phẩy khuẩn cũng như trong các vi khuẩn Gram âm khác Chúng ta còn biết ít về cấu trúc lớp vỏ liposaccharide của phẩy khuẩn Tuy nhiên, một số đặc điểm đặc thù của lớp vỏ phẩy khuẩn cũng đã được nghiên cứu Điều quan trọng nhất là sự thay đổi cấu trúc lớp vỏ có thể xảy ra trong cả điều kiện in vitro lẫn in vivo Đây có thể là một nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi của các chủng không có độc lực trong tự nhiên thành chủng cổ điển có khả năng gây thành dịch và ngược lại

Phân nhóm V cholerae O1 là các vi khuẩn gây dịch tả và V cholerae không phải nhóm O1 / không phải O139 ( gọi tắt V cholerae non – O1 / non -

O139) hay nhóm N.A.G ( Non Aglutinable Vibrios ) các phẩy khuẩn không

ngưng kết, gồm các vi khuẩn có tính chất sinh vật hoá học giống V cholerae

nhóm O1, nhưng không ngưng kết với kháng huyết thanh O1, nhóm này có thể gây bệnh nhẹ không thành dịch Đặc điểm chủ yếu của những chủng này là không sản xuất độc tố tả và không liên quan tới dịch tiêu chảy Những chủng này được phân lập tình cờ từ những trường hợp tiêu chảy do ăn tôm cua hoặc từ những nhiễm trùng ngoài ruột khác như: Vết thương, tai, đờm,

nước tiểu, dịch não tuỷ Phẩy khuẩn thuộc nhóm này được tìm thấy ở cửa sông, các nhiễm trùng do các chủng này thường bắt nguồn từ ngoại cảnh,

V cholerae O139 ( chủng Bengal ) lúc đầu, vi khuẩn gây vụ dịch này liên

quan tới vi khuẩn tả non-O1 vì nó không ngưng kết với kháng huyết thanh O1

nhưng triệu chứng lâm sàng rất dữ dội và giống tả Chủng V cholerae O139 được cho là chủng lai của chủng V cholerae O1 và chủng non ( có tính chất sinh vật hoá học giống V.cholerae nhóm O1, nhưng không ngưng kết với

kháng huyết thanh O1) CácVibrio khác: V parahaemolyticus,

V alginolyticus, các Vibrio nhóm F.V parahaemolyticus được coi là một

trong những nguyên nhân quan trọng gây ngộ độc thực phẩm do ăn hải sản sống hoặc chưa được nấu kỹ với các triệu chứng viêm ruột và tiêu chảy cấp

tính [5], [44]

1.2.7 Độc tố của vi khuẩn tả

V cholerae sinh ra rất nhiều sản phẩm ngoại tế bào Đặc điểm tiêu chảy

mất nhiều nước là do độc tố ruột gây ra được gọi là độc tố tả cholerae toxin (CT) Những nghiên cứu trên người tình nguyện cho thấy CT là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tả, tuy nhiên các chủng tả nếu loại bỏ gen mã hoá CT vẫn có thể xảy ra tiêu chảy nhẹ hoặc vừa ở nhiều cá thể Điều này có thể suy ra còn có những yếu tố nào đó hay loại độc tố nào khác ngoài CT Độc tố tả được Robert Koch mô tả từ năm 1884 khi ông cho đó là một chất độc đặc biệt tác động lên tế bào biểu mô ruột Năm 1959 có hai nhà khoa học nghiên cứu độc lập tại Ấn Độ là De và Dutta đã đưa canh khuẩn tả vào ruột thỏ và 10 năm sau Finkelstein và LoSpalluto đã tinh chế được độc tố này cho phép nhiều nhà khoa học nghiên cứu về lĩnh vực cấu trúc, thụ thể bám và cơ chế tác dụng của CT [43]

Cấu trúc độc tố tả bao gồm hai tiểu phần A và B, tiểu phần B có tác dụng bám dính vào thụ thể đặc hiệu của tế bào biểu mô ruột, tiểu phần A có chức năng enzym đặc hiệu có khả năng chui vào tế bào chủ Độc tố CT bao

gồm 5 tiểu phần B và một tiểu phần A, tiểu phần B trưởng thành có 103 acid amin và có trọng lượng phân tử 11.5 KDa, tiểu phần A có trọng lượng phân tử 29 KDa gồm 2 chuỗi polypeptide (A1 có trọng lượng phân tử 23.5.KDa và A2 có trọng lượng phân tử 5.5 Kda), hai tiểu phần nối với nhau bằng cầu disulfit Bản chất miễn dịch học của độc tố tả CT giống hệt độc tố ruột không chịu

nhiệt của E.coli sinh độc tố [5]

Hình 1.1 Biểu đồ khu trú của vi khuẩn trong ruột

tốt Phẩy khuẩn có khả năng kháng tác động của muối mật, xâm nhập qua lớp màng nhầy trên niêm mạc ruột Quá trình xâm nhập được hỗ trợ bởi men tan nhầy và các men phân cắt protein thành các peptide Do khả năng "tự bơi", vi khuẩn có thể chuyển động ngược chiều với nhu động ruột để tiếp cận với niêm mạc ruột nhờ đặc điểm hoá hướng động của chúng

Khả năng gắn kết và cố định vào tế bào niêm mạc có thể được hỗ trợ bởi các "sợi lông" của chúng kết lại thành bó ở một đầu vi khuẩn Các sợi này được gọi là toxin coregulated pili là các sợi phối hợp điều hoà độc tố Biểu hiện các gene của các lông này liên quan đến gene quyết định độc tố của vi khuẩn Chúng ta chưa có hiểu biết đầy đủ về tác động qua lại giữa các toxin coregulated pili với tế bào vật chủ Các thụ quan trên về mặt tế bào tiếp nhận các sợi này cũng chưa được xác định Chuỗi amino acid của coregulated pili

tương tư như N-methylphenylalamine pili của Pseudomonas và Neisseria

Men tan nhầy của phẩy khuẩn giúp chúng phân giải các protein như fibronectin, lactoferrin và phân giải chính độc tố của nó Vai trò của men trong cơ chế gây độc vẫn còn là câu hỏi vì đột biến gene của men này vẫn không làm giảm độc lực của vi khuẩn Có giả thuyết cho rằng men tan nhầy có tác dụng giúp vi khuẩn tách khỏi tế bào chứ không hỗ trợ quá trình gắn kết vì vi khuẩn có xu hướng tách khỏi các tế bào trần để tìm đến những tế bào khác mới [26]

1.2.8 Một số phương pháp phát hiện V cholerae trong phòng thí nghiệm

Phương pháp soi kính hiển nền đen; Phương pháp nuôi cấy;

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang dùng kháng huyết thanh O1;

Phản ứng đồng ngưng kết dùng kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên O1; Phản ứng ELISA dùng hạt nhiễm từ để tìm CT;

Kít chẩn đoán nhanh Cholera Screen;

Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử ( PCR);

Phương pháp Real-time PCR

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 9 năm 2009 Thu thập mẫu nghiên cứu từ những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp nghi ngờ mắc tả tại các khoa lây của 6 bệnh viện trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên

Chẩn đoán xác định V cholerae tại phòng thí nghiệm vi sinh Trung tâm

Y tế Dự phòng Thái Nguyên

Thực hiện kỹ thuật PCR tại phòng vi khuẩn đường ruột Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

2.2 Nguyên liệu nghiên cứu

Gồm các chủng V Cholerae phân lập được từ bệnh nhân trong quá

trình nghiên cứu

Bao gồm các dụng cụ thông thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử (Đèn cồn, tăm bông, que cấy, hộp petri, pipette pasteur, ống nghiệm, pipette man, đầu col các loại, ống eppendorf các cỡ, dung dịch glycerin, nước muối sinh lý, lọ đựng mẫu 100ml vô trùng, găng tay cao su, khẩu trang, túi ninol các loại, hộp bảo quản mẫu, phích lạnh…)

2.3 Hóa chất thiết bị

Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm khi thực hiện luận văn là các sản phẩm của các công ty hóa chất có uy tín trên thế giới và có độ tinh khiết cao

Bảng 2 1 Danh mục một số dụng cụ, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

1 Môi trường Carry-blair Mecrk – Đức 2 Môi trường TCBS Mecrk – Đức 3 Môi trường Thạch kiềm pH 8,5-9,5 Mecrk – Đức 4 Kligler Iron Agar ( KIA) Mecrk – Đức 5 Môi trường mannit - di động Mecrk – Đức 6 Môi trường Ure - Indol Mecrk – Đức 7 Môi trường basikow Mecrk – Đức 8 Thuốc thử Kovacs Mecrk – Đức 9 Kháng huyết thanh đa giá O1, O139 Anh

10 Kháng huyết thanh đơn giá (Ogawa, Inaba) Anh

11 Thuốc nhuộm Gram Mecrk – Đức 12 Kính hiển vi Đức

14 Máy đo pH Mettler – Thụy Sỹ 15 Bộ chạy điện di Đức

16 Máy chụp ảnh gel Mỹ 17 Máy trộn vortex Anh

19 Lò vi sóng Sanyo 20 Máy lắc ổn nhiệt Anh

Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 12.0 với các test thống kê thường dùng trong y tế, gồm: tần xuất, tỷ lệ %, tỷ suất chênh OR, so sánh sự khác nhau giữa các phương pháp bằng test 2

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang: Nhằm đánh giá tình hình dịch tễ liên quan đến yếu tố mắc bệnh của bệnh nhân, mô tả hiện tượng sức khỏe và các yếu tố nguy cơ có liên quan đến sức khỏe đó một cách chính xác để tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm, điều tra cắt ngang sự phân bố tình trạng mắc bệnh tại thời điểm đang xảy ra dịch [37]

- Nghiên cứu thực nghiệm labo để đánh giá tỷ lệ phát hiện V.cholerae O1

đồng thời phân tích đánh giá hiệu quả của các phương pháp nghiên cứu để đưa ra tính ưu việt, phù hợp nhằm áp dụng thực tiễn tại cơ sở [37]

2.4 3.1 Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm * Kỹ thuật lấy mẫu

Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm là một bước quan trọng trong quá trình phân lập và phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường ruột Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm không đúng cách sẽ ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán tác nhân gây bệnh và điều trị, mẫu bệnh phẩm là phân hoặc chất nôn, thức ăn, chất chứa trong ruột non, ruột già sau khi mổ tử thi, và người tiếp xúc với bệnh nhân, mẫu được thu thấp càng sớm càng tốt trước khi điều trị kháng sinh

Mẫu bệnh phẩm là phân phải được lấy càng sớm vì vi khuẩn ở trong phân rất nhiều trong những ngày đầu của bệnh và trước khi bắt đầu điều trị kháng sinh, sau khi lấy cho vào lọ không có chất khử khuẩn hoặc chất tẩy rửa, nút lọ được đậy chặt chống rò rỉ, có thể lấy phân bằng ống thông trực tràng hoặc tăm bông vô trùng, bệnh phẩm cần được giữ nhiệt độ 4o

C - 8oC và đưa ngay đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ, nếu ở ổ dịch xa phòng xét nghiệm, bệnh phẩm cần lấy bằng tăm bông vô trùng sau đó cho vào lọ có

chứa môi trường vận chuyển Carry - Blair và đưa về phòng xét nghiệm sớm trong điều kiện không cần giữ lạnh [4], [20]

Mẫu thực phẩm cần đảm bảo tính đại diện, thu thập mẫu tại nhiều vị trí trên thực phẩm, khối lượng mỗi mẫu khoảng 25 gam, mẫu được chuyển về phòng xét nghiệm sớm Mẫu nước thu thập có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm, chọn nhiều vị trí mẫu khác nhau, tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu thập, lấy nước vào bình thuỷ tinh vô trùng 500-1000ml, nếu lấy ở sông cần chọn nơi nước chảy giữa dòng độ sâu 20-30 cm

Giám sát người lành mang trùng trong một vụ dịch tả, tất cả những người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tả đều được coi là có thể mang mầm bệnh và vì vậy cần được theo dõi sức khỏe liên tục trong vòng 5 ngày kể từ lần tiếp xúc cuối cùng, để kịp thời phát hiện ca bệnh mới Với những người tiếp xúc ở đầu vụ dịch cần được lấy phân xét nghiệm tìm vi khuẩn tả Những người tiếp xúc gần và người lành mang vi khuẩn tả (phát hiện qua xét nghiệm phân) phải được điều trị dự phòng bằng kháng sinh Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh được lấy 2 lần trong giai đoạn cấp tính và giai đoạn hồi phục

* Bảo quản bệnh phẩm

Cần được giữ vào môi trường bảo quản và vận chuyển khi ở xa phòng xét nghiệm và bệnh phẩm không được làm xét nghiệm sau 2 giờ (tính từ khi thu thập mẫu) Môi trường vận chuyển Carry-Blair là môi trường tốt nhất để bảo quản và vận chuyển, có thể dùng dung dịch đệm glyxerin, môi trường vận chuyển đã thu thập mẫu được chuyển sớm tới phòng xét nghiệm hoặc giữ ở tủ lạnh 4oC ( nếu chưa được xét nghiệm ngay ) Trong vụ dịch tả nguy hiểm mẫu bệnh phẩm cần được lưu giữ trong hộp sắt kín để tránh lây lan trong quá trình vận chuyển [34]

2.4.3.2 Cỏc phương phỏp chẩn đoỏn V cholerae

Sơ đồ cỏc phương phỏp chẩn đoỏn V cholerae trong phũng thớ nghiệm

[13]

Hỡnh 2.1 Sơ đồ phõn lập chẩn đoỏn V cholerae

TCBS, Thạch Kiềm

C/ 24 giờ

Tính chất sinh hoá

Oxidaza (+)

KIA: Glucoza(+); Lactoza (-); Hơi(-); H2S (-)

Mannit (+); di động (+) Urea (-); Indol (+) LDC: (+)

Saccaroza: (+) Arabinoza:(-) Mannoza: (+)

Ng-ng kết kháng

Đa giá O139

Đơn giá Ogawa Đơn giá Inaba

370C/3-6 giờ

Pepton kiềm Bệnh phẩm

* Kỹ thuật soi tươi trực tiếp

Hòa mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ một giọt lên lam kính, đậy la men, soi tiêu bản trực tiếp bằng kính hiển vi ( Hình 3.4 ) kết quả cho thấy vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường, soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, phẩy khuẩn di động như sao đổi ngôi

Tiến hành soi tươi trực tiếp mẫu phân và chất nôn của bệnh nhân nhằm phát hiện vi khuẩn di động Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen vi khuẩn tả có một lông ở đầu nên khả năng di động rất mạnh như sao đổi ngôi Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi thực hiện các bước như sau:

- Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên Soi tiêu bản trực tiếp trên kinh hiển vi

nếu nghi ngờ V cholerae vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng

từ đầu đến cuối vi trường (tuy nhiên có một số vi khuẩn đường ruột khác cũng di động khi soi tươi trên kính hiển vi)

- Lam kính 2: Nhỏ một giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ một giọt kháng huyết thanh tả đa giá Phương pháp soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi nền đen đã được sử dụng từ lâu, nhưng không được phù hợp với điều kiện của các phòng xét nghiệm tuyến huyện, trên kính hiển vi nền đen phẩy khuẩn tả di động như sao đổi ngôi

Hình 2.2 Hình vẽ lam kính và la men soi tươi bằng kính hiển vi

Lam kính

Lamen

Phương pháp soi tươi trên kính hiển vi nền đen hoặc phản pha dùng để

phát hiện tính di động của V cholerae, đặc biệt khi phân của bệnh nhân chứa

>105 vi khuẩn/gam phân Hơn nữa kỹ thuật này còn dùng kết hợp kháng huyết

thanh V cholerrae để ức chế sự di động trên nền khi soi và chỉ trong vòng từ 3 - 5 phút khoảng 50% vi khuẩn V cholerae bị tụ lại, vì vậy kỹ thuật này có

giá trị để chẩn đoán nhanh trong vùng có dịch, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này tùy thuộc vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên

* Kỹ thuật nhuộm Gram

Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm có tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đó nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút, rửa nước, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o

tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha loãng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khô trong không khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu

Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, có hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, không có vỏ, không sinh nha bào, khi nuôi cấy lâu ngày sẽ có sự thay đổi về hình thể so với ban đầu

* Phương pháp dùng kít nhanh

Dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch, màng nitrocellulose được gắn

với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với V cholerae O1 và O139 thành hai băng

riêng biệt, khi mẫu thử đi qua màng nitrocellulose, Colloidal Gold (chất keo vàng) cặp đôi với kháng thể đơn dòng, cặp đôi này gắn với kháng nguyên của mẫu thử Hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ thấm qua màng nitrocellulose

và gắn với kháng thể kháng V cholerae O1 và O139 và hình thành các băng

màu đỏ

* Kỹ thuật nuôi cấy

Chọn lọc những khuẩn lạc thuần khiết qua các bước cấy chuyển khác nhau do vậy tính chất môi trường nuôi cấy phải có tính chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại phù hợp với loại vi khuẩn kia, phương pháp nuôi cấy được coi là “tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn có mặt hạn chế là thời gian trả lời kết quả khảng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và không phát

hiện được V cholerae nếu bệnh nhân đã dùng thuốc kháng sinh

* Kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction )

Dùng để phát hiện gen ctx, kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các kỹ thuật khác, ngoài ra áp dụng kỹ thuật PCR để tìm độc tố CT trong thực phẩm, PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot Kỹ thuật PCR dựa trên cơ

sở phản ứng mở rộng primer nhờ Taq polymerase để khếch đại in vitro các

nucleic acid đặc trưng PCR cho phép khếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200 – 3000 bp Đoạn DNA được khếch đại ( DNA đích ) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide Taq polymerase là một loại enzyme chịu nhiệt được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxy nucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng [21], [25]

2.4.3.3 Tiêu chuẩn đánh giá V cholerae dương tính trong nghiên cứu

* Soi tươi : Hình thể nhỏ, di động nhanh trên lam kính; * Nhuộm Gram: Gram âm, hình cong dấu phẩy;

+ Trên môi trường thạchTCBS nếu nghi ngờ V cholerae khuẩn lạc màu vàng,

nhỏ, trong, thời gian mọc khuẩn lạc 12 – 24 giờ;

+ Phản ứng Oxidaza : Dương tính khi chuyển màu xanh tím;

+ Sinh vật hoá học: Lên men đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza; + Ngưng kết KHT đa giá và đơn giá;

* Test nhanh : Xuất hiện 2 vạch là vạch chứng và vạch mẫu thử; * Phương pháp PCR dương tính

CHƯƠNG III

Bảng 3.1 Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi

Giới n X ± SD Trung vị min - max Nữ 164 34,2±14,5 34(24-45) 8 - 67