Chẩn đoán virus gumboro (infectiuos bursal disease) bằng kỹ thuật gen

Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH SERMINA CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO (INFECTIUOS BURSAL DISEASE) BẰNG KỸ THUẬT GEN Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực TS Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Thu Thanh MSSV: 06126133 10/2009 Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen I MỤC LỤC II ĐẶT VẤN ĐỀ III TỔNG QUAN……………………………………………………… III.1 Virus Gumboro (IBDV)…………………………………… III.2 Bệnh Gumboro………………………………………………7 III.2.1 Sơ lược túi Fabricius…………………………………8 III.2.2 Lịch sử phát hiện……………………………………… III.2.3 Cơ chế……………………………………………… .9 III.2.4 Triệu chứng…………………………………………… 11 III.2.5 Bệnh tích……………………………………………….11 III.3 Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro………………14 III.3.1 RT-PCR……………………………………………… 14 III.3.2 RFLP………………………………………………… 17 IV KẾT LUẬN………………………………………………… 20 V TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… 20 Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen II ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh học phân tử môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật mức độ phân tử Phạm vi nghiên cứu môn có phần trùng lặp với ngành khác sinh học đặc biệt di truyền học hóa sinh Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác hệ thống cấu trúc khác tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại trình tổng hợp DNA, RNA protein tìm hiểu cách thức điều hòa mối tương tác Kỹ thuật gen ngày có nhiều ứng dụng nông nghiệp y học bảo vệ sức khoẻ người Nguyên lí kỹ thuật gen phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học phân tử kiến thức cần thiết cho nhà sinh học kỹ sư công nghệ sinh học Các thành tựu nghiên cứu gen người, gen lúa, nhân động vật … mở thời kỳ sinh học, giúp người hiểu biết rõ chất nhiều loại bệnh di truyền, bệnh truyền nhiễm, chẩn đoán bệnh sớm, góp phần điều trị có hiệu bảo vệ sức khoẻ người gia súc gia cầm Kỹ thuật gen áp dụng nhiều chẩn đoán virus, cho phép xác định kết vòng 24 Những phương pháp chẩn đoán có ưu điểm như: nhanh chóng, đơn giản, nhạy, xác chi phí thấp… Hiện nay, việc chăn nuôi gia cầm nước ta gặp nhiều khó khăn Nguyên nhân có nhiều dịch bệnh xuất gia cầm gây thiệt hại nặng nề cho nhà chăn nuôi H5N1, bệnh Gumboro… Vì vậy, việc ứng dụng kỹ thuật gen vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh gia cầm tất yếu Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen III TỔNG QUAN III.1 Virus Gumboro (IBDV) Virus Gumboro hay gọi Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) IBDV có dạng hình khối, nhiều góc cạnh, kích thước: 55-65 nm, phân tử khối: 2.10 Dalton (Nick, 1976) IBDV virus dạng trần, vỏ bọc IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn phân thành đoạn riêng biệt, thuộc loài Avibirnavirus họ Birnaviridae (Leong et al., 2000) Quanh nhân vỏ protein (vỏ capsid) Lớp capsid hợp thành 32 capsomer (đơn vị hình thái) Mỗi capsomer tạo loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 VP5 (Viral ProteinVP) Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen IBDV genome chứa hai mạch, A B Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (VP1: 95kDa), người ta cho enzyme RNA polimerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987) Polipeptide diện dạng virus nghỉ tế bào chủ (virion), mang chất protein tự protein liên kết genome (còn gọi VPg) VPg cố định vào đuôi 5’ sợi dương mạch genome (Dobos, 1993; Spies & Muller, 1990) Mạch A lớn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame-ORF) ORF nhỏ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5, không cần thiết cho trình chép virus in vitro lại quan trọng khả gây bệnh virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998) ORF lớn mã hóa cho polyprotein 110 kDa, tự xúc tác phân cắt hình thành loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) VP4 (28 kDa) VP4, loại enzyme protease phân cắt serinelysine (Birghan et al., 2000), tham gia trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999) pVP2 tách thêm RNA dư thừa Carbon cuối để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000) VP2 VP3 protein cấu trúc Trong đó, VP2 chứa vị trí kháng nguyên quan trọng hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993) Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen Về miễn dịch: IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, có loại serotype có khả gây bệnh gia cầm Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà Có khoảng loại kháng nguyên phụ serotype xác định thử nghiệm trung hòa ống nghiệm Những virus thuộc loại kháng nguyên phụ thường biết dạng biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong gà từ 60-100% Có khác kháng nguyên chủng cổ điển biến thể Miễn dịch chéo biến chủng nhỏ (Mc Ferran Cs 1980) Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây Về phương diện miễn dịch, hai serotype khả miễn dịch chéo với Tuy nhiên gà gà tây bị nhiễm chủng virus mà không phát bệnh Sức đề kháng: IBDV có sức đề kháng cao với tác nhân lý, hóa môi trường o Chịu đựng pH từ 2-12 (Benton cs, 1967) Ở 56 C, IBDV tồn o o 5h, 70 C bị tiêu diệt sau 30 phút, -50 C 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf cs, 1967) Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen Trong chất thải, phân, nước tiểu, IBDV giữ nguyên tính gây nhiễm gây bệnh vòng 52 ngày IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform Trong phenol 0.5% o timerosal 1.125% 50 C 1h, formalin 0.5% 6h, chloramin % 10 phút Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, diệt IBDV Chất chứa mầm bệnh: thận túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus Ngoài ra, chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng chứa virus Đường xâm nhiễm: tự nhiên, lây truyền qua đường tiêu hóa phổ biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí quan trọng Trong phòng thí nghiệm, dùng đường mũi mắt Sự lan truyền: Bệnh truyền ngang từ gà ốm sang gà khỏe qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi, Bệnh mang tính phức tạp đường lây lan sức chịu đựng virus môi trường nhiệt độ cao, với số hóa chất sát trùng III.2 Bệnh Gumboro Bệnh Gumboro bệnh cấp tính gà, virus gây bệnh Gumboro (IBDV) phá huỷ túi Fabracius, làm giảm khả miễn dịch gà Animated view of IBDV VP2 fit using 12 modes Mầm bệnh sống hàng tháng chuồng trại, thức ăn, nước uống, phân Lứa tuổi gà mắc bệnh cao – tuần tuổi, gà nhỏ mắc bệnh thể tiềm ẩn, không biểu triệu chứng ảnh hưởng lớn làm ức chế trình sinh miễn dịch Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen III.2.1 Sơ lược túi Fabricius Túi Fabricius quan dạng lympho, nằm gần hậu môn Trong trình phát triển bào thai, xuất sau tuyến ức giống tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô Túi Fabricius quan dạng lympho trung ương, trình biệt hóa túi diễn không bị ảnh hưởng kích thích kháng nguyên từ bên Túi Fabricius nhỏ sớm: gà khoảng tháng thứ (tuổi dậy thì), bắt đầu teo tới tháng 11-12 hẳn Fig Normal size bursa of Fabricius (top left) and abnormally smaller size bursa (top right) Normal proventriculus (lower left) and abnormal proventriculus (lower right) Abnormal proventriculus has thickened lining with viscous white material over glands Chia túi thành đơn vị cấu trúc gọi nang (Foliculum) Mỗi nang gồm có vùng vỏ giàu lympho bào vùng tủy tế bào có chứa tương bào Đây nơi biệt hóa dòng lympho B Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen III.2.2 Lịch sử phát Năm 1962, Cosgrove phát mô tả bệnh mới, xuất thành phố Gumboro, vùng Dalaware Hoa Kỳ Bệnh thường thấy gà với bệnh tích thường gặp chủ yếu thận túi Fabricius Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh biến thể bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) bệnh tích thận tương đối giống Sau này, Winterfield Hitchner chứng minh gà miễn dịch với IB nhiễm bệnh viêm túi Fabricius Cuối năm 1962, Winterfield phân lập từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm gà (bệnh tích túi Fabricius thận) Năm 1986-1987, lần dòng biến thể IBDV công bố Năm 1987, nguy hiểm IBDV lần công bố Belgium The Netherlands Năm 1970, Hitchner đề nghị tên thức cho bệnh Infectious Bursal Disease (IBD) hay gọi Gumboro Virus gây bệnh Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) III.2.3 Cơ chế IBDV công chủ yếu vào mô lympho Tế bào lympho B túi Fabricius bị phá hủy Tế bào lympho T tuyến Thymus bị tổn thương Sau ngày xâm nhập vào thể, thấy xuất biến đổi viêm túi Fabricius Đặc biệt đến ngày 3-4 túi Fabricius, thấy xung huyết, xuất huyết, phù thủng thâm nhiễm tế bào viêm đạt độ cực đại Cùng với phóng virus, thân nhiệt tăng đột ngột; sau đó, gây hoại tử tiến triển nang (Foliculu) túi, phá hủy tất mô lympho cuối sau 5-7 ngày túi teo nhanh Những thay đổi suy thoái phát triển nơi tế bào lympho B hay tụ tập Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen 10 Footer Page 10 of 126 Header Page 11 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen III.2.4 Triệu chứng Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày - Sau nhiễm bệnh gà biểu triệu chứng cắn mổ vào hậu môn nhau, giảm ăn, lông xù, lờ đờ, run rẩy, giảm cân, phân tiêu chảy màu trắng, loãng nhiều chất nhầy sau chuyển sang màu nâu, phân dính đầy xung quanh hậu môn Hình 3.1: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lông Hình 3.2: Gà bệnh tiêu chảy phân loãng trắng III.2.5 Bệnh tích - Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô - Cơ đùi, ngực, cánh xuất huyết đỏ thành vệt thâm đen - Mổ khám túi Fabricicus sưng to, đỏ, có xuất huyết tấm đám, thận sưng nhạt màu Xuất huyết niêm mạc dày tuyến (chổ tiếp giáp mề tiền mề), ruột sưng to có nhiều dịch nhầy bên 11 Footer Page 11 of 126 Header Page 12 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen - Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5,6,7 túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 1/3 trọng lượng ban đầu Hình 3.3: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm Hình 3.4: Cơ đùi xuất huyết thành vệt Hình 3.5: Xuất huyết niêm mạc dày tuyến (chổ tiếp giáp mề tiền mề) 12 Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen 13 Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen III.3 Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro III.3.1 RT-PCR Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép ta xác định IBDV cách nhanh cách phân lập virus Trong số phương pháp sinh học phân tử thường sử dụng để phát gene, phương pháp RT-PCR sử dụng phổ biến Phương pháp phát gene IBDV mà không cần phải tăng sinh môi trường nuôi cấy trước khuyếch đại RT-PCR tiến hành bước: B1: Ly trích acid nucleic từ mẫu nghiên cứu B2: thực phiên mã ngược RNA IBDV thành cDNA B3: khuyếch đại cDNA thu PCR Chọn mồi oligonucleotide trình tự ngắn bổ sung với trình tự nucleotide đặc hiệu virus Những vùng khác gen khuyếch đại phụ thuộc vào định vị từ primer chọn Sự khuyếch đại gen mã hoá protein vỏ bên (protein capsid outer) Ly trích acid nucleic: Trong RNA chuỗi đơn dễ bị phân huỷ enzyme Rnase, gene RNA IBDV chuỗi đôi (dsRNA) kháng phân huỷ enzyme RNase Trong thực tế, tế bào nhiễm (dương tính với IBDV) chứa chủng RNA chuỗi đơn sử dụng mẫu bước RT Sự ly trích RNA tiến hành cách cẩn thận: sử dụng găng tay, tác nhân RNase phòng thí nghiệm nhân tạo RNA IBDV ly trích từ mô nhiễm cách sử dụng vài kit có sẵn Bằng cách khác RNA IBDV ly trích cách bổ sung 1% SDS (sodium dodecyl sulphate) 1mg/ml protein K 700 μl dịch huyền phù virus (như dịch đồng bìu) Ủ ấm khoảng 60 phút 37 C Acid nucleic thu cách sử dụng protocol chuẩn cho việc ly trích phenol/chloroform ( ý: phenol chất độc nên xử lý loại bỏ sau đó) Acid nucleic thu hoạch từ giai đoạn dịch cuối việc kết tủa ethanol giữ nước cất RNase dung dịch đệm bền RNA pha loãng nước nên giữ lạnh nhiệt độ -20 C sử dụng 14 Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen 15 Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen Sự phiên mã ngược ( Reverse transscription) Sử dụng mồi PCR “lower” ( bổ sung với mạch dương gen IBDV) tổng hợp cDNA từ dsRNA IBDV từ RNA chuỗi đơn lấy từ IBDV lấy từ tế bào nhiễm Hỗn hợp RNA IBDV phải biến tính trước chuyển vào hỗn hợp phản ứng RT Thêm 20% (bằng thể tích) dimethylsulphoxide vào dung dịch RNA IBDV giải lạnh Đun nóng khoảng phút 92 C làm lạnh đá; phương pháp khác đun nóng khoảng phút ủ ấm hỗn hợp tức nitơ lỏng Chuyển thể tích hỗn hợp biến tính vào hỗn hợp phản ứng Ủ ấm theo dẫn nhà cung cấp enzyme o Dung dịch cDNA thu sau bước RT nên giữ lạnh < -20 C Việc trì hoãn bước PCR vài tuần sau tổng hợp cDNA nguyên nhân gây kết PCR âm tính giả PCR Enzyme DNA polymerase dùng cho phản ứng PCR thương mại hóa Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR theo hướng dẫn nhà sản xuất Cặp mồi U3/L3 dùng để khuyếch đại gen VP2 thuộc dòng IBDV serotype thiết kế: Upper U3: 5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCATGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3' Lower L3: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAATTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3' Những mồi U3 L3 mồi lai dài 44 nucleotide Chúng bao gồm đầu tận 3’ đặc hiệu IBDV (ở chỗ nghiêng trình tự trên) bắt cặp vị trí nucleotide 657 đến 676 1193 đến 1212 đoạn IBDV Đầu tận đặc hiệu IBDV ghép với đầu tận 5’ không đặc hiệu (loại bôi đen trình tự trên), sản phẩm PCR tinh từ trình khuếch đại với cặp mồi U3/L3 thuận lợi cho giải trình tự Trong mồi U3 L3 có vị trí cắt giới hạn enzyme endonuclease restriction (gạch trình tự trên), kết sản phẩm PCR ứng dụng việc tạo dòng Cặp mồi U3/L3 tạo sản phẩm 743 bp chúng đặc hiệu cho trình tự IBDV khuyếch đại Sau đó, ta tiến hành bước biến tính lần cuối với 35 chu kỳ (mỗi chu kỳ gồm bước biến tính, bước bắt cặp bước kéo dài) Đối 16 Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen với cặp mồi U3/L3, chu kỳ, biến tính 95 C/30 giây bắt cặp 64 C/ 45 giây (nhiệt độ biến tính điều chỉnh thích ứng mồi khác sử dụng) Những thông số bước kéo dài nên thiết lập theo lời dẫn nhà cung cấp Sự phát tiến hành điện di với sản phẩm PCR marker trọng lượng phân tử DNA gel agarose 1% nhuộm với ethidium bromide ( ý: EB độc chất tác nhân gây ung thư Nên xử lý loại bỏ sau đó) Ưu điểm: Phát nhanh, sớm, lượng mẫu dùng để phát đòi hỏi không nhiều Nhược điểm: Ba bước phản ứng PCR phải tiến hành mẫu cDNA (tinh sạch, cDNA pha loãng 10-100 fold) để tránh kết âm tính Mỗi phản ứng PCR phải có phản ứng đối chứng âm dương Việc trì hoãn PCR khoảng vài tuần sau bước RT gây kết PCR âm tính giả IV.4 RFLP Những năm gần đây, kĩ thuật phân tử sử dụng để kiểm tra thay đổi di truyền IBDV tăng nhanh ( Wu cộng sự,1992; Stram cộng sự, 1994; Jackwood Jackwood, 1997; Akin cộng sự, 1998) Kĩ thuật thông dụng cho định dạng IBDV bao gồm phương pháp phân tử để khuếch đại đoạn đặc trưng gen IBDV RT/PCR tiếp sau RFLP (Dybing Jackwood, 1996; Jackwood Niselsen, 1997; Jackwood Sommer, 1997; Ture cộng sự, 1998) Những nghiên cứu phân tích chuỗi nucleotide VP2 giúp ta phân tích gen mã hoá cho nhóm kháng nguyên xác định virus (Schnitzler, 1993) Phân tích RT/PCR-RFLP cho thấy nhạy phương pháp khác bao gồm AC-ELISA Sử dụng RT/PCR RFLP cho phép ta xác định đặc trưng kháng nguyên phụ cho phép phân lập mầm bệnh khác từ virus vaccine (Lin cộng sự, 1993; Liu cộng sự, 1994; Jackwood Jackwood, 1994, 1997; Jackwood Nielsen, 1997) Những enzyme cắt giới hạn khác sử dụng cho RFLP IBDV BstNI EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI NboI, StuI HaeIII, TaqI BspMI, tất sử dụng kết hợp sử dụng riêng rẽ ( Jackwood Jackwood, 1997; Jackwood Neilsen, 1997; 17 Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen Dormitorio cộng sự, 1997; Jackwood Sommer, 1998, 1999; Banda cộng sự, 2001) RFLP thành công việc tìm vùng biến đổi gen VP2 IBDV RNA IBDV sau chiết tách thực phản ứng RTPCR thu sản phẩm 743bp Sản phẩm 743bp gọi 700+RT-PCR Phân tích RT/PCR-RFLP sản phẩm 743 bp diện vùng đa dạng vị trí cắt giới hạn BstNI MboI cách so sánh với kích thước đoạn giới hạn kết (jackwood Sommer, 1997) Giữa chúng, BstNI MboI xuất để cung cấp nhận biết đắn cho phân lập IBDV ( Jackwood Sommer, 1998) Jackwood Sommer (1998) báo cáo vài đáp ứng RFLP đạt sử dụng enzyme BstNI so với enzyme MboI Enzyme BstNI ghi nhận trình tự base sản phẩm RT/PCR Như vậy, khả đạt RFLP BstNI thấp so với MboI đạt BstNI chứa trình tự nhận biết base đoạn sản phẩm RT/PCR 743 bp so với trình tự nhận bíêt base MboI (Jackwood Sommer, 1998) Do lí này, sử dụng MboI phân tích giới hạn để phân tích đa dạng di truyền dòng IBDV phân lập Một lượng sản phẩm 700+RT-PCR phân cắt BstNI lượng khác phân cắt MboI Sau profile RFLP đoạn giới hạn BstNI MboI đuợc xác định khác gel agarose, tốt gel 2.5% agarose Proflie tốt nên xác định cách nhuộm màu gel với thuốc nhuộm SYBR.TM green I Những liệu RFLP đạt phân cắt sản phẩm RT/PCR dòng vaccine dòng phòng thí nghiệm cho biết dòng đặt vào bên nhóm phân tử có liên quan với tính trạng phụ kháng thể nhận biết trước Nhóm chứa đựng dòng biến đổi, nhóm chứa đựng dòng truyền thống, nhóm bao gồm giống Lukert/Edgar Nhóm phân tử chứa đựng giống truyền thống đặc trưng tìm thấy bên nước Mỹ Kết cắt ezyme cắt giới hạn MboI BstNI Enzyme Nhóm virus Đọan cDNA cắt giới hạn MboI 229 &b 234 229 & 403 229 & 362 229 & 362 BstNI 119, 424, 172 119, 424, 172 119, 172, 154, 139 119, 209, 172, 154 18 Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen 229 & 480 229 & 362 119, 424, 172 119, 424, 172 Sau đó, liệu RFLP từ gà nhiễm bệnh đem so sánh với liệu RFLP từ phân loại virus thu thập trước trên1 nhóm gà nhiễm bệnh khác Những phương pháp cho phép không chuẩn đóan diện IBDV gà , mà xác định đặc trưng kiểu kháng nguyên phụ IBVD Có thể xác định virus từ nhóm kháng nguyên phụ 1,2,3,4,5,6 hay nhóm khác Khi sử dụng RT- PCR Elazig, phía đông Thỗ Nhĩ Kỳ, người ta kiểm tra 40 mẫu dương tính với IBVD tổng số 56 mẫu bursa gà thu Sử dụng RFLP với enzyme cắt giới hạn MboI cho 40 mẫu người ta thu kết sau: đọan dài 349 236 tìm thấy 40 mẫu IBDV dương tính đọan 142 tìm thấy 10 mẫu Điều cho thấy độ đồng di truyền tồn chủng virus thấp 19 Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen IV KẾT LUẬN Gumboro, bệnh có tốc độ lây nhiễm cao, có khả gây chết đồng loạt gia cầm Gây thiệt hại nhiều cho ngành kinh tế nông nghiệp gia cầm không nước ta mà toàn giới Ngày nay, với kỹ thuật gen, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro nghiên cứu phát triển rộng rãi Một vài kỹ thuật điển hình sử dụng như: -RT-PCR -RFLP Các kỹ thuật gen giúp chẩn đoán bệnh cách nhanh chóng, với độ nhạy độ xác cao V TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học thú y – Nguyễn Ngọc Hải http://www.ebook.edu.vn http://www.fineprint.com http://vn.myblog.yahoo.com http://thưviênkhoahoc.com http://greengroup.com.vn http://www.gardensnob.com http://www.studentsguide.in http://images.google.com.vn 20 Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen 21 Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 Sermina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen 22 Footer Page 22 of 126  ... Ngày nay, với kỹ thuật gen, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro nghiên cứu phát triển rộng rãi Một vài kỹ thuật điển hình sử dụng như: -RT-PCR -RFLP Các kỹ thuật gen giúp chẩn đoán bệnh cách... Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen 13 Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen III.3 Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro III.3.1... H5N1, bệnh Gumboro Vì vậy, việc ứng dụng kỹ thuật gen vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh gia cầm tất yếu Footer Page of 126 Header Page of 126 Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen III