TIỂU LUẬN:CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO (INFECTIUOS BURSAL DISEASE) BẰNG KỸ THUẬT GEN docx

SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 1 ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH SERMINA CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO (INFECTIUOS BURSAL DISEASE) BẰNG KỸ THUẬT GEN Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Thu Thanh MSSV: 06126133 10/2009 SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 2 I. MỤC LỤC II. ĐẶT VẤN ĐỀ 3 III. TỔNG QUAN……………………………………………………… 4 III.1. Virus Gumboro (IBDV)…………………………………… 7 III.2. Bệnh Gumboro………………………………………………7 III.2.1. Sơ lược về túi Fabricius…………………………………8 III.2.2. Lịch sử phát hiện……………………………………… 9 III.2.3. Cơ chế……………………………………………… 9 III.2.4. Triệu chứng…………………………………………… 11 III.2.5. Bệnh tích……………………………………………….11 III.3. Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro………………14 III.3.1. RT-PCR……………………………………………… 14 III.3.2. RFLP………………………………………………… 17 IV. KẾT LUẬN………………………………………………… 20 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… 20 SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 3 II. ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với các ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Kỹ thuật gen ngày càng có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và y học bảo vệ sức khoẻ con người. Nguyên lí kỹ thuật gen và các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong công nghệ sinh học phân tử là những kiến thức cần thiết cho các nhà sinh học và kỹ sư công nghệ sinh học. Các thành tựu nghiên cứu bộ gen người, bộ gen cây lúa, và nhân bản động vật … đã mở ra một thời kỳ mới trong sinh học, giúp con ng ười hiểu biết rõ bản chất của nhiều loại bệnh di truyền, bệnh truyền nhiễm, chẩn đoán bệnh sớm, góp phần điều trị có hiệu quả và bảo vệ sức khoẻ con người cũng như gia súc và gia cầm. Kỹ thuật gen đã được áp dụng nhiều trong chẩn đoán virus, cho phép xác định kết quả chỉ trong vòng 24 giờ. Những phương pháp chẩn đoán này có những ưu điểm cơ bản như: nhanh chóng, đơn giản, nhạy, chính xác và chi phí thấp… Hiện nay, việc chăn nuôi gia cầm ở nước ta đang gặp nhiều khó khăn. Nguyên nhân là do có nhiều dịch bệnh xuất hiện trên gia cầm gây thiệt hại nặng nề cho nhà chăn nuôi như H5N1, bệnh Gumboro… Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật gen vào việc chẩn đoán, điều trị b ệnh trên gia cầm hiện nay là một tất yếu. SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 4 III. TỔNG QUAN III.1. Virus Gumboro (IBDV)  Virus Gumboro hay còn gọi là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV). IBDV có dạng hình khối, nhiều góc cạnh, kích thước: 55-65 nm, phân tử khối: 2.10 6 Dalton (Nick, 1976). IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài. IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2 đoạn riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et al., 2000). Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid). Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái). Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral ProteinVP). SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 5 IBDV genome chứa hai mạch, A và B. Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (VP1: 95kDa), người ta vẫn cho nó là một enzyme RNA polimerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987). Polipeptide này hiện diện dưới dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein tự do và của một protein liên kết genome (còn được gọi là VPg). VPg được cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của 2 mạch trong genome (Dobos, 1993; Spies & Muller, 1990). Mạch A lớn hơn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame-ORF). ORF nhỏ s ẽ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5, không cần thiết cho quá trình sao chép virus in vitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998). ORF lớn hơn mã hóa cho 1 polyprotein 110 kDa, tự xúc tác phân cắt hình thành 3 loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) và VP4 (28 kDa). VP4, một loại enzyme protease phân cắt serine- lysine (Birghan et al., 2000), nó còn tham gia quá trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999). pVP2 sẽ được tách thêm những RNA dư thừa tại những Carbon cuối cùng để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000). VP2 và VP3 là những protein cấu trúc. Trong đó, VP2 chứa nhữ ng vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993). SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 6 Về miễn dịch: IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, nhưng chỉ có loại serotype 1 mới có khả năng gây bệnh trên gia cầm. Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà. Có ít nhất khoảng 6 loại kháng nguyên phụ của serotype 1 được xác định bằng các thử nghiệm trung hòa trong ống nghiệm. Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên phụ này thường được biết dưới dạng những biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong trên gà từ 60-100%. Có sự khác nhau về kháng nguyên giữa các chủng cổ điển và biến thể. Miễn dịch chéo giữa những biến chủng rất nhỏ (Mc Ferran và Cs 1980). Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây. Về phương diện miễn dịch, giữa hai serotype không có khả năng miễn dịch chéo với nhau. Tuy nhiên gà và gà tây có thể bị nhiễm các chủng virus của nhau mà không phát bệnh. Sức đề kháng: IBDV có sức đề kháng cao với các tác nhân lý, hóa và môi trường. Chịu đựng được pH t ừ 2-12 (Benton và cs, 1967). Ở 56 o C, IBDV tồn tại trong 5h, ở 70 o C thì bị tiêu diệt sau 30 phút, ở -50 o C trong 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf và cs, 1967). SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 7 Trong chất thải, phân, nước tiểu, IBDV vẫn giữ nguyên tính gây nhiễm và gây bệnh trong vòng ít nhất là 52 ngày. IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform. Trong phenol 0.5% và timerosal 1.125% ở 50 o C trong 1h, formalin 0.5% trong 6h, chloramin 0.5% trong 10 phút. Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, có thể diệt được IBDV. Chất chứa mầm bệnh: thận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất. Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng cũng chứa virus. Đường xâm nhiễm: trong tự nhiên, lây truyền qua đường tiêu hóa là phổ biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí ít quan trọng. Trong phòng thí nghiệm, có thể dùng đườ ng mũi và mắt. Sự lan truyền: Bệnh có thể truyền ngang từ gà ốm sang gà khỏe qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi, Bệnh mang tính phức tạp trong đường lây lan do sức chịu đựng của virus trong môi trường ở nhiệt độ cao, cũng như với một số hóa chất sát trùng. III.2. Bệnh Gumboro Bệnh Gumboro là bệnh cấp tính của gà, virus gây bệnh Gumboro (IBDV) phá huỷ túi Fabracius, làm giảm khả năng mi ễn dịch của gà. Animated view of IBDV VP2 fit using 12 modes Mầm bệnh có thể sống hàng tháng trong chuồng trại, thức ăn, nước uống, phân Lứa tuổi gà mắc bệnh cao nhất là 3 – 6 tuần tuổi, gà nhỏ hơn có thể mắc bệnh ở thể tiềm ẩn, không biểu hiện triệu chứng nhưng ảnh hưởng rất lớn vì nó làm ức chế quá trình sinh miễn dịch . SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 8 III.2.1. Sơ lược về túi Fabricius Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho, nằm gần hậu môn. Trong quá trình phát triển của bào thai, nó xuất hiện sau tuyến ức và giống như tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô. Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên ngoài. Túi Fabricius nhỏ đi rất sớm: gà khoảng tháng thứ 4 (tuổi dậy thì), nó bắt đầu teo và tới tháng 11-12 thì mất hẳn. Fig. 1. Normal size bursa of Fabricius (top left) and abnormally smaller size bursa (top right). Normal proventriculus (lower left) and abnormal proventriculus (lower right). Abnormal proventriculus has thickened lining with viscous white material over glands. Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum). Mỗi nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn nhưng có chứa tương bào. Đây còn là nơi biệt hóa dòng lympho B. SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 9 III.2.2. Lịch sử phát hiện Năm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới, xuất hiện ở thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ. Bệnh thường thấy trên gà con với bệnh tích thường gặp chủ yếu ở thận và túi Fabricius. Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống nhau. Sau này, Winterfield và Hitchner đ ã chứng minh rằng những con gà đã miễn dịch với IB rồi vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius. Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận). Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công bố. Năm 1987, sự nguy hiểm của IBDV lần đầu tiên được công bố tại Belgium và The Netherlands. Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thứ c cho bệnh này là Infectious Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là Gumboro. Virus gây bệnh là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV). III.2.3. Cơ chế IBDV tấn công chủ yếu vào mô lympho. Tế bào lympho B của túi Fabricius bị phá hủy. Tế bào lympho T của tuyến Thymus bị tổn thương. Sau 2 ngày xâm nhập vào cơ thể, thấy xuất hiện những biến đổi viêm túi Fabricius. Đặc biệt đến ngày 3-4 ở túi Fabricius, thấy xung huyết, xuất huyết, phù thủng và sự thâm nhiễm của các tế bào viêm đạt ở độ cực đại. Cùng với sự phóng virus, thân nhiệt cũng tăng đột ngột; sau đó, gây hoại tử tiến triển ở các nang (Foliculu) của túi, phá hủy tất cả các mô lympho và cuối cùng sau 5-7 ngày túi teo nhanh. Những thay đổi suy thoái phát triển ở những nơi tế bào lympho B hay tụ tập. SeminaChnđoánvirusGumborobngkthutgen 10 [...]... Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen  13  Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen  III.3 Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro III.3.1 RT-PCR Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép ta có thể xác định IBDV một cách nhanh hơn bằng cách phân lập virus Trong số những phương pháp sinh học phân... chủng virus là rất thấp 19  Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen  IV KẾT LUẬN Gumboro, một bệnh có tốc độ lây nhiễm cao, có khả năng gây chết đồng loạt ở gia cầm Gây thiệt hại nhiều cho ngành kinh tế nông nghiệp gia cầm không chỉ ở nước ta mà trên toàn thế giới Ngày nay, cùng với các kỹ thuật gen, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro. .. đoạn dịch cuối cùng bằng việc kết tủa ethanol và được giữ ở trong nước cất không có RNase hoặc dung dịch đệm bền RNA pha loãng nước nên được giữ lạnh ở 0 nhiệt độ dưới -20 C cho đến khi sử dụng 14  Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen  15  Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu... http://www.gardensnob.com http://www.studentsguide.in http://images.google.com.vn 20  Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen  21         Sermina                                                            Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen    22   ... ở nước ta mà trên toàn thế giới Ngày nay, cùng với các kỹ thuật gen, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro đã được nghiên cứu và phát triển rộng rãi Một vài kỹ thuật điển hình đã được sử dụng như: -RT-PCR -RFLP Các kỹ thuật gen này đã giúp chẩn đoán bệnh một cách nhanh chóng, với độ nhạy và độ chính xác cao V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải http://www.ebook.edu.vn... thí nghiệm nhân tạo RNA IBDV có thể được ly trích từ những mô nhiễm bằng cách sử dụng một vài bộ kit có sẵn Bằng cách khác RNA IBDV có thể được ly trích bằng cách bổ sung 1% SDS (sodium dodecyl sulphate) và 1mg/ml protein K đối với 700 μl dịch huyền phù virus (như dịch đồng nhất bìu) Ủ ấm khoảng 0 60 phút ở 37 C Acid nucleic được thu bằng cách sử dụng protocol chuẩn cho việc ly trích phenol/chloroform... thấy bên ngoài nước Mỹ Kết quả cắt của ezyme cắt giới hạn MboI và BstNI Enzyme Nhóm virus 1 2 3 4 Đọan cDNA cắt giới hạn MboI 229 &b 234 229 & 403 229 & 362 229 & 362 BstNI 119, 424, 172 119, 424, 172 119, 172, 154, 139 119, 209, 172, 154 18  Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen  5 6 229 & 480 229 & 362 119, 424, 172 119, 424, 172 Sau... giáp giữa mề và tiền mề), ruột sưng to có nhiều dịch nhầy bên trong 11  Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen  - Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5,6,7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 8 thì chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu Hình 3.3: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm tấm Hình 3.4: Cơ đùi xuất huyết thành từng vệt Hình 3.5:... Semina                                                       Ch n đoán virus Gumboro b ng k  thu t gen  0 với cặp mồi U3/L3, trong một chu kỳ, biến tính ở 95 C/30 giây và bắt cặp ở 0 64 C/ 45 giây (nhiệt độ biến tính được điều chỉnh thích ứng nếu những mồi khác được sử dụng) Những thông số đối với bước kéo dài nên được thiết lập theo lời chỉ dẫn của nhà cung cấp Sự phát hiện có thể được tiến hành bằng điện di với sản phẩm PCR và marker... RFLP Những năm gần đây, những kĩ thuật phân tử được sử dụng để kiểm tra những thay đổi di truyền trên IBDV đã tăng nhanh ( Wu và cộng sự,1992; Stram và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood, 1997; Akin và cộng sự, 1998) Kĩ thuật thông dụng cho định dạng IBDV bao gồm những phương pháp phân tử để khuếch đại những đoạn đặc trưng của bộ gen IBDV bằng RT/PCR tiếp sau đó là bằng RFLP (Dybing và Jackwood, 1996; . SeminaChn đoán virus Gumboro bngkthutgen 1 ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH SERMINA CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO (INFECTIUOS BURSAL DISEASE) BẰNG KỸ. SeminaChn đoán virus Gumboro bngkthutgen 4 III. TỔNG QUAN III.1. Virus Gumboro (IBDV)  Virus Gumboro hay còn gọi là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV). IBDV có. cùng với các kỹ thuật gen, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro đã được nghiên cứu và phát triển rộng rãi. Một vài kỹ thuật điển hình đã đượ c sử dụng như: -RT-PCR -RFLP Các kỹ thuật gen này