TIỂU LUẬN:SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO ( Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) ppt

1    TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH BÁO CÁO TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC VÀ GIA CẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỀ TÀI SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO ( Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) Giáo viên hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ TÚ TRINH MSSV: 06126169 Tháng 10/200 2    I ĐẶT VẤN ĐỀ Lao tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp phổi ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương khớp Hiện lao bệnh nhiễm khuẩn thường gặp nhất, ảnh hưởng đến tỉ người tức 1/3 dân số, với triệu ca năm, gây triệu người tử vong, hầu hết nước phát triển Hầu hết (90%) trường hợp nhiễm khuẩn lao tiềm ẩn không triệu chứng 10% người đời họ tiến triển thành bệnh lao có triệu chứng, khơng điều trị, giết 50% số nạn nhân Lao bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao giới: HIV/AIDS giết triệu người năm, lao giết triệu, sốt rét giết triệu Sự lãng chương trình kiểm sốt lao, bùng phát đại dịch HIV/AIDS việc di dân khiến lao trỗi dậy Các chủng lao kháng đa thuốc (MDR, multiple drug resistant) tăng Năm 1993, Tổ chức Y tế Thế giới tun bố tình trạng khẩn cấp tồn cầu lao Do đó, việc phát điều trị kịp thời bệnh lao quan trọng Hiện nay, vi khuẩn lao phát nhiều phương pháp khác xét nghiệm đờm (nhuộm  Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứng tuberculin hay soi phế quản Tuy nhiên, phương pháp tồn số mặt hạn chế tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết có độ xác khơng cao,… Ngày nay, với phát triển kỹ thuật sinh học phân tử giúp cho q trình chẩn đốn vi khuẩn lao nhanh chóng hiệu Trong phạm vi tiểu luận này, xin đề cập đến việc chẩn đoán vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) kỹ thuật PCR 3    II TỔNG QUAN Bệnh lao 1.1 Vi khuẩn lao 1.1.1 Mycobacterium tuberculosis Hình 1: Mycobacterium tuberculosis Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Phân bộ: Corynebacterineae Họ: Mycobacteriaceae Giống: Mycobacterium Loài: M tuberculosis Mycobacterium tuberculosis (MTB), tác nhân gây bệnh lao, vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn phân chia 16 đến 20 giờ, chậm so với thời gian phân chia tính phút vi khuẩn khác (trong số vi khuẩn phân chia nhanh chủng E coli, phân chia 20 phút) MTB khơng phân loại Gram dương hay Gram âm chúng khơng có đặc tính hố học này, thành tế bào có chứa peptidoglycan Trên mẫu nhuộm Gram, nhuộm Gram dương yếu khơng biểu Trực khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, chịu đựng chất sát khuẩn 4    yếu sống sót trạng thái khơ nhiều tuần điều kiện tự nhiên, phát triển sinh vật ký chủ Trực khuẩn lao xác định kính hiển vi đặc tính nhuộm nó: giữ màu nhuộm sau bị xử lý với dung dịch acid, phân loại "trực khuẩn kháng acid" (acid-fast bacillus, viết tắt AFB) Với kỹ thuật nhuộm thơng thường nhuộm Ziehl-Neelsen, AFB có màu đỏ tươi bật xanh Trực khuẩn kháng acid xem kính hiển vi huỳnh quang phép nhuộm auramine-rhodamine Phức hợp M tuberculosis gồm lồi Mycobacterium khác có khả gây lao: M bovis, M africanum M microti Hai loài đầu gây bệnh lồi thứ khơng gây bệnh người 1.1.2 Mycobacterium bovis Hình 2: Mycobacterium bovis Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Phân bộ: Corynebacterineae Họ: Mycobacteriaceae Giống: Mycobacterium Loài: M bovis Mycobacterium bovis nguyên nhân chủ yếu gây bệnh lao phổi gia súc, gây bệnh cho lồi khác kể người Ở người, M.bovis gây chủng lao ảnh hưởng đến phổi, hạch bạch huyết 5    phận khác thể Vi khuẩn phân chia chậm, từ 16 đến 20 giờ, vi khuẩn hiếu khí Nó có liên hệ với M tuberculosis 1.2 Sức đề kháng vi khuẩn Vi khuẩn có sức đề kháng mạnh chỗ thiếu ánh sáng làm khô Trong phân gia súc, đờm, chỗ tối vi khuẩn sống hàng tháng Ánh sáng mặt trời có khả làm độc lực vi khuẩn sau 1.3 Phương thức lây truyền Các loài động vật máu nóng, máu lạnh, gia súc, thú rừng, người mắc bệnh Có thể xếp thứ tự cảm nhiễm sau: người, bị, gà, heo, chó, mèo, trâu Vi khuẩn xâm nhập vào thể theo đường sau: Đường hơ hấp: phổ biến bị người, mầm bệnh từ thể bị bệnh xuất ngồi qua đường hơ hấp hay qua phân, mầm bệnh có khơng khí, gia sú khỏe hít vào mắc bệnh Đường tiêu hóa: thơng thường qua bú sữa, thức ăn, nước uống có mầm bệnh Ngồi cịn lây lan qua núm nhau, đường sinh dục, đường phối giống 1.4 Triệu chứng Nhóm lao phổi: ho khan, sau to có âm ran, sau ho ướt ho có đờm, vật ốm, đờm lúc đầu lỗng sau đặc dần có mủ máu Thời gian sau rối loạn hô hấp, thở hắt nhiều, niêm mạc mũi xuất huyết, phổi có âm ran ướt Nhóm lao hạch: hạch sưng cứng, bề mặt hạch không trơn, hạch cứng lồi lõm, không di động được, hạch hàm, vai, hạch vú, hạch trước vai bị sưng Nhóm lao vú: chủ yếu bò sữa suất cao, vú sưng, núm vú bi biến dạng, nạch vú sưng to gồ ghề, sản lượng sữa giảm Nhóm lao đường tiêu hóa: gặp, thường gặp ổ lao ruột gan, gia súc tiêu chảy, gầy dần, rối loạn tiêu hóa, niêm mạc đường tiêu hóa bị phá hủy, hạch màng treo ruột bị thối hóa dạng bã đậu 6    1.5 Bệnh tích Có thể nghi ngờ bệnh có bệnh tích casein hóa calci hóa Các hạt lao chủ yếu có phổi, màng treo ruột hạch lamba, xương hay khớp Các bệnh tích lúc đầu gồm hạt nhỏ có casein calci hóa hạch lamba vùng hầu, ngực hạch màng treo ruột sau chúng gồm nhiều hạt to, cứng, màu trắng xám khu vực màng phổi màng bụng (hạt có màu xám), kích thước hạt thay đổi từ đầu đinh ghim tới hạt phỉ Trong thể lao hạt kê, hạt lao có nhiều phổi, gan lách quan khác, chúng thường có màu xám vàng (a) (b) (d) (c) (e) (g) (f) (h) Hình 3: Test dị ứng Tuberculin (a) ; Hạt lao phổi giống ngọc trai màng phổi xoang ngực (b) ; Hạt lao màu vàng trắng gan (c) ; Hạt lao gan (d) ; Các hạch phổi to lên rõ có hạt màu vàng trắng ngà (e) ; Thối hóa dạng bả đậu hạch màng treo ruột (f) ; 7    Tế bào khổng lồ u hạt hạch phổi tế bào kháng axit bào tương (g) ; khuẩn lạc Mycobacterium bovis nuôi cấy tuần 37oC mơi trường Herold (h) Chẩn đốn vi khuẩn lao phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) 2.1 Phương pháp PCR 2.1.1 Định nghĩa Phương pháp PCR phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà khơng qua tạo dịng Phương pháp K.Mullis đưa năm 1985 Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR thực hoàn toàn eppendoff thời gian ngắn ta thu nhận nhiều DNA Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phơi, giải mã di truyền, tạo giống với đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hoá sinh vật mức độ phân tử,… 2.1.2 Nguyên lý Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polymerase hay gọi PCR phản ứng tổng hợp sợi DNA đơn dựa vào sợi DNA đơn khác làm khuôn đoạn oligonucleotide làm mồi Sợi DNA đơn tổng hợp nên có trình tự bổ trợ với sợi khn Các oligonucleotide dùng làm mồi cho enzyme DNA polymerase sợi biến tính phân đoạn DNA lớn dùng làm sợi khuôn Kết tổng hợp sợi DNA bổ trợ cho sợi khuôn bố mẹ Những sợi có đầu 5’ (chính đầu 5’của mồi oligonucleotide), đầu 3’ chưa xác định độ dài Quá trình tổng hợp định hướng theo oligonucleotide sợi DNA nhắc lại sợi kép biến tính (bằng nhiệt) mồi bổ sung phép gắn vào sợi khn (nhờ hạ xuống nhiệt độ thích hợp) Các bước bao gồm: a) biến tính, b) gắn mồi, c) kéo dài mồi tạo chu kỳ phương pháp khuếch đại PCR 8    Sau chu kỳ sợi DNA tổng hợp làm khn chu kỳ Một sợi sợi tổng hợp từ chu kỳ trở có đầu 5’ 3’ xác định vị trí gắn mồi oligonucleotide Sau n chu kỳ, khuếch đại phân đoạn tuân theo quy luật sau: 1) có 1x sợi khuôn ban đầu (sợi kép –dna-), PCR không tái tạo sợi dài sợi khuôn, trừ trường hợp hai mồi nằm tận hai đầu sợi khn 2) Có n sợi đơn loại (-dna dna-) với độ dài không xác định, n số chu kỳ Những phân đoạn có độ dài khơng xác định có đầu giới hạn mồi PCR đầu khơng xác định 3) Có [2n – (n+1)] sợi đơn loại (dna xi ngược) có độ dài xác định hai mồi PCR 2.1.3 Tối ưu hóa PCR Các yếu tố định thành cơng PCR chia thành bốn nhóm chính, là: khuôn (độ tinh nồng độ), mồi thiết kế (tính đặc hiệu, cấu trúc nồng độ), thành phần khác (đệm, MgCl2, phụ gia, polymerase, dNTP), chế độ phản ứng (nhiệt độ thời gian) 2.1.3.1 Khuôn DNA PCR công cụ mạnh để khuếch đại DNA cần khn DNA Nhưng để giảm khả tạo lỗi Taq DNA polymerase, sử dụng nồng độ DNA cao hơn, q nhiều khn tăng hàm lượng thể lẫn tạp giảm hiệu suất Thường hàm lượng khuôn DNA khoảng 0.01-1 ng plasmid DNA phage 0.1-1 µg DNA nhân bào, cho phản ứng tổng thể tích 50 µl Hàm lượng khuôn DNA cao thường tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, độ tin cậy tổng hợp tới hạn, nên dùng hàm lượng khuôn DNA tối đa cho phép với số chu kỳ PCR giới hạn để tăng tỷ lệ sản phẩm PCR đặc hiệu 2.1.3.2 Mồi 9    Mồi phân đoạn nucleotide ngắn bổ trợ cho vùng DNA cần khuếch đại PCR Mồi đặc hiệu chung (universal) với trình tự nucleotide đặc trưng Mồi chung bổ trợ cho nhiều trình tự nucleotide phân tử DNA đặc trưng Do đó, chúng liên kết rộng rãi với nhiều loại khuôn DNA Mồi yếu tố quan trọng định thành công PCR Việc thiết kế mồi đặc hiệu sử dụng nồng độ thích hợp dẫn đến PCR có sản phẩm hay khơng Tính bổ trợ hồn chỉnh 18nt lý tưởng 2.1.3.4 dNTP Nồng độ loại dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) hỗn hợp phản ứng thường 200 µM Một điều quan trọng nồng độ loại dNTP phải Chỉ cần dNTP chênh nồng độ gia tăng mức độ gắn nhầm nucleotide vào sản phẩm PCR, dẫn đến kết trình tự có lỗi sản phẩm biểu thể đột biến Nồng độ nucleotide cần khơng q 50µM lọai, nhiên sản phẩm dài cần nhiều Khi độ tin cậy tối đa quy trình PCR tới hạn, nồng độ dNTP cuối phải 10-50 µM, độ tin cậy tổng hợp DNA tối đa dãy nồng độ Ngoài ra, nồng độ MgCl2 phải chọn nghiêm ngặt, mM tăng lên 0.1mM bước, thu hiệu suất có đủ sản phẩm PCR Nồng độ dNTP sử dụng tới 1.5 mM Do dNTP bắt kẹp ion Mg2+, nên [Mg2+] sử dụng cần thay đổi Tuy nhiên thừa dNTP tăng tỷ lệ lỗi có khả ức chế Taq pol Bởi giảm dNTP (10-50 µM) giảm tỷ lệ lỗi Phân đoạn PCR kích thước lớn cần nhiều dNTP 2.1.3.5 Polymerase Có thể sử dụng Taq DNA polymerase, Tli, Pfu phản ứng PCR Taq pol có tỷ lệ lỗi cao Tli Pfu Tuy nhiên Taq pol lại phức 10    tạp polymerase khác thất bại Người ta sử dụng Taq pol với enzyme khác để tăng độ tin cậy phản ứng Thường 1-1.5 unit Taq DNA polymerase sử dụng hỗn hợp phản ứng 50 µl Hàm lượng Taq pol cao tổng hợp nhiều sản phẩm PCR khơng đặc hiệu Tuy nhiên, chất ức chế có mặt hỗn hợp phản ứng (ví dụ khn DNA sử dụng không tinh cao), hàm lượng Taq pol (2-3 unit) cao cần thiết để thu hiệu suất sản phẩm khuếch đại cao 2.1.3.6 Nồng độ Mg 2+ Nồng độ Mg 2+ ảnh hưởng tới bắt cặp mồi, Tm sợi khuôn, sản phẩm liên kết mồi-khn, tính đặc hiệu sản phẩm, hoạt tính enzyme tính xác [Mg2+] ảnh hưởng tới bắt cặp oligo với khuôn DNA cách bền hóa với khn-mồi Vì tăng bắt cặp không đặc hiệu tổng hợp sản phẩm PCR không mong muốn (cho nhiều băng gel) EDTA kẹp cua Mg 2+ thay đổi [Mg2+] Do ion Mg 2+ taọ phức hợp với dNTP, mồi khn DNA, nồng độ tối thích MgCl2 lựa chọn cho thí nghiệm Quá ion Mg2+ cho hiệu suất thu nhận sản phẩm PCR thấp nhiều ion tăng hiệu suất thu sản phẩm không đặc hiệu tăng gắn nhầm [Mg2+] thấp mong muốn độ tin cậy tổng hợp DNA tới hạn Taq pol cần ion Mg2+ tự Do thành phần dNTP, mồi khuôn, tất tạo cua thu giữ cation, dNTP có nồng độ cao nhất, [Mg2+] phải 0.5-2.5 mM cao nồng độ dNTP 2.1.3.7 Phụ gia Phụ gia chất bổ sung vào PCR nhằm thu sản phẩm PCR mong muốn nhiều Phụ gia thường dùng cho phân đoạn 11    PCR dài, giàu GC dễ hình thành cấu trúc bậc hai Các phụ gia glycerol, formamide, NMP có tác dụng hạ thấp nhiệt độ bắt cặp vài độ giảm biến tính, DMSO giảm hình thành cấu trúc bậc hai 2.1.3.8 Đệm PCR Thường kit thương mại cung cấp đệm pha sẵn Nhưng người ta sử dụng nồng độ đệm PCR tự pha chế cao để nâng cao hiệu suất Đệm bao gồm thành phần: 16.6 mM ammonium sulfate, 67.7 mM Tris-HCl, pH 8.9, 10 mM β-mercaptoethanol, 170 µg/ml BSA, 1.5-3 mM MgCl2 Đệm PCR kit thường chứa thành phần: 10-50 mM TrisHCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 cao hơn, 100 µg/ml gelatin BSA, và/hoặc 0.05-0.1% chất tẩy rửa không ion Tween-20 Nonidet P-40 Triton X-100 Nồng độ muối KCl NaCl cao 50 mM ức chế Taq pol, lại cần thiết để tạo điều kiện dễ dàng bắt cặp mồi Một số enzyme không cần bổ sung protein, số khác lại phụ thuộc vào Một số enzyme hoạt động tốt với có mặt chất tẩy rửa, có lẽ ngăn cản xu hướng tự nhiên enzyme liên kết với 2.1.4 Chu trình nhiệt 2.1.4.1 Biến tính Thường biến tính 0.5-2 phút 94-95oC đủ, sản phẩm PCR tổng hợp chu kỳ khuếch đại thứ ngắn đáng kể so với khuôn DNA ban đầu biến tính hồn tồn điều kiện Nếu DNA khuếch đại có hàm lượng GC cao, thời gian biến tính tăng lên 3-4 phút 2.1.4.2 Gắn mồi 12    Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích thấp 5oC so với nhiệt độ nóng chảy sợi kép mồi-khn DNA Thời gian gắn mồi kéo dài 0.5-2 phút đủ Tuy nhiên, sản phẩm PCR khơng đặc hiệu thu ngồi sản phẩm mong đợi, nhiệt độ bắt cặp phải tối ưu cách tăng bước 1-2oC 2.1.4.3 Kéo dài Thường bước kéo dài mồi (tổng hợp) thực 70-75oC Tốc độ tổng hợp DNA Taq DNA polymerase đạt cao nhiệt độ Thời gian tổng hợp phân đoạn PCR dài kb đề xuất phút Khi khuếch đại phân đoạn PCR dài hơn, thời gian tổng hợp tăng lên phút cho kb 2.2 Chẩn đoán vi khuẩn lao PCR 2.2.1 Chẩn đoán nhanh Mycobacterium tuberculosis PCR Với tác động ngày tăng bệnh lao xuất chủng Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao phổi có ý nghĩa quan trọng sức khỏe cộng đồng Ở nước phát triển, tác động cao bệnh lao không liên quan đến bệnh AIDS tình trạng vơ gia cư mà cịn liên quan đến tuổi dân số Mặc dù phổi quan chịu ảnh hưởng trực tiếp, dạng bệnh bị nhiễm phải hay bệnh phổi thường xuyên, phát đến khoảng 77% bệnh nhân bị nhiễm HIV 24% bệnh nhân khơng nhiễm HIV Sự có mặt vi khuẩn lao máu biết đến 50 năm; nhiên, người ta nhận thấy xảy thường xuyên có đại dịch AIDS Ở thập kỷ trước, nuôi cấy môi trường máu trở thành cơng cụ có ích cho việc phát M tuberculosis vi khuẩn lao khác bệnh nhân bị nhiễm HIV, đặc biệt bệnh nhân có hàm lượng tế bào CD4 thấp Mặc dù kinh nghiệm từ bệnh nhân AIDS, thông tin lợi ích chẩn đốn ni cấy môi trường máu bệnh nhân không bị nhiễm HIV cịn giới hạn khơng khuyến khích 13    PCR kỹ thuật sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm khuẩn, bao gồm bệnh lao Trong nghiên cứu này, người ta áp dụng kỹ thuật PCR để phát DNA M tuberculosis mẫu máu bệnh nhân với phổ rộng bệnh nhân nhiễm lao, gồm bệnh nhân không bị nhiễm HIV bị nhiễm HIV Phương pháp thực Lấy mẫu máu vùng ngoại biên cho vào tube có chứa sẵn dung dịch chống đơng tụ EDTA phân tích mẫu Tồn mẫu tube trải dung dịch Ficol-Hypaque ly tâm 400 vòng 30 phút nhiệt độ phòng Phần kết tủa rửa lần với muối phosphate-buffered (10 mM phosphate buffer [pH 7.2], 150 mM NaCl) Tế bào, 106, ly tâm 9000 vòng 15 phút, ủ 100 µl buffer phân giải (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.45% Tween 20, 0.45% Nonidet P-40) có chứa 100 µg enzyme proteinase K ml 56oC 3h sau nâng nhiệt độ biến tính 95oC 10 phút Tất mẫu phân tích với cặp primer (PCO4-GH20) khuếch đại vùng gene β-globin, với biến đổi sau: phản ứng PCR thực với thể tích cuối 25 µl chứa 1.5 mM MgCl2 12.5 µl dung dịch dung giải mẫu Tiến trình cho phép định lượng tồn DNA tế bào có mặt tác nhân ức chế Taq polymerase Sự khuếch đại tiến hành mô tả, sử dụng kỹ thuật khởi động nóng ( hot start technique) Phản ứng phát vùng 123-bp từ trình tự chèn IS 6110 phức hợp chuyên biệt M tuberculosis PCR thực chu kỳ nhiệt DNA ( Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn) Phản ứng khuếch đại thực với thể tích 25 µl chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphate, primers (1mM loại), 100000 PBMC Sau hỗn hợp phản ứng đạt 82oC, 0.625 unit Taq pol thêm vào Sau mẫu biến tính 94oC khoảng phút, thực 30 chu kỳ khuếch đại với quy trình sau: biến tính 94oC phút, bắt cặp 14    68oC phút, kéo dài với mồi 72oC phút Thời gian kéo dài tăng thêm 5s với chu kỳ Sau khuếch đại, 10µl hỗn hợp phản ứng điện di ethidium bromide- có chứa 2% gel agarose quan sát tia UV DNA chuyển qua màng nylon alkaline blotting Lai phân tử thực 53 SSPE (0.75 M NaCl, 50 mM sodium phosphate [pH 7.7], mM EDTA)- dung dịch 13 Denhardt’s- 1% sodium dodecyl sulfate (SDS)–10% dextran sulfate 55oC để qua đêm với mẫu dò đánh dấu 32 P Sự bắt cặp đặc hiệu mẫu dò khoảng 108 cpm/mg, xấp xỉ 107 cpm sử dụng phản ứng lai Sau đó, màng lai rửa 2x SSPE- 0.1 % SDS 55oC đưa vào máy … Có chứa màng hình khuếch đại khoảng đến 24 h -70oC Mẫu dương tính nhìn thấy kỹ thuật phóng xạ tự ghi Trong tất trường hợp, kết đạt từ mẫu nhân giống hoàn toàn 15    2.2.2 Xác định đặc hiệu loài Mycobacterium bovis PCR Kỹ thuật RAPD sử dụng xác định đoạn đặc hiệu loài Mycobacterium bovis Một đọan DNA có kích thước khoảng 500 bp khuếch đại từ gene 15 dòng M bovis, bao gồm M bovis BCG Pasteur, mặt 26 vi khuẩn lao khác 20 dòng khác Mycobacterium tuberculosis Khi đoạn DNA sử dụng mẫu dò phương pháp Southern blot, vài band có hoạt tính phóng xạ thuộc 16    M tuberculosis M bovis quan sát Tuy nhiên, đoạn DNA lai đặc hiệu với đoạn EcoRI 2900bp gene M bovis, lại không lai với DNA nhiễm sắc thể M avium Dựa tỷ lệ trình tự nucleotide đoạn 500 bp, hai primer oligonucleotide thiết kế tiến hành phản ứng PCR Sử dụng mẫu DNA vi khuẩn lao tinh sạch, có M bovis M bovis BCG cho band khuếch đai Phản ứng PCR phát 10 fg DNA M bovis tinh Thí nghiệm sử dụng xác định trực khuẩn trực tiếp từ mẫu sinh vật khơng qua ni cấy, ví dụ sữa Phương pháp thực Các dòng vi khuẩn lao sử dụng cho bảng cho tăng trưởng môi trường Sauton loặc Lowensttein- Jensen, thu hoạch bảo quản 4oC Các dòng M bovis phân lập từ thú bị nhiễm Các dịng M tuberculosis phân lập lấy từ phịng thí nghiệm vi sinh, bệnh viện San Juan de Dios Tất dòng phân loại thử nghiệm sinh hóa vi sinh theo tiêu chuẩn 17    Ly trích DNA nhiễm sắc thể: Đối với tinh DNA quy mơ nhỏ, vịng trịn khuẩn lạc trưởng thành tổng hợp lại TE ( 10 mM Tris-HCl, pH 8, mM EDTA) rửa lần với loại buffer Vi khuẩn ủ khoảng 1h 37oC với có mặt lysozyme (2 mg/ml) Vách tế bào phá vỡ cách từ từ tăng nhiệt độ lên 60oC thêm vào SDS proteinase K (Bethesda Research Laboratory) đến nồng độ cuối 1% (w/v) 250 µg/ml Sau 1.5h, DNA ly trích với phenol/ chloroform kết tủa với 0.6 V 2-propanol Phần lắng rửa với 70% (v/v) ethanol tăng sinh lại 30-50 µl nước cất; 10 µl mẫu sử dụng kỹ thuật RAPD, phản ứng PCR đặc hiệu 18    Các primer sử dụng kỹ thuật RAPD liệt kê bảng Các trình tự oligonucleotide thiết kế theo hàm lượng GC gene vi khuẩn lao, sử dụng chương trình Oligo version 4.0 ( National Biosciences) Các primer tổng hợp phương pháp phosphite triester pha rắn theo Pharmacia LKB Gene Assembler Special 19    Khuếch đại kỹ thuật RAPD: Thực phản ứng với 50 µl có chứa 10µl DNA, 1x buffer phản ứng ( Gene amp kit, Perkin Elmer Cetus), 2.5 đơn vị Taq pol, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphate, 75 pmol primer Phản ứng thực theo chu kỳ nhiệt DNA Perkin Elmer Phản ứng thực 30 chu kỳ khuếch đại với bước biến tính 94oC phút, bắt cặp 30s nhiệt độ nóng chảy (Tm, bảng 2) primer, bước kéo dài phút 72oC Phân tích sản phẩm RAPD: 5µl mẫu từ thử nghiệm RAPD phân tích điện di gel với 1% (w/v) gel agarose DNA quan sát cách nhuộm với ethidium bromide ( 0.5 µg/ml; Sigma) gel chiếu qua tia UV Các sản phẩm khuếch đại đưa lên màng gắn mẫu dò Z-probe (Bio- Rad) để lai phân tích Đoạn đặc hiệu khuếch đại kỹ thuật RAPD, dài xấp xỉ 500bp, tinh từ gel agarose sử dụng Geneclean kit (Bio 101) Đoạn khuếch đại (10 ng) đánh dấu với Rediprine kit ( Amersham) sử dụng [α-32P] dCTP ( Amersham) Màng Z-probe có chứa sản phẩm RAPD từ dịng mycobacteria khác lai với probe đánh dấu ( 1x106 cpm/ml) 42oC ủ qua đêm dung dịch chứa 50% ( v/v) formamide, 0.12 M Na2HPO4, pH 7.2, 0.25 M NaCl, 7% (w/v) SDS Sau lai, màng rửa khoảng 15 phút 2x SSC ( SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate)/ 0.1% SDS 42oC; 30 phút 1x SSC/0.1%SDS 65oC, để tia X-Omat Kodak -70oC qua đêm Đối với phương pháp lai Southern, µg DNA M tuberculosis, M.bovis M avium phân cắt hoàn tồn nhờ EcoRI Q trình lai thực mơ tả Tạo dịng giải trình tự đoạn chuyên biệt Đoạn DNA tinh dịng hóa vào plasmid pCR 1000 ( Invitrogene) giải trình tự nucleotide clone pLD1 thực cách sử dụng T7 M13 theo hướng primer với Sequenase kit từ USB ( Sanger et al., 1977) 20    Khuếch đại PCR Dựa tỷ lệ trình tự nucleotide đoạn 500bp đặc hiệu, cặp mồi thiết kế cho việc sử dụng PCR đặc hiệu ( bảng 2) Điều kiện phản ứng thực tối đa 30 chu kỳ, với chu kỳ nhiệt sau: bước biến tính 94oC vịng phút, bước bắt cặp 68oC phút, bước tổng hợp 72oC phút 21    22    III KẾT LUẬN Kỹ thuật PCR, với ưu điểm nó, ngày sử dụng rộng rãi chẩn đoán xét nghiệm bệnh người gia súc gia cầm Việc chẩn đoán sớm vi khuẩn lao giúp đưa hướng điều trị thích hợp nhằm tránh tình trạng uống thuốc không bệnh, dễ tạo chủng vi khuẩn kháng thuốc Hy vọng tương lai khơng xa người ta ngăn chặn lây lan vi khuẩn lao người gia súc gia cầm 23    TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y NXB Nơng nghiệp Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải, 2008 Công nghệ sinh học- Tập II, Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA NXB Khoa học tự nhiên cơng nghệ www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=228836 www.scielo.br/pdf/bjm/v40n2/v40n2a04.pdf http://xttm.agroviet.gov.vn/Site/vi‐VN/64/109/13847/Default.aspx  www.anova.com.vn/ /article.asp?                       ... Trong phạm vi tiểu luận này, xin đề cập đến vi? ??c chẩn đoán vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) kỹ thuật PCR 3    II TỔNG QUAN Bệnh lao 1.1 Vi khuẩn lao 1.1.1 Mycobacterium. .. cấy tuần 37oC môi trường Herold (h) Chẩn đoán vi khuẩn lao phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) 2.1 Phương pháp PCR 2.1.1 Định nghĩa Phương pháp PCR phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn... đoạn PCR dài kb đề xuất phút Khi khuếch đại phân đoạn PCR dài hơn, thời gian tổng hợp tăng lên phút cho kb 2.2 Chẩn đoán vi khuẩn lao PCR 2.2.1 Chẩn đoán nhanh Mycobacterium tuberculosis PCR Với