TIỂU LUẬN:SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO ( Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) ppt

Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặt hạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có độ chính xác không cao,… Ngày nay, với sự phát triển của các k

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỚP DH06SH

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC VÀ GIA CẦM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

Giáo viên hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ TÚ TRINH

MSSV: 06126169

Tháng 10/200

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Lao là tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp nhất

ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não),

hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương và khớp

Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2

tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi năm, gây 2 triệu người tử vong, hầu hết ở các nước đang phát triển

Hầu hết (90%) các trường hợp nhiễm khuẩn lao là tiềm ẩn không triệu chứng 10% những người này trong cuộc đời họ sẽ tiến triển thành bệnh lao có triệu chứng, và nếu không điều trị, nó sẽ giết 50% số nạn nhân Lao là một trong 3 bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất trên thế giới: HIV/AIDS giết 3 triệu người mỗi năm, lao giết 2 triệu, và sốt rét giết 1 triệu

Sự sao lãng trong các chương trình kiểm soát lao, sự bùng phát của đại dịch HIV/AIDS và việc di dân đã khiến lao trỗi dậy Các chủng lao kháng đa thuốc

(MDR, multiple drug resistant) đang tăng Năm 1993, Tổ chức Y tế Thế giới tuyên

bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu đối với lao

Do đó, việc phát hiện và điều trị kịp thời đối với bệnh lao rất quan trọng Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như xét nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứng tuberculin hay soi phế quản Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặt hạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có độ chính xác không cao,… Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử sẽ giúp cho quá trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng và hiệu quả hơn Trong phạm vi bài tiểu luận này, tôi xin đề cập đến việc chẩn đoán vi khuẩn lao

(Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) bằng kỹ thuật PCR

Giống: Mycobacterium

Loài: M tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (MTB), tác nhân gây bệnh lao, là vi khuẩn

hiếu khí Vi khuẩn này phân chia mỗi 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân

chia nhanh nhất là một chủng E coli, có thể phân chia mỗi 20 phút) MTB

không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan Trên mẫu nhuộm Gram, nó nhuộm Gram dương rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả Trực khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, có thể chịu đựng được chất sát khuẩn

yếu và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhưng trong điều kiện tự nhiên, chỉ có thể phát triển trong sinh vật ký chủ

Trực khuẩn lao được xác định dưới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm của nó: nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó

được phân loại là "trực khuẩn kháng acid" (acid-fast bacillus, viết tắt là AFB)

Với kỹ thuật nhuộm thông thường nhất là nhuộm Ziehl-Neelsen, AFB có màu

đỏ tươi nổi bật trên nền xanh Trực khuẩn kháng acid cũng có thể được xem bằng kính hiển vi huỳnh quang và phép nhuộm auramine-rhodamine

Phức hợp M tuberculosis gồm 3 loài Mycobacterium khác có khả năng gây lao: M bovis, M africanum và M microti Hai loài đầu rất hiếm gây bệnh

và loài thứ 3 không gây bệnh ở người

1.1.2 Mycobacterium bovis

Hình 2: Mycobacterium bovis

Phân loại

Giới: Bacteria Ngành: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Phân bộ: Corynebacterineae Họ: Mycobacteriaceae

Giống: Mycobacterium

Loài: M bovis

Mycobacterium bovis là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh lao phổi ở gia

súc, nhưng cũng có thể gây bệnh cho những loài khác kể cả con người Ở

người, M.bovis có thể gây ra chủng lao ảnh hưởng đến phổi, hạch bạch huyết

và các bộ phận khác của cơ thể Vi khuẩn này phân chia rất chậm, từ 16 đến 20

giờ, là vi khuẩn hiếu khí Nó có liên hệ với M tuberculosis

1.2 Sức đề kháng của vi khuẩn

Vi khuẩn có sức đề kháng mạnh nhất là chỗ thiếu ánh sáng và được làm khô Trong phân gia súc, đờm, chỗ tối thì vi khuẩn có thể sống hàng tháng Ánh sáng mặt trời có khả năng làm mất độc lực vi khuẩn sau 8 giờ

1.3 Phương thức lây truyền

Các loài động vật máu nóng, máu lạnh, gia súc, thú rừng, người đều có thể mắc bệnh Có thể xếp thứ tự cảm nhiễm như sau: người, bò, gà, heo, chó, mèo, trâu Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo các con đường sau:

9 Đường hô hấp: phổ biến nhất là ở bò và người, mầm bệnh từ cơ thể bị bệnh bài xuất ra ngoài qua đường hô hấp hay qua phân, mầm bệnh có trong không khí, gia sú khỏe hít vào sẽ mắc bệnh

9 Đường tiêu hóa: thông thường qua bú sữa, thức ăn, nước uống có mầm bệnh

9 Ngoài ra còn có thể lây lan qua núm nhau, đường sinh dục, đường phối giống

1.4 Triệu chứng

9 Nhóm lao phổi: ho khan, sau to hơn có âm ran, về sau ho ướt ho

có đờm, vật ốm, đờm lúc đầu loãng sau đặc dần có thể có mủ máu Thời gian sau là rối loạn hô hấp, thở hắt nhiều, niêm mạc mũi có thể xuất huyết, phổi có âm ran ướt

9 Nhóm lao hạch: hạch sưng cứng, bề mặt hạch không trơn, hạch cứng lồi lõm, không di động được, các hạch dưới hàm, vai, hạch

vú, hạch trước vai đều bị sưng

9 Nhóm lao vú: chủ yếu ở bò sữa năng suất cao, vú sưng, núm vú

bi biến dạng, nạch vú sưng to gồ ghề, sản lượng sữa giảm

9 Nhóm lao đường tiêu hóa: ít gặp, thường gặp ở các ổ lao ở ruột

có thể ở gan, gia súc tiêu chảy, gầy dần, rối loạn tiêu hóa, niêm mạc đường tiêu hóa bị phá hủy, hạch màng treo ruột bị thoái hóa dạng bã đậu

1.5 Bệnh tích

Có thể nghi ngờ bệnh khi có bệnh tích casein hóa hoặc calci hóa Các hạt lao chủ yếu có ở phổi, màng treo ruột và hạch lamba, xương hay khớp

Các bệnh tích lúc đầu gồm các hạt nhỏ có casein hoặc calci hóa trong hạch lamba vùng hầu, ngực và đôi khi ở hạch màng treo ruột về sau chúng gồm rất nhiều hạt to, cứng, màu trắng xám ở khu vực màng phổi

và màng bụng (hạt có màu xám), kích thước hạt thay đổi từ đầu đinh ghim tới hạt phỉ Trong thể lao hạt kê, các hạt lao có rất nhiều ở phổi, gan lách và các cơ quan khác, chúng thường có màu xám vàng

Tế bào khổng lồ trong u hạt hạch phổi và tế bào kháng axit trong bào

tương (g) ; khuẩn lạc Mycobacterium bovis nuôi cấy 8 tuần ở 37oC trong

môi trường Herold (h)

2 Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction)

2.1 Phương pháp PCR

2.1.1 Định nghĩa

Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp này được K.Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu

sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,…

2.1.2 Nguyên lý

Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polymerase hay còn gọi là PCR là một phản ứng tổng hợp sợi DNA đơn dựa vào một sợi DNA đơn khác làm khuôn và một đoạn oligonucleotide làm mồi Sợi DNA đơn được tổng hợp nên có trình

tự bổ trợ với sợi khuôn

Các oligonucleotide dùng làm mồi cho enzyme DNA polymerase và sợi biến tính của phân đoạn DNA lớn được dùng làm sợi khuôn Kết quả là tổng hợp các sợi DNA mới bổ trợ cho các sợi khuôn bố mẹ Những sợi mới này có đầu 5’ (chính là đầu 5’của mồi oligonucleotide), trong khi đó đầu 3’ thì chưa xác định được độ dài

Quá trình tổng hợp định hướng theo oligonucleotide của các sợi DNA con có thể được nhắc lại nếu sợi kép mới được biến tính (bằng nhiệt) và mồi bổ sung được phép gắn vào sợi khuôn (nhờ hạ xuống nhiệt độ thích hợp) Các bước này bao gồm: a) biến tính, b) gắn mồi, c) kéo dài mồi tạo ra một chu kỳ trong phương pháp khuếch đại PCR

Sau mỗi chu kỳ sợi DNA mới tổng hợp có thể làm khuôn trong chu kỳ tiếp theo

Một sợi trong sợi mới được tổng hợp từ chu kỳ 2 trở đi có đầu 5’ và 3’ được xác định tại vị trí gắn mồi oligonucleotide Sau n chu kỳ, sự khuếch đại các phân đoạn tuân theo quy luật sau: 1) chỉ có 1x bản sợi khuôn ban đầu (sợi

kép 2 –dna-), PCR không bao giờ tái tạo được sợi dài như sợi khuôn, trừ

trường hợp hai mồi nằm ở tận cùng hai đầu sợi khuôn 2) Có n sợi đơn mỗi loại

(-dna và dna-) với độ dài không xác định, trong đó n là số chu kỳ Những phân

đoạn có độ dài không xác định này có một đầu được giới hạn bởi mồi PCR còn đầu kia không xác định 3) Có [2n – (n+1)] bản sao sợi đơn mỗi loại (dna xuôi

và ngược) có độ dài xác định giữa hai mồi PCR

2.1.3 Tối ưu hóa PCR

Các yếu tố quyết định sự thành công của PCR có thể chia thành bốn nhóm chính, đó là: khuôn (độ tinh sạch và nồng độ), mồi thiết kế (tính đặc hiệu, cấu trúc và nồng độ), các thành phần khác (đệm, MgCl2, phụ gia, polymerase, dNTP), các chế độ phản ứng (nhiệt độ và thời gian)

2.1.3.1 Khuôn DNA

PCR là một công cụ cực kỳ mạnh để khuếch đại DNA bởi vậy cần rất ít khuôn DNA Nhưng để giảm khả năng tạo lỗi của Taq DNA polymerase, có thể sử dụng nồng độ DNA cao hơn, mặc dù quá nhiều khuôn có thể tăng hàm lượng thể lẫn tạp và giảm hiệu suất

Thường hàm lượng khuôn DNA trong khoảng 0.01-1 ng đối với plasmid hoặc DNA phage và 0.1-1 µg đối với DNA nhân bào, cho một phản ứng tổng thể tích 50 µl Hàm lượng khuôn DNA cao hơn thường tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, nhưng nếu độ tin cậy tổng hợp

là tới hạn, nên dùng hàm lượng khuôn DNA tối đa cho phép cùng với số chu kỳ PCR giới hạn để tăng tỷ lệ sản phẩm PCR đặc hiệu

2.1.3.2 Mồi

Mồi là một phân đoạn nucleotide ngắn bổ trợ cho vùng DNA cần được khuếch đại trong PCR Mồi có thể đặc hiệu hoặc chung (universal) với trình tự nucleotide đặc trưng Mồi chung bổ trợ cho nhiều trình tự nucleotide là một bộ phân tử DNA đặc trưng nào đó Do đó, chúng có thể liên kết rộng rãi với nhiều loại khuôn DNA

Mồi là một trong các yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành công của PCR Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ thích hợp sẽ dẫn đến PCR có sản phẩm hay không Tính bổ trợ hoàn chỉnh của 18nt hoặc hơn là lý tưởng

2.1.3.4 dNTP

Nồng độ mỗi loại dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) trong hỗn hợp phản ứng thường là 200 µM Một điều quan trọng là nồng độ mỗi loại dNTP phải như nhau Chỉ cần một dNTP nào đó chênh về nồng độ có thể gia tăng mức độ gắn nhầm nucleotide vào sản phẩm PCR, dẫn đến kết quả trình tự có lỗi và sản phẩm biểu hiện có thể là một thể đột biến

Nồng độ nucleotide cần không quá 50µM mỗi lọai, tuy nhiên sản phẩm dài có thể cần nhiều hơn Khi độ tin cậy tối đa của quy trình PCR là tới hạn, nồng độ dNTP cuối cùng phải là 10-50 µM, do độ tin cậy tổng hợp DNA là tối đa trong dãy nồng độ này Ngoài ra, nồng độ MgCl2 phải được chọn nghiêm ngặt, bắt đầu từ 1 mM và tăng lên 0.1mM mỗi bước, cho tới khi thu được hiệu suất có đủ sản phẩm PCR Nồng độ dNTP có thể được sử dụng tới 1.5 mM Do dNTP bắt kẹp các ion Mg2+, nên [Mg2+] sử dụng có thể cần được thay đổi Tuy nhiên thừa dNTP có thể tăng tỷ lệ lỗi và có khả

năng ức chế Taq pol Bởi vậy giảm dNTP (10-50 µM) có thể cũng giảm tỷ

lệ lỗi Phân đoạn PCR kích thước lớn hơn cần nhiều dNTP hơn

2.1.3.5 Polymerase

Có thể sử dụng Taq DNA polymerase, Tli, Pfu trong phản ứng PCR

Taq pol có một tỷ lệ lỗi cao hơn Tli hoặc Pfu Tuy nhiên Taq pol lại ít phức

tạp hơn các polymerase khác và ít khi thất bại Người ta có thể sử dụng Taq

pol cùng với các enzyme khác để tăng độ tin cậy của phản ứng

Thường 1-1.5 unit Taq DNA polymerase được sử dụng trong một hỗn hợp phản ứng 50 µl Hàm lượng Taq pol cao hơn có thể tổng hợp nhiều

sản phẩm PCR không đặc hiệu Tuy nhiên, nếu các chất ức chế có mặt trong hỗn hợp phản ứng (ví dụ khuôn DNA sử dụng không được tinh sạch cao),

hàm lượng Taq pol (2-3 unit) cao hơn có thể là cần thiết để thu hiệu suất sản

phẩm khuếch đại cao hơn

2.1.3.6 Nồng độ Mg 2+

Nồng độ Mg 2+ ảnh hưởng tới bắt cặp mồi, Tm của sợi khuôn, sản phẩm và liên kết mồi-khuôn, tính đặc hiệu sản phẩm, hoạt tính enzyme và tính chính xác [Mg2+] ảnh hưởng tới sự bắt cặp oligo với khuôn DNA bằng cách bền hóa với khuôn-mồi Vì vậy nó cũng tăng sự bắt cặp không đặc hiệu và tổng hợp các sản phẩm PCR không mong muốn (cho nhiều băng trên gel) EDTA kẹp càng cua Mg 2+ có thể thay đổi [Mg2+]

Do ion Mg 2+ taọ ra các phức hợp với dNTP, mồi và khuôn DNA, nồng độ tối thích của MgCl2 được lựa chọn cho từng thí nghiệm Quá ít ion

Mg2+ cho hiệu suất thu nhận sản phẩm PCR thấp và quá nhiều ion tăng hiệu suất thu các sản phẩm không đặc hiệu và tăng gắn nhầm [Mg2+] thấp hơn được mong muốn khi độ tin cậy tổng hợp DNA là tới hạn

Taq pol cần các ion Mg2+ tự do Do các thành phần như dNTP, mồi khuôn, tất cả đều tạo càng cua và thu giữ cation, trong đó dNTP có nồng độ cao nhất, do đó [Mg2+] ít nhất phải là 0.5-2.5 mM cao hơn nồng độ của dNTP

2.1.3.7 Phụ gia

Phụ gia là những chất được bổ sung vào PCR nhằm thu các sản phẩm PCR mong muốn nhiều hơn Phụ gia thường dùng cho các phân đoạn

PCR rất dài, giàu GC hoặc dễ hình thành cấu trúc bậc hai Các phụ gia glycerol, formamide, NMP có tác dụng hạ thấp nhiệt độ bắt cặp vài độ và giảm biến tính, trong khi đó DMSO giảm hình thành cấu trúc bậc hai

2.1.3.8 Đệm PCR

Thường các kit thương mại đều cung cấp đệm đã pha sẵn Nhưng người ta có thể sử dụng nồng độ đệm PCR tự pha chế cao hơn để nâng cao hiệu suất Đệm bao gồm các thành phần: 16.6 mM ammonium sulfate, 67.7

mM Tris-HCl, pH 8.9, 10 mM β-mercaptoethanol, 170 µg/ml BSA, 1.5-3

mM MgCl2

Đệm PCR trong kit thường chứa các thành phần: 10-50 mM HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 hoặc cao hơn, 100 µg/ml gelatin hoặc BSA, và/hoặc 0.05-0.1% chất tẩy rửa không ion như Tween-20 hoặc Nonidet P-40 hoặc Triton X-100

Tris-Nồng độ muối KCl hoặc NaCl cao hơn 50 mM sẽ ức chế Taq pol,

nhưng lại cần thiết để tạo điều kiện dễ dàng bắt cặp mồi

Một số enzyme không cần bổ sung protein, một số khác lại phụ thuộc vào nó Một số enzyme hoạt động tốt hơn với sự có mặt của chất tẩy rửa, có lẽ do nó ngăn cản xu hướng tự nhiên của enzyme liên kết với nhau

2.1.4 Chu trình nhiệt

2.1.4.1 Biến tính

Thường biến tính 0.5-2 phút ở 94-95oC là đủ, do sản phẩm PCR được tổng hợp ở chu kỳ khuếch đại thứ nhất ngắn hơn đáng kể so với khuôn DNA ban đầu và được biến tính hoàn toàn dưới các điều kiện này Nếu DNA khuếch đại có hàm lượng GC rất cao, thời gian biến tính có thể được tăng lên 3-4 phút

2.1.4.2 Gắn mồi

Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích thấp hơn 5oC so với nhiệt độ nóng chảy của sợi kép mồi-khuôn DNA Thời gian gắn mồi kéo dài 0.5-2 phút là đủ Tuy nhiên, nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu thu được ngoài sản phẩm mong đợi, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước 1-2oC

2.1.4.3 Kéo dài

Thường bước kéo dài mồi (tổng hợp) được thực hiện ở 70-75oC Tốc độ

tổng hợp DNA bằng Taq DNA polymerase đạt cao nhất ở nhiệt độ này Thời

gian tổng hợp phân đoạn PCR dài 2 kb được đề xuất là 1 phút Khi khuếch đại các phân đoạn PCR dài hơn, thời gian tổng hợp được tăng lên 1 phút cho mỗi

kb

2.2 Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng PCR

2.2.1 Chẩn đoán nhanh Mycobacterium tuberculosis bằng PCR

Với tác động ngày càng tăng của bệnh lao và sự xuất hiện của các chủng

Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh

lao phổi có một ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng Ở các nước phát triển, tác động cao hơn của bệnh lao không chỉ liên quan đến bệnh AIDS

và tình trạng vô gia cư mà còn liên quan đến tuổi của dân số Mặc dù phổi là cơ quan chịu ảnh hưởng trực tiếp, các dạng bệnh do bị nhiễm phải hay các bệnh ngoài phổi là thường xuyên, được phát hiện đến khoảng 77% ở các bệnh nhân

bị nhiễm HIV và 24% ở các bệnh nhân không nhiễm HIV

Sự có mặt của vi khuẩn lao trong máu đã được biết đến hơn 50 năm; tuy nhiên, người ta chỉ mới nhận thấy sự xảy ra thường xuyên cho đến khi có đại dịch AIDS Ở thập kỷ trước, nuôi cấy trên môi trường máu đã trở thành công

cụ có ích cho việc phát hiện M tuberculosis và những vi khuẩn lao khác ở các

bệnh nhân bị nhiễm HIV, đặc biệt ở những bệnh nhân có hàm lượng tế bào CD4 thấp Mặc dù những kinh nghiệm từ những bệnh nhân AIDS, thông tin về lợi ích chẩn đoán của nuôi cấy trong môi trường máu ở những bệnh nhân không bị nhiễm HIV còn giới hạn và vẫn không được khuyến khích