Xác định giới tính cây đủ đủ bằng kỹ thuật PCR với các cặp Primer được thiết kế dựa vào vùng DNA

Xác định giới tính cây đủ đủ bằng kỹ thuật PCR với các cặp Primer được thiết kế dựa vào vùng DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  HỒNG THỊ DUNG XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NGHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn TS LÊ ĐÌNH ĐƠN KS NGUYỄN VŨ PHONG Sinh viên thực HỒNG THỊ DUNG KHĨA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  SEX DETERMINATION IN PAPAYA (Carica papaya L.) BY POLYMERASE CHAIN REACTION WITH PRIMER PAIRS DESIGNED IN SEXUAL CHROMOSOME REGION GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor PhD LÊ ĐÌNH ĐƠN Eng NGUYỄN VŨ PHONG Student HOÀNG THỊ DUNG TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ba Mẹ sinh thành, ni dƣỡng cho có ngày hôm Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Ban Chủ Nhiệm mơn Cơng Nghệ Sinh Học tồn thể q Thầy Cơ Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Thầy Lê Đình Đơn tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện cho tơi thực khóa luận Thầy Nguyễn Vũ Phong, anh Nguyễn Văn Lẫm tận tình bảo giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Các thầy cô, anh chị Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt luận văn Các bạn lớp Cơng Nghệ Sinh Học khóa 28 giúp đỡ, động viên học tập nhƣ sống TP HCM, tháng 08 năm 2006 Hồng Thị Dung iii TĨM TẮT HỒNG THỊ DUNG, Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 08/2006 “XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH” Giáo viên hƣớng dẫn: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN KS NGUYỄN VŨ PHONG Nội dung thực hiện: ­ Khảo sát quy trình nhiệt để tìm quy trình nhiệt thích hợp cho cặp primer T1, W11 ­ Thực PCR mẫu DNA tổng số mẫu đu đủ với cặp primer T1, W11 ­ Thực multiplex PCR với cặp primer T1, W11 Kết đạt đƣợc: Đã tìm đƣợc quy trình nhiệt ổn định cho cặp primer T1, W11 Kết PCR: lƣỡng tính sản phẩm PCR thu đƣợc có kích thƣớc 0,8 kb 1,5 kb Trên sản phẩm PCR thu đƣợc 0,8 kb Trên đực sản phẩm PCR Nhƣ vậy, nhận biết đƣợc giới tính đu đủ iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách hình viii Danh sách bảng ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Đối tƣợng nghiên cứu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu đu đủ 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc, phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Các giống đu đủ 2.1.5 Giới tính đu đủ 2.1.6 Di truyền học giới tính đu đủ 2.1.7 Yêu cầu ngoại cảnh 10 2.1.8 Giá trị dinh dƣỡng ý nghĩa kinh tế 11 2.1.9 Tình hình sản xuất trồng trọt 12 2.2 Kỹ thuật PCR 13 2.2.1 Lịch sử PCR 13 2.2.2 Nguyên tắc PCR 14 2.2.3 Các thành phần phản ứng PCR 14 2.2.4 Ƣu điểm nhƣợc điểm PCR 17 2.2.5 Nguyên tắc xác định giới tính đu đủ 18 v 2.3 Một số nghiên cứu nƣớc nƣớc 18 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Địa điểm thời gian 22 3.1.1 Địa điểm 22 3.1.2 Thời gian 22 3.2 Vật liệu thiết bị 22 3.2.1 Hóa chất 22 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 22 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu trại thực nghiệm 23 3.3.2 Ly trích DNA từ đu đủ phƣơng pháp CTAB 23 3.3.3 Thực phản ứng PCR 25 3.3.4 Điện di sản phẩm PCR 28 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết ly trích DNA 29 4.2 Kết PCR với cặp primer T1 30 4.2.1 Quy trình nhiệt 30 4.2.2 Quy trình nhiệt 31 4.2.3 Quy trình nhiệt 31 4.2.4 Quy trình nhiệt 32 4.3 Kết PCR với cặp primer W11 33 4.4 Kết PCR với cặp primer T1 W11 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT g: micro gram l: micro lít m: micro mol M: micro mol/lít bp: base pair CTAB: cetytrimethylammonium bromide ctv: cộng tác viên DAF: DNA amlification fingerprinting dNTP: deoxyribonucleotide – – triphosphate EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid ha: hecta kb: kilo base ng: nano gram nm: nano mol PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis PCR: polymerase chain reaction PSDM: papaya sex determination marker RAPD: random amplified polymorphic DNA SCAR: sequence characterized amplified region Ta: annealing temperature TAE: Tris Acetic EDTA TE: Tris EDTA Tm: melting temperature UI: unit international vii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây đu đủ (Carica papaya L.) Hình 2.2 Hoa đu đủ Hình 2.3 Hoa đu đủ lƣỡng tính Hình 2.4 So sánh hoa đu đủ hoa đu đủ lƣỡng tính Hình 2.5 Hoa đu đủ đực Hình 2.6 Chromosome giới tính thực vật 10 Hình 2.7 Kết khuếch đại DAF DNA đu đủ với primer 19 Hình 2.8 Kết PCR 10 giống đu đủ 20 Hình 2.9 Kết PCR với cặp primer SDP-1 SDP-2 20 Hình 4.1 DNA tổng số ly trích từ đu đủ theo quy trình ly trích 29 Hình 4.2 DNA tổng số ly trích từ đu đủ theo quy trình ly trích 29 Hình 4.3 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt 30 Hình 4.4 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt 31 Hình 4.5 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt 32 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với cặp primer W11 theo quy trình nhiệt 33 Bảng 4.7 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 W11 theo quy trình nhiệt 34 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 1.1 Kết lai chéo cá thể đu đủ có giới tính khác cuả Storey Bảng 1.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ giới 12 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer T1 27 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer W11 27 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng multiplex PCR 28 ix ...  XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NGHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH LUẬN... 08/2006 “XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH” Giáo... tiến hành đề tài: ? ?Xác định giới tính đu đủ (Carica papaya L.) phương pháp PCR với primer thiết kế dựa vào vùng DNA liên kết với gen quy định giới tính nhiễm sắc thể giới tính? ?? nhằm giúp nhà