Nghiên cứu virus gây bệnh trên cây ớt tại huyện củ chi , Tp.Hồ chí minh bằng kĩ thuật ELISA

Nghiên cứu virus gây bệnh trên cây ớt tại huyện củ chi , Tp.Hồ chí minh bằng kĩ thuật ELISA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  … KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU VIRUS (TMV, CMV) GÂY BỆNH TRÊN CÂY ỚT TẠI HUYỆN CỦ CHI, TP HỒ CHÍ MINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CMV BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: HUỲNH VĨNH KHANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  … NGHIÊN CỨU VIRUS (TMV, CMV) GÂY BỆNH TRÊN CÂY ỚT TẠI HUYỆN CỦ CHI, TP HỒ CHÍ MINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CMV BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 Sinh viên thực hiện: HUỲNH VĨNH KHANG LỜI CẢM TẠ Em vô biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến tận tình hƣớng dẫn truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian làm đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Quý thầy trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tận tâm giảng dạy, truyền đạt cho em tảng kiến thức vững sau bốn năm đại học Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh toàn thể anh chị Trung Tâm tạo điều kiện thuận lợi tối đa nhƣ tận tình giúp đỡ em thời gian thực tập tốt nghiệp Thầy Bùi Minh Trí, Thầy Huỳnh Văn Biết, Thầy Trần Nhật Phƣơng tận tình giúp đỡ, dạy bảo trang bị cho em kiến thức bổ ích Cảm ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập làm đề tài Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Huỳnh Vĩnh Khang iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN HUỲNH VĨNH KHANG, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “Nghiên cứu số virus (TMV, CMV) gây bệnh Ớt huyện Củ Chi, TP Hồ Chí Minh kỹ thuật ELISA xây dựng quy trình phát CMV kỹ thuật RT-PCR” đƣợc thực từ tháng 03 đến tháng 08/2006 Trung tâm Phân tích Hóa Sinh-Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Đề tài thực nội dung sau: Thu mẫu theo triệu chứng bệnh virus, 5-15 mẫu/ruộng Xác định tỷ lệ nhiễm loại virus CMV, TMV xã Hòa Phú, Nhuận Đức, An Nhơn Tây Trung Lập Thƣợng, huyện Củ Chi kỹ thuật ELISA Bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán CMV kỹ thuật RT-PCR Kết đạt đƣợc: Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm loại virus CMV, TMV xã nhƣ sau: - Hòa Phú: CMV: 86,7%; TMV: 76,7% - Nhuận Đức: CMV: 93,8%; TMV: 60,0% - An Nhơn Tây: CMV: 83,3%; TMV: 66,7% - Trung Lập Thƣợng: CMV: 81,3%; TMV: 87,5% Xây dựng đƣợc quy trình RT-PCR để chẩn đốn CMV iv ABSTRACT Huynh Vinh Khang, studying at Nong Lam University has finished the thesis for months (3-8/2006) The thesis entitled: “Research on viruses (TMV, CMV) causing diseases on pepper at Cu Chi District, Ho Chi Minh City using ELISA technique Formulating RT-PCR protocol to detect CMV” This research was carried out in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University The objectives of this research are as follows: Collecting the samples with the virus symptoms, 5-15 samples per field Determining infected levels of TMV and CMV at Hoa Phu, Nhuan Duc, An Nhon Tay and Trung Lap Thuong Communes, Cu Chi District Double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) method was standardized for the detection of TMV and CMV infection in pepper plants Formulating the RT-PCR protocol to detect CMV CP gene of the virus was amplified The results of this research are as follows: Infected levels of TMV and CMV were defined: - Hoa Phu: CMV: 86.7%; TMV: 76.7% - Nhuan Duc: CMV: 93.8%; TMV: 60.0% - An Nhon Tay: CMV: 83.3%; TMV: 66.7% - Trung Lap Thuong: CMV: 81.3%; TMV: 87.5% The RT-PCR protocol detects CMV successfully v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT - cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide Acid - CMV: Cucumber Mosaic Virus - CP: capsid protein - DAS-ELISA: Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - DEPC: Diethyl pyrocarbonate -dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate - M-MLV: Moloney murine leukemia virus - MP: movement protein - OD: Optical Density - ORF: Open Reading Frame - PBS-Tween: Phosphate – buffered saline with tween 20 - p-NPP: p-nitrophenol phosphate - PVP: Polyvinylpyrrolidone - RNA: Ribonucleic acid - RNAbc: RNA binding column - RT-PCR: Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction - TMV: Tobacco Mosaic Virus vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .iii Tóm tắt iv Tóm tắt tiếng Anh v Danh sách chữ viết tắt vi Mục lục vii Danh sách bảng x Danh sách hình xi Danh sách biểu đồ xi MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu ớt 2.1.1 Sơ lƣợc ớt .3 2.1.2 Đặc điểm thực vật học ớt 2.1.3 Giá trị dinh dƣỡng ớt 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu ớt 2.2 Sơ lƣợc loại bệnh virus ớt 2.3 Giới thiệu TMV CMV 2.3.1 Tobacco Mosaic Virus (TMV) 2.3.1.1 Nguồn gốc 2.3.1.2 Phân loại 2.3.1.3 Cấu trúc 2.3.1.4 Môi giới truyền bệnh 11 2.3.1.5 Triệu chứng 11 vii 2.3.1.6 Biện pháp kiểm soát 12 2.3.2 Cucumber Mosaic Virus (CMV) 13 2.3.2.1 Nguồn gốc 13 2.3.2.2 Phân loại 14 2.3.2.3 Cấu trúc 14 2.3.2.4 Môi giới truyền bệnh 15 2.3.2.5 Triệu chứng 16 2.3.2.6 Biện pháp kiểm soát 16 2.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán virus gây bệnh thực vật thƣờng sử dụng 17 2.4.1 Phƣơng pháp thị 17 2.4.2 Phƣơng pháp chẩn đoán thị màu 18 2.4.3 Phƣơng pháp chẩn đốn kính hiển vi điện tử 18 2.4.4 Phƣơng pháp ELISA 19 2.4.5 Phƣơng pháp RT-PCR 20 2.4.5.1 Kỹ thuật PCR 20 2.4.5.2 Kỹ thuật RT-PCR 21 2.5 Một số kết nghiên cứu nƣớc bệnh TMV CMV gây thời gian gần 25 2.5.1 Ở nƣớc 25 2.5.2 Ở Việt Nam 25 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Thời gian địa điểm thực 26 3.2 Vật liệu 26 3.2.1 Dụng cụ 26 3.2.2 Hóa chất dùng kỹ thuật ELISA phát TMV CMV 26 3.2.3 Hóa chất dùng kỹ thuật RT-PCR để phát CMV 27 3.2.3.1 Ly trích RNA 27 3.2.3.2 Tổng hợp cDNA 27 3.2.3.3 Thực phản ứng PCR khuyếch đại phân tử cDNA 28 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 28 viii 3.3.2 Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu 28 3.3.3 Phát TMV CMV kỹ thuật DAS-ELISA 29 3.3.4 Phát CMV RT-PCR 31 3.3.4.1 Ly trích RNA theo AurumTM Total RNA Mini Kit (Biorad) 31 3.3.4.2 Khuếch đại RNA RT – PCR 32 3.3.4.3 Điện di gel agarose 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Đánh giá tình hình nhiễm TMV CMV ELISA 35 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TMV CMV tổng số mẫu điều tra 35 4.1.2 Tỷ lệ mẫu nhiễm hỗn hợp virus TMV CMV so với mẫu nhiễm CMV hay TMV 36 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm TMV CMV xã 37 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV CMV theo giống ớt 38 4.1.5 Tỷ lệ nhiễm TMV CMV theo triệu chứng 38 4.1.6 Tỷ lệ nhiễm TMV CMV theo độ tuổi 39 4.2 Phát CMV kỹ thuật RT-PCR 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng ớt xanh Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ xã huyện Củ Chi 29 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất cho phản ứng tổng hợp cDNA 32 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 33 Bảng 4.1 Kết ELISA tổng số mẫu 35 Bảng 4.2 Tỷ lệ mẫu nhiễm hỗn hợp virus TMV CMV so với mẫu nhiễm CMV hay TMV 36 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm TMV CMV xã 37 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm TMV CMV theo triệu chứng 39 Bảng 4.5 Thành phần hóa chất tối ƣu phản ứng tổng hợp cDNA 40 Bảng 4.6 Thành phần hóa chất tối ƣu phản ứng PCR 40 x ... CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  … NGHIÊN CỨU VIRUS (TMV, CMV) GÂY BỆNH TRÊN CÂY ỚT TẠI HUYỆN CỦ CHI, TP HỒ CHÍ MINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CMV BẰNG KỸ THUẬT... virus châu Âu, Argentina, châu Úc, Đan Mạch, Pháp, Hungary, Iceland, Ấn Đ? ?, Italy, Nhật Bản, Kenya, Hà Lan, Peru, Tây Ban Nha, Anh , Mỹ TMV gây bệnh cho 199 loài 30 họ thực vật (Shew & Lucas,... phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Huỳnh Vĩnh Khang iii TĨM TẮT KHĨA LUẬN HUỲNH VĨNH KHANG, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 ? ?Nghiên cứu số virus (TMV, CMV) gây bệnh Ớt huyện Củ Chi, TP