Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kĩ thuật Elisa

Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kĩ thuật Elisa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. NGUYỄN ANH KHOA PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 Sinh viên thực hiện NGUYỄN ANH KHOA Niên khóa: 2002 - 2006 Giáo viên hƣớng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH AND DETECT RATOON STUNTING DISEASE BY PCR Graduation thesis Major: Biotechnology HCMC, 9/2006 Professor BUI CACH TUYEN Student NGUYEN ANH KHOA Term: 2002- 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN iii LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này.  TS. Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức trong thời gian thực hiện đề tài.  ThS. Nguyễn Văn Cƣờng cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu tại đây.  Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận này.  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Khoa iv TÓM TẮT NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến. Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc (Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng (TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nƣớc ta bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu góp phần quan trọng trong công tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng nhƣ công tác phòng chống và kiểm soát dịch bệnh trên cây có mía hiệu quả hơn. Kết quả đạt đƣợc - Các giống mía sản xuất và nhập nội đƣợc khảo sát đều không bị nhiễm bệnh khảm lá mía thông qua kết quả chẩn đoán bằng ELISA. - Phát hiện đƣợc bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm mô mẫu. Kết quả: tỉ lệ mô khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx. - Đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn Lxx và hoàn thiện quy trình phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR. v SUMMARY This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9th 2006. The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”. Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai. That is basic to contribute statistics to situation of sugarcane mosaic disease at the areas. Specially, the thesis is the first step to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) on sugarcane in our country. The researching is an important contribution to select pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane effectively. The results of this research are as follows: - DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not found SCMV. - Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and 75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm. - Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process. - Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria detecting process by PCR. vi MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT .iv MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .xi Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu . 2 1.3. Giới hạn đề tài . 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1. Sơ lƣợc về cây mía 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện . 3 2.1.2. Phân loại 3 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố . 3 2.1.4. Nhân giống 4 2.1.5. Sản lƣợng . 4 2.1.6. Chế biến và sử dụng 5 2.2. Bệnh trên cây mía . 5 2.3. Bệnh khảm lá mía . 7 2.3.1. Nguồn gốc và phân bố . 7 2.3.2. Triệu chứng 7 2.3.3. Tác nhân gây bệnh . 8 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía . 9 2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh . 9 2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế . 9 2.3.7. Phòng trừ . 10 2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía 10 vii 2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh 10 2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi 10 2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) 10 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 12 2.4. Bệnh cằn mía gốc 14 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố . 14 2.4.2. Triệu chứng 14 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài . 14 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây . 15 2.4.3. Tác nhân gây bệnh . 16 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh 16 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế . 17 2.4.6. Kiểm soát bệnh 17 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía . 17 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi . 17 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học 17 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) . 19 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử . 19 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc . 19 2.5.1. Trên thế giới 19 2.5.2. Trong nƣớc 20 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1. Nội dung nghiên cứu . 22 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 3.3. Vật liệu nghiên cứu . 22 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu . 22 3.3.2. Virus gây bệnh . 22 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh . 22 3.3.4. Hóa chất thí nghiệm 23 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ 23 3.4. Phƣơng pháp tiến hành . 23 3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu . 23 [...]... dng ELISA l: - Direct ELISA: õy l dng n gin nht ca phng phỏp ELISA Trong ú, khỏng nguyờn cn phỏt hin s c gn trc tip lờn b mt giỏ th v s c phỏt hin bng mt khỏng th duy nht (khỏng th ny ó c gn enzyme) - Indirect ELISA: Phng phỏp ny khỏc Direct ELISA ch khỏng th bt khỏng nguyờn khụng c gn enzyme m nú l mc tiờu gn c hiu ca mt khỏng th khỏc (khỏng th ny mi l khỏng th c gn vi enzyme) 11 - Sandwich ELISA: ... ó s dng k thut DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) thc hin chn oỏn SCMV õy l mt dng ca Direct sandwich ELISA vi khỏng th s dng l khỏng th a dũng Quy trỡnh cỏc bc thc hin DAS ELISA c s húa nh S 2.1 Cho khỏng th vo mi a ELISA , ra Thờm khỏng nguyờn vo , ra B sung khỏng th cú gn enzyme , ra Thờm c cht to mu , c kt qu S 2.1 Tin trỡnh thc hin ELISA Sandwich trc tip Phõn tớch kt qu ELISA da trờn s i... Sandwich ELISA: õy l mt dng ELISA c s dng ph bin nht trong thc tin do nú cho phn ng mnh v nhy c gi l sandwich l do kt qu thớ nghim c ỏnh giỏ thụng qua s kt hp ca hai loi khỏng th l khỏng th bt (capture antibodies) v khỏng th phỏt hin (detection antibodies) K thut ny cng c phõn lm hai dng l Direct sandwich ELISA (DAS -ELISA Double antibody sandwich) v Indirect sandwich ELISA (TAS -ELISA - Triple antibody... nh bng húa cht trờn li ng quan sỏt di kớnh hin vi in t õy l phng phỏp trc tip v n gin 2.3.8.3 Phng phỏp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) Phng phỏp ELISA l phng phỏp min dch liờn kt enzym Nm 1972 - 1973, ELISA c s dng u tiờn trong y hc chn oỏn virus n nm 1977 Clark v Adam ln u tiờn ng dng ELISA xỏc nh virus hi thc vt ti Scottlen õy l k thut khỏ nhy v tng i n gin, cho phộp xỏc nh khỏng nguyờn... 4.3 So sỏnh kt qu chn oỏn ca hai phng phỏp: dựng kớnh hin vi v nhum STM 36 S 2.1 Tin trỡnh thc hin ELISA Sandwich trc tip 11 S 2.2 S tng quỏt ca k thut RT - PCR 13 S 3.1 S iu tra 24 S 3.2 S tỏch chit mu lỏ cho ELISA 25 S 3.3 S b trớ ging trờn a ELISA 25 x DANH SCH CC HèNH HèNH TRANG Hỡnh 2.1 Cõy mớa 3 Hỡnh 2.2 Bnh hi ph bin trờn cõy... tớch ELISA xvi Hỡnh PL4 Bnh m vũng thng xut hin trờn cỏc cõy kho sỏt xvi Hỡnh PL5 Quỏ trỡnh iu tra v thu mu xvi Hỡnh PL6 Gc mớa b cn xvi Hỡnh PL7 t thõn mớa b nhim Lxx nờn ngn li xvii Hỡnh PL8 Thõn mớa b bnh cú ng kớnh nh hn thõn bỡnh thng xvii Hỡnh PL9,10 Vt i mu bờn trong thõn xvii xi DANH SCH CC CH VIT TT ELISA: enzym linked immunosorbent assay DAS -ELISA: ... mu , c kt qu S 2.1 Tin trỡnh thc hin ELISA Sandwich trc tip Phõn tớch kt qu ELISA da trờn s i mu ca cỏc ging (Hỡnh 2.5) v bng mỏy c ELISA Mỏy c ELISA hot ng da trờn nguyờn lớ quang ph k, o giỏ tr OD ca cỏc ging bc súng 405 nm 12 Hỡnh 2.5 C ch phn ng i mu trong DAS- ELISA 2.3.8.4 Phng phỏp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phng phỏp ny do K Mullis v ctv phỏt minh nm 1985 v c s dng rng rói nht, tr thnh...viii 3.4.2 Phng phỏp phỏt hin SCMV bng k thut ELISA 24 3.4.3.1 Phng phỏp chun b mu v b trớ thớ nghim .24 3.4.3.2 Phỏt hin bnh khm lỏ mớa bng k thut ELISA 26 3.4.3 Phng phỏp nhn dng bnh cn mớa gc trờn ng rung 27 3.4.4 Phng phỏp phỏt hin vi khun Lxx bng kớnh hin vi v bng phng phỏp nhum STM ... 7 Hỡnh 2.4 Sugarcane mosaic virus 8 Hỡnh 2.5 C ch phn ng i mu trong DAS- ELISA 12 Hỡnh 2.6 Lxx gõy nhng vt chuyn mu thõn mớa 15 Hỡnh 2.7 Vi khun Leifsonia xyli subsp xyli di kớnh hin vi in t (x30.000 ln) (K E Damann, 2002) 16 Hỡnh 4.1 Kt qu chn oỏn SCMV qua quan sỏt s i mu trờn a ELISA 32 Hỡnh 4.2 Vi khun Lxx di kớnh hin vi ( phúng i 1000 ln) 34 Hỡnh 4.3 Mu thõn... b v em sy 80OC trong 60 phỳt trc khi em nhum bng phng phỏp EIA/TBIA Cỏc phn ng dng tớnh c nhn din bng cỏc m mu xanh m trờn mng Evaporative - binding Enzym Linked immunosorbent assay (EB - ELISA) Phng phỏp EB - ELISA do Croft v ctv a ra nm 1994 chn oỏn RSD Dch chit nc mớa thu c ly tõm 3000 vũng trong 15 phỳt hay 13000 vũng trong 5 phỳt Dch ni c loi b v tỏi huyn phự phn cn lng bng 550 l dch m Mu phõn . tôi đã thực hiện đề tài Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR”. Đề. SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn