PHÁT HIỆN LAWSONIA INTRACELLULARIS TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTEDPCR Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ Thú y

Có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy như thời tiết thay đổi đột ngột, vệ sinh chăm sóc kém, do heo mẹ mắc bệnh trong thời gian mang thai và sau khi sinh, do hệ vi sinh vật đường ru

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y

*************************

LÊ HUỲNH PHƯƠNG DUNG

PHÁT HIỆN LAWSONIA INTRACELLULARIS TRÊN HEO

BẰNG KỸ THUẬT NESTED-PCR

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ Thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS NGUYỄN ĐÌNH QUÁT BSTY PHÙNG HỮU PHƯỚC

Tháng 08/2012

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Lê Huỳnh Phương Dung

Tên khóa luận tốt nghiệp: “Phát hiện Lawsonia intracellularis trên heo

bằng kỹ thuật nested-PCR ”

Đã hoàn thành khóa luận theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các

ý kiến nhận xét cũng như đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp 2007 - 2012

ngày 16 tháng 08 năm 2012

Giáo viên hướng dẫn

LỜI CẢM TẠ

Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến công ơn sinh thành, dưỡng dục và hy sinh của Ba Mẹ đã tận tụy lo cho con đến ngày hôm nay, cùng những người thân luôn yêu thương, giúp đỡ và động viên con trong những năm qua

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

TS Nguyễn Đình Quát và BSTY Phùng Hữu Phước đã hết lòng giảng dạy, hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo tôi suốt thời gian thực tập và hoàng thành luận văn tốt nghiệp

Luôn ghi nhớ và cảm ơn

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Xin chân thành cảm ơn

Ban giám đốc và các anh chị Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình tực tập tốt nghiệp

Cảm ơn tập thể lớp DH07TY đã cùng chung sức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp

Sinh viên

Lê Huỳnh Phương Dung

Mục đích: Xác nhận sự hiện diện của Lawsonia intracellularis trên heo sau

cai sữa đến hạ thịt được mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm

Tp Hồ Chí Minh để có thêm thông tin về dịch bệnh

Phương pháp nghiên cứu : chúng tôi tiến hành thu thập được 144 mẫu bệnh phẩm (gồm 45 mẫu ruột và 99 mẫu phân) từ những heo bị tiêu chảy nghi do

Lawsonia intracellularis

Kết quả thu được như sau :

Triệu chứng lâm sàng : biếng ăn, chậm tăng trưởng trong nhiều tuần, tiêu chảy, phân hơi lỏng có màu như bột xi măng ướt Bệnh tích đại thể gồm có biểu mô tăng sinh và sưng dày, viêm nhẹ trên bề mặt niêm mạc Bệnh tích vi thể có sự thoái hóa của lông nhung, bề mặt niêm mạc hồi tràng thoái hóa, fibrin bao phủ hồi tràng

Quy trình nested-PCR đã được tối ưu hóa :

(1) 94 0C : 5 phút (2) 94 0C : 45 giây

57 0C : 45 giây x 35 chu kỳ

72 0C : 30 giây (3) 72 0C : 10 phút

Tỷ lệ mẫu phân và mẫu ruột dương tính với L intracellularis bằng kỹ thuật

nested-PCR tương ứng là 34,34 % và 37,78 %

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Bệnh tăng sinh đường ruột (Proliferative enteropathy-PE; Ileitis) 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Lịch sử và nguyên nhân gây bệnh 3

2.1.3 Căn bệnh 4

2.1.4 Truyền nhiễm học 5

2.1.5 Triệu chứng 6

2.1.6 Bệnh tích 7

2.1.7 Chẩn đoán 9

2.1.8 Điều trị 9

2.1.9 Phòng bệnh 10

2.2 Giới thiệu về kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 10

2.2.1 Khái niệm kỹ thuật PCR 10

2.2.2 Lịch sử 10

2.2.3 Nguyên tắc của phương pháp PCR 11

2.2.4 Primer (đoạn mồi) 12

2.2.5 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR 13

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 14

2.2.7 Các hạn chế của PCR 16

2.2.8 Giá trị sử dụng của PCR 16

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật nested-PCR (nPCR) 17

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.1.1 Thời gian 18

3.1.2 Địa điểm 18

3.2 Đối tượng khảo sát 18

3.3 Nội dung thực hiện 18

3.4 Vật liệu, nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm 18

3.4.1 Vật liệu 18

3.4.2 Nguyên liệu dùng cho phản ứng nested-PCR 19

3.4.3 Hóa chất 19

3.5 Phương pháp nghiên cứu 20

3.5.1 Số mẫu khảo sát 20

3.5.2 Phương pháp ghi nhận triệu chứng lâm sàng 21

3.5.3 Phương pháp ghi nhận bệnh tích đại thể 21

3.5.4 Quy trình cắt mẫu vi thể 21

3.5.5 Thiết kế kỹ thuật nested – PCR để phát hiện L intracellularis 23

3.5.5.1 Quy trình tách chiết DNA theo bộ Kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Mỹ) 23

3.5.5.2 Quy trình thực hiện nested-PCR đối với L intracellularis 25

3.6 Công thức tính 27

4.1 Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và vi thể bệnh do L intracellularis 28

4.1.1 Triệu chứng lâm sàng 28

4.1.2 Bệnh tích đại thể 30

4.1.3 Bệnh tích vi thể 31

4.2 Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR để phát hiện L intracellularis 34

4.3 Tỷ lệ mẫu dương tính với L intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR 37

4.3.1 Tỷ lệ mẫu dương tính với L intracellularis trên tổng số mẫu khảo sát 37

4.3.2 Tỷ mẫu dương tính với L intracellularis tại Bệnh Viện Thú Y 37

4.3.3 Tỷ mẫu dương tính L intracellularis trên ổ dịch PRRS 39

4.3.4 Tỷ lệ mẫu dương tính với L intracellularis ở địa bàn khác 40

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 47

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

IPEC-J2 Piglet intestinal epithelial cells-J2

McCoy Mouse fibroblast cells

HBS Hemolytic Bowel Syndrome

PCV2 Porcine Circovirus 2

TGE Transmissible Gastroenteritis

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

cDNA complementary Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

dATP dexoxyadenosine triphosphate

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Số mẫu khảo sát tại Bệnh Viện Thú Y 20 

Bảng 3.2 Số mẫu khảo sát tại các địa bàn khác 20 

Bảng 3.3 Số mẫu khảo sát tại 2 ổ dịch PRRS 20 

Bảng 3.4 Tên các đoạn mồi 25 

Bảng 4.1 Triệu chứng lâm sàng của các heo bị tiêu chảy nghi do L intracellularis. 28 

Bảng 4.2 Bệnh tích đại thể 30 

Bảng 4.3 Bệnh tích vi thể 31 

Bảng 4.4 Kết quả chẩn đoán tổng số mẫu khảo sát bằng kỹ thuật nested-PCR 37 

Bảng 4.5 Kết quả chẩn đoán mẫu ruột bằng kỹ thuật nested-PCR tại Bệnh Viện Thú Y 37 

Bảng 4.6 Kết quả chẩn đoán mẫu phân bằng kỹ thuật nested-PCR tại Bệnh Viện Thú Y 37 

Bảng 4.7 Kết quả chẩn đoán mẫu ruột bằng kỹ thuật nested-PCR 39 

Bảng 4.8 Kết quả chẩn đoán mẫu phân bằng kỹ thuật nested-PCR tại các địa bàn khác 40 

Bảng 4.9 Kết quả chẩn đoán mẫu ruột bằng kỹ thuật nested-PCR tại các địa bàn khác 40 

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Ruột chứa máu tươi hay cục máu 8 

Hình 2.2 Sự tăng sinh của biểu mô 8 

Hình 4.1 Triệu chứng lâm sàng của heo bị tiêu chảy nghi do L intracellularis 29 

Hình 4.2 Màu phân heo bị tiêu chảy nghi do L intracellularis 29 

Hình 4.3 Đoạn hồi tràng dày lên Hình 4.4 Niêm mạc ruột tăng sinh 30 

Hình 4.5 Viêm hồi tràng, lông nhung thoái hóa và có vài đốm xuất huyết (100X) 32  Hình 4.6 Một vài tế bào vi khuẩn nằm trong tế bào chất của tế bào biểu mô trong mào ruột (1000X) 32 

Hình 4.7 Tiết chất viêm có nhiều bạch cầu che phủ niêm mạc, lông nhung hư hại nhẹ (200X) 33 

Hình 4.8 Viêm hồi tràng có tiết chất sợi huyết, nhiều bạch cầu Có lớp hoại tử bao phủ bề mặt (200X) 33 

Hình 4.9 Kết quả chẩn đoán L intracellularis bằng kỹ thuật PCR thông thường 34 

Hình 4.10 Kết quả nested-PCR chạy thử nghiệm nhiệt độ annealing ở 54 0C 35 

Hình 4.11 Kết quả nested-PCR chạy thử nghiệm nhiệt độ annealing ở 51 0C 35 

Hình 4.12 Kết quả nested-PCR chạy thử nghiệm nhiệt độ annealing ở 48 0C 36 

Hình 4.13 Kết quả chạy thử nghiệm nhiệt độ annealing ở 57 0C 36 

Hình 4.14 Kết quả chẩn đoán L intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR tại Bệnh Viện Thú Y (Ghi chú: L = ladder Các mẫu 1 đến 10 các mẫu tại Bệnh Viện Thú Y dương tính với L Intracellularis 38 

Hình 4.15 Kết quả chẩn đoán L intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR tại ổ dịch PRRS ( Ghi chú: L = Ladder Các mẫu 1, 2 dương tính tại ổ dịch PRRS) 39 

Hình 4.16 Kết quả chẩn đoán L intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR tại trại khác (Ghi chú: L = ladder; các mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11 dương tính; mẫu 6 âm tính) 41 

Một trong những bệnh ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi heo là bệnh tiêu chảy Tiêu chảy là bệnh xảy ra phổ biến trên heo, bệnh xảy ra trên heo ở mọi lứa tuổi, nhưng trầm trọng ở giai đoạn heo cai sữa do heo mới sinh ra hệ vi sinh vật đường ruột và hệ thống miễn dịch của heo con phát triển chưa toàn diện Hậu quả làm chết heo, làm giảm khả năng tăng trưởng, tăng tỷ lệ còi cọc và gây tổn thất về kinh tế cho các nhà chăn nuôi Có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy như thời tiết thay đổi đột ngột, vệ sinh chăm sóc kém, do heo mẹ mắc bệnh trong thời gian mang thai và sau khi sinh, do hệ vi sinh vật đường ruột gây bệnh, do vi khuẩn,

do cầu trùng, virus… Trong những nguyên nhân kể trên thì tiêu chảy do vi khuẩn

nội bào Lawsonia intracellularis gây ra là một bệnh đang được quan tâm nghiên

cứu hiện nay

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tìm hiểu về tình

hình lây nhiễm và ảnh hưởng của Lawsonia intracellularis trên heo, nhưng ở Việt

Nam chưa có công trình nghiên cứu nào báo cáo về tình hình lây nhiễm cũng như

ảnh hưởng của Lawsonia intracellularis được công bố Vậy Lawsonia

intracellularis đã xuất hiện ở Việt Nam chưa? Tỷ lệ lây nhiễm là bao nhiêu? Ảnh

hưởng của nó đến đàn heo như thế nào ? Xuất phát từ thực tế trên , được sự đồng

ý của Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, dưới

sự hướng dẫn của TS Nguyễn Đình Quát và BSTY Phùng Hữu Phước chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phát hiện Lawsonia intracellularis trên heo bằng kỹ

Ghi nhận triệu chứng lâm sàng của các heo bị bệnh tiêu chảy nghi do

Lawsonia intracellularis được mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y Trường ĐH Nông

Cắt mẫu vi thể các mẫu ruột lấy từ những heo được mổ khám

Thử nghiệm quy trình nested-PCR để phát hiện Lawsonia intracellularis.

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Bệnh tăng sinh đường ruột (Proliferative enteropathy-PE; Ileitis)

2.1.1 Khái niệm

Là bệnh truyền nhiễm trên heo do vi khuẩn nội bào bắt buộc Lawsonia intracellularis (L intracellularis) gây nên biểu hiện bằng sự dày lên của niêm mạc

ruột non và thỉnh thoảng ở ruột già (Rowland và Lawson, 1992) Heo mắc bệnh có

vẻ nhợt nhạt, chậm tăng trưởng, tiêu chảy, ruột bị hoại tử (NE), viêm hạch ruột của heo (PIA) và làm xuất huyết tăng sinh ở ruột (PHE) (Lawson và Gebhart, 2000)

2.1.2 Lịch sử và nguyên nhân gây bệnh

Bệnh xảy ra và ảnh hưởng đến hệ thống chăn nuôi heo trên toàn thế giới, đặc biệt trong đàn gia súc khỏe, ảnh hưởng đến heo sau cai sữa, heo lứa, heo gần xuất chuồng, heo hậu bị (Lawson và Gebhart, 2000)

PE được mô tả như là một bệnh đường ruột quan trọng trên heo cách đây hơn

70 năm Những đặc trưng của PE tìm thấy ở heo được mô tả đầu tiên bởi Beister và Schwarte vào năm 1931 (Beister H và Schwarte L, 1931)

Cho đến thập niên 1970 vi khuẩn nội bào được tìm thấy bên trong những tế bào hẻm tuyến (crypt cells) đang tăng sinh trong những trường hợp PHE ở heo

(Rowland và ctv, 1973) Một số loài Campylobacter có đặc tính hình thái tương tự

L intracellularis được phân lập từ những bệnh tích của PE Những loài đó bao gồm Campylobacter mucosalis, C hyointestinalis, C jejuni and C coli Tuy nhiên , những loài vi khuẩn Campylobacter này không gây bệnh tích PE đặc hiệu khi gây

bệnh thực nghiệm (Kashiwazaki và ctv, 1971; McCartney và ctv, 1984)

Đầu tiên các nhà khoa học đặt tên là vi khuẩn giống Campylobacter Sau đó

vi khuẩn nội bào được đưa tên là Lleal Symbiont (IS) intracellularis và được coi như là một loài riêng biệt khác với loài Campylobacter (Gebhart và ctv, 1993) Tên

L intracellularis được đặt cho sinh vật một cách trang trọng vào năm 1995 trong

vinh dự của nhà khoa học người Scottish, Lawson là người khám ra vi khuẩn này

2.1.3 Căn bệnh

Phân loại

L intracellularis là một vi khuẩn nội bào bắt buộc gây ra bệnh tăng sinh

đường ruột ở nhiều loài động vật có vú, đặc biệt là heo (Lawson và Gebhart, 2000)

L intracellularis là một thành viên của nhóm delta của Proteobacteria

(Gebhart và ctv 1993) và phân biệt rõ ràng từ những tác nhân gây bệnh trong tế bào khác (McOrist và ctv, 1995a)

Đặc điểm hình thái, cấu trúc

L intracellularis là vi khuẩn Gram (-), vi hiếu khí, sống nội bào bắt buộc,

không có lông roi, không tạo bào tử, hình thái cong hoặc que dạng chữ S (Lawson

Đặc điểm nuôi cấy

Hiện tại, sự phát triển của L intracellularis trong môi trường nuôi cấy thông

thường hay môi trường canh vẫn chưa thành công Bởi vậy, sự nuôi cấy vi khuẩn này chỉ phát triển trên tế bào nhân thật chuyên biệt bao gồm tế bào biểu mô ruột của chuột (IEC-18), tế bào ruột thai người (Int 407), tế bào thận heo (PK-15) (Lawson

và ctv, 1993), tế bào biểu bì ruột heo con (IPEC-J2) (McOrist và ctv, 1995a)

Môi trường thích hợp dùng cho nuôi cấy vi khuẩn L intracellularis trên tế

bào là DMEM với sự bổ sung 5 - 10 % huyết thanh bò

2.1.4 Truyền nhiễm học

Loài vật mắc bệnh

PE thường được tìm thấy nhiều nhất ở lợn, tuy nhiên nó cũng được mô tả ở chuột bạch (Frisk và Wagner, 1977), chồn (Fox và Lawson, 1988), thỏ (Fox và ctv, 1994), cáo (Eriksen và Landsverk, 1985), chó (Collins và ctv, 1983), chuột Vandenburghe và ctv, 1985), ngựa (Williams và ctv, 1996), cừu (Chalmers và ctv, 1990), hưu, nai (Drolet và ctv, 1996), đà điểu sa mạc Úc (LeMarchand và ctv, 1995), đà điểu Châu Phi (Cooper và ctv, 1997), linh trưởng (Klein và ctv, 1999), chuột lang (Elwell và ctv, 1981)

Mặc dù có mặt ở khắp nơi trong thiên nhiên, L intracellularis chưa bao giờ được phát hiện ở người trong các bệnh đường ruột Bởi vậy mà L intracellularis

gây bệnh PE không được xem là một bệnh truyền lây từ động vật sang người (McOrist và ctv, 2003)

Cách sinh bệnh

Theo Phạm Ngọc Thạch: vi khuẩn có thể sinh sản trong tế bào 7 - 14 ngày và

có thể tồn tại bên ngoài tế bào cho đến hai tuần trong điều kiện 5 0C nhưng không thể nhân lên Vi khuẩn thuần tự nhiên có thể gây ra tất cả các thể bệnh Vi khuẩn xâm nhập các tế bào màng ruột non, thông thường là phần cuối của ruột non và đôi khi ở ruột già, nhân lên, tạo ra các tế bào non, chưa trưởng thành xuất hiện ra bên ngoài, làm mất khả năng hấp thu của các lông nhung và khuyến khích các hố ngăn cách dài ra, do đó làm cho niêm mạc ruột không thể hấp thụ, làm cho tại các khu vực bị nhiễm bệnh dày lên và có nhiều chỗ sưng lên Viêm xảy ra làm mất máu và các tế bào biểu bì của ruột non bị nhiễm bệnh Như vậy để bù lại cho niêm mạc ruột non, màng nhầy dày lên và có thể bị phá vỡ và trở thành hoại tử như trong bệnh viêm ruột hoại tử, cuối cùng dẫn đến tăng sinh của lớp cơ bên dưới trong khu vực ruột bị tăng sinh Việc phá vỡ nhanh có thể gây ra mất máu lớn đổ vào hồi tràng gây

ra hiện tượng xuất huyết tăng sinh đường ruột (PHE) Những con heo còn lại sẽ

miễn dịch với bệnh (Trích dẫn: Bệnh viêm ruột hoại tử ở heo, Phạm Ngọc Thạch,

2011)

2.1.5 Triệu chứng

Triệu chứng lâm sàng thường thấy trong thời gian gần đây ở heo cai sữa và kéo dài đến khoảng 6 tuần, có thời gian ủ bệnh 3 - 6 tuần và có thể gây bệnh cho gia súc ở mọi lứa tuổi Các triệu chứng đầu tiên là không tăng cân hoặc giảm trọng lượng, do heo kém ăn Heo bệnh có vẻ nhợt nhạt, có thể nôn mửa, thiếu máu và có thể

có phân đen do sự hiện diện của máu bị đổi thành màu đen Một số con heo trong phân

có hạt lợn cợn, chúng phân bố đều khắp đặc biệt giống như bột xi măng ướt, đặc biệt là nơi nhiễm trùng thấy có xoắn khuẩn hiện diện Sau 4 - 6 tuần bị ảnh hưởng heo có thể hồi phục hoàn toàn Một số chết đột ngột ở giai đoạn này với hiện tượng ruột bị tăng sinh và xuất huyết nhanh Thông thường heo bị nhợt nhạt, nhiệt độ cơ thể thấp (37,8 0C, 100 0F) 1 - 2 giờ trước khi chết và có thể thấy ở mọi lứa tuổi 6 - 10 tuần trở lên Trên những đàn giống, heo có thể chết bất ngờ khi thể xuất huyết tăng sinh (PHE) xâm nhập vào đàn Đàn mới bị nhiễm, có thể 12 % đàn bị mắc bệnh và 6 %

có thể chết Một số con hồi phục vẫn còi cọc Chúng có thể biểu hiện ốm, xanh và

có thể có tiêu chảy (Rowland và Lawson, 1992)

Những trường hợp lâm sàng PIA được nhận thấy ở những con heo sau cai sữa giữa 6 và 20 tuần tuổi Những dấu hiệu nổi bật của PIA bao gồm chứng biếng

ăn, tiêu chảy và chậm tăng trưởng kéo dài trong nhiều tuần Tiêu chảy có thể xuất hiện khi bệnh tích đặc trưng hiện diện, làm cho thể bệnh này của PE rất khó phát hiện Trong những thể gây dịch địa phương PIA, heo sẽ ăn uống bình thường nhưng chậm tăng trưởng Những con heo nhiễm trùng nghiêm trọng thường liên quan đến

sự dày lên niêm mạc hồi tràng ở các mức độ khác nhau hay những bệnh tích hoại tử của ruột non (McOrist và Gebhart, 1999)

Những thể bệnh PHE thường xảy ra ở lợn trưởng thành giữa 4 - 12 tháng tuổi Phân đen giống hắc ín là dấu hiệu lâm sàng phổ biến đầu tiên; sau đó thì tiêu chảy, phân lỏng, màu hơi đỏ Tuy nhiên một số heo chết mà không có sự bất thường nào về phân Ước lượng rằng khoảng 50 % heo trong đàn chết khi nhiễm thể PHE, nhưng một nửa còn lại sẽ phục hồi sau một thời gian ngắn mà không có những dấu

hiệu rõ ràng của giảm trọng lượng hay dấu hiệu bất thường của thể trạng (McOrist

và Gebhart, 1999)

Thể PE cận lâm sàng có thể là bệnh phổ biến nhất ở lợn đang tăng trưởng, nhưng khó nhận biết vì không có những dấu hiệu lâm sàng đặc trưng Các kỹ thuật

về huyết thanh học hay PCR có thể có hoặc có thể không phát hiện L intracellularis

trong thể PE cận lâm sàn (Rowland và Lawson, 1992)

Có một số bệnh trên đường ruột ở heo mà có dấu hiệu lâm sàng tương tự như

các thể khác nhau của PE như hôi chứng ruột xuất huyết (HSB), bệnh do khuẩn E coli, bệnh Circovirus type 2 (PCV2), chứng viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE), bệnh do Rotavirus, bệnh thương hàn heo và bệnh hồng lỵ heo (Rowland và Lawson, 1992)

Bởi vậy, để phân biệt được các tác nhân gây bệnh này thì điều quan trọng là phải mổ khám để kiểm tra bệnh tích, kết hợp với tiến hành những phương pháp chẩn đoán thích hợp khác để cho kết quả chẩn đoán chính xác hơn

2.1.6 Bệnh tích

Những bệnh tích mô bệnh học phổ biến đối với các thể bệnh PE là sự tăng nhanh u tuyến của biểu mô trong những tế bào hẻm tuyến của ruột non và trong những tuyến nhày của ruột già và bởi sự có mặt của vi khuẩn bên trong những tế bào ruột này Những tế bào hẻm tuyến giãn rộng và kéo dài, chung hàng với những

tế bào biểu mô chưa trưởng thành trong giai đoạn gián phân Những tế bào hình ly thì biến mất trên những tế bào biểu mô bị nhiễm không phải là một bệnh tích phổ biến của PE (McOrist và Gebhart, 1999)

PHE là thể cấp tính của PE gây bệnh tích đặc trưng ở đoạn cuối hồi tràng và kết tràng Dạng này của PE thường xảy ra trên heo trưởng thành từ 4-12 tháng tuổi

và thường được tìm thấy trong những đàn khỏe khi những heo hậu bị được nhập từ

ngoài vào Những bệnh tích của PHE bao gồm ruột sưng và tích dịch (McOrist và Gebhart, 1999)

Ruột chứa máu tươi hay máu cục đông đặc và những cụm fibrin (Hình 2.1) Tuy nhiên không thấy sự viêm loét hay bào mòn biểu mô ruột (Ward và

Winkelman, 1990).

Hình 2.1 Ruột chứa máu tươi hay cục máu (Ward và Winkelman, 1990)

PIA là thể mãn tính và phổ biến nhất của PE Dạng này của PE thì thường được tìm thấy trên những heo sau cai sữa đến xuất chuồng và gây bệnh ở 50 cm phần cuối của hồi tràng đoạn nối với kết tràng (McOrist và Gebhart, 1999)

Những bệnh tích của PIA gồm có biểu mô tăng sinh và sưng dày, viêm nhẹ trên bề mặt niêm mạc (Hình 2.2) (Knittel, 1999)

Hình 2.2 Sự tăng sinh của biểu mô (Knittel, 1999)

Bệnh tích vi thể cho thấy rằng màng nhày được mở rộng với những tế bào hẻm tuyến rẽ nhánh chung với những tế bào biểu bì chưa trưởng thành Những tế bào hẻm tuyến được kéo dài và mở rộng, được lót thêm những tế bào biểu bì chưa trưởng thành dày đặc Fibrin bao phủ quanh hồi tràng Sự tụ lại và thoái hóa lông

tính phổ biến (McOrist và Gebhart, 1999).

2.1.7 Chẩn đoán

Chẩn đoán lâm sàng

Bệnh tăng sinh đường ruột cần được xem xét nếu heo đang phát triển trở thành nhợt nhạt, giảm cân với tình trạng phân đen ở những con heo hiện diện trong chuồng lâu ngày, các dấu hiệu này và những cái chết bất ngờ từ bệnh viêm ruột xuất huyết tăng sinh nhanh, nhưng cũng có thể là do viêm loét dạ dày Bệnh tiêu chảy hoặc phân lỏng không phải là một chỉ báo đáng tin cậy của bệnh nhưng thường xảy

ra Bệnh tăng sinh đường ruột có thể được xác nhận sau khi mổ khám heo bị nhiễm Phần cuối của hồi tràng dày, nhợt và nó làm lớp đệm bên dưới ảnh hưởng hạn chế nếp gấp Các phần của ruột già cũng có thể bị ảnh hưởng Có thể các cục máu bị đông trong ruột và máu đen này xuất hiện khi nó đến ruột già (PHE) Không có hiện tượng loét dạ dày Màng ruột bị bệnh có thể được phủ bằng các mô chết (Rowland

và Lawson, 1992)

Trong nhiều năm, sự chẩn đoán PE ở heo chỉ dựa vào những triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy hay bệnh tích đại thể và vi thể Chẩn đoán lâm sàng khá khó khăn, có thể nghi ngờ khi có tiêu chảy từng hồi, đôi khi xuất huyết, đi cùng với ăn không ngon, gầy yếu Tuy nhiên khi khám tử với bệnh tích bội triển niêm mac ruột, việc chẩn đoán trở nên dễ hơn đôi chút Cần phải phân biệt với bệnh hồng lỵ, bệnh

do Salmonella mãn tính, bệnh lở loét dạ dày, bệnh do độc tố nấm (Rowland và

Lawson, 1992)

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Bệnh tích vi thể

Hóa mô miễn dịch

Phản ứng huyết thanh học như ELISA, IFA

PCR hay nested-PCR

2.1.8 Điều trị

Có thể điều trị bằng kháng sinh như tetracycline, sulphonamide hay tylosin

Có thể dùng tetracycline trộn trong thức ăn 300 – 400 ppm, dùng trong 2 tuần

Kết hợp salinomycine và lincomycin trong nước uống trong 2 tuần khi bắt đầu dịch

Chlotetracyclin kết hợp với sulphamethazine cũng được dùng

2.1.9 Phòng bệnh

Để phòng bệnh cần giới hạn những yếu tố phát triển bệnh: thay đổi chuồng nuôi, những stress, thay đổi dinh dưỡng, nhiệt độ chuồng, mật độ nuôi dẫn đến giảm sức đề kháng của vật nuôi

Kiểm soát chặt chẽ heo mới mua về Đàn nhân giống phải nhập từ đàn gia súc sạch Tiêm phòng có thể ngăn ngừa triệu chứng lâm sàng và làm giảm hoặc

ngăn ngừa nhiễm độc lực L intracellularis Chúng ta không nên sử dụng kháng sinh

mọi lúc

2.2 Giới thiệu về kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.2.1 Khái niệm kỹ thuật PCR

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo

ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E Coli hay nấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục

vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống (nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR)

2.2.2 Lịch sử

Thử nghiệm PCR được một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis phát minh vào năm 1985 Lúc đó Kary Mullis chỉ là một nhà hoá sinh học khá tầm thường, làm việc tại một phòng thí nghiệm cũng không hiện đại mấy Ý tưởng của phát minh này đến trong đầu K Mullis một cách tình cờ khi ông lái xe qua một vùng đồi núi tại bắc California vào một buổi chiều mà trong đầu vẫn cứ miên man suy nghĩ về công trình nhân bản ADN mà ông đang làm tại phòng thí nghiệm, và rồi

thấy rõ hai làn bánh xe mới bị tách khỏi hai làn bánh xe cũ!!.Hình ảnh này chợt làm loé sáng ra trong đầu ông ý tưởng dùng nhiệt độ để làm biến tính sợi đôi DNA thành hai mạch đơn Nhờ đó ông đã phát minh ra thử nghiệm PCR Công trình nghiên cứu này được ông gửi đến tờ Nature nhưng bị từ chối vì ban biên tập cho ông là một tác giả vô danh Do vậy ông gửi bài đến tờ Scientific American và ban biên tập tạp chí khoa học này đã nhận diện được đây là một phát minh lớn, họ đăng tải ngay trong số báo (1985) Vol 253, 34-157 Chỉ một thời gian ngắn sau đó, K Mullis lập tức được nổi tiếng trong giới khoa học thời bấy giờ vì đã thực hiện được ước mơ của nhiều nhà khoa học thời đó là nhân bản được DNA trong ống nghiệm

mà không cần phải nhờ đến các tế bào chủ như vi khuẩn hay nấm men, đồng thời

mở ra được rất nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng Tám năm sau, phát minh này đã đem lại cho tác giả một nữa giải Nobel hóa học (1993) Có thể nói trong lịch sử khoa học, hiếm có một nhà khoa học nào có được một kỳ tích như vậy: Đạt được giải Nobel chỉ 8 năm sau phát minh!! Mà quả thật kỳ tích này cũng rất xứng đáng, vì PCR chính là một công cụ cách mạng nhất trong nghiên cứu và ứng dụng y sinh học (Phạm Hùng Vân, 2009)

2.2.3 Nguyên tắc của phương pháp PCR

Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của enzyme polymerase trong qua trình tổng hợp DNA từ mạch khuôn Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung

Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi AND mới giống chuỗi AND gốc

(1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn

càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không

thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR

càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu

(11) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng

hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3', (là đầu mà

nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi

Thông thường trong phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi, gọi là

primer set, trong đó có một mồi lên gọi là up-stream primer và một mồi xuống gọi

là down-stream prime Cặp mồi này quyết định nên kích thước của sản phẩm PCR

Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm

PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu thì kích thước càng nhỏ bấy nhiêu (http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=9925)

2.2.5 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR

DNA mẫu

Mồi xuôi và mồi ngược

4 dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) cung cấp năng lượng và base trong quá

trình phản ứng

Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2, Taq polymerase

Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp 1 mạch DNA mới từ khuôn

đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt

Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu

3’ của mạch khuôn DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới

Mồi xuôi và mồi ngược có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của một

trình tự DNA Mồi xuôi (forward primer: F) tác động lên dây DNA theo chiều 3’

5’ Mồi ngược (reserve primer: R) tác động lên dây DNA theo chiều 5’  3’ Phản

ứng PCR sẽ nhân bản trình tự DNA nằm giữa hai mồi ấy (Hồ Huỳnh Thùy Dương,

1998)

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu thập từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao hơn Hơn nữa việc giảm mẫu ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Enzyme

Taq polymerase (DNA polymerase) là enzyme chịu nhiệt được tách chiết từ

vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt

độ biến tính và xúc tác từ đầu đến cuối quá trình phản ứng Nồng độ Taq quá cao có thể tham gia vào việc làm sai lệch các kết quả Ngược lại, nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Mồi primer và nhiệt độ lai

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng

và có hiệu quả cao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của kỹ thuật PCR và phải tuân theo một số nguyên tắc:

Trình tự mồi chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi”

và mồi “ngược” và có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của mồi

Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không tách biệt nhau quá xa Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp C-G lặp đi lặp lại nhiều lần

Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không nên quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu hóa khi đoạn gen được tổng hợp có kích thước nhỏ hơn 1 Kb (Hồ

Các thành phần khác của phản ứng PCR

Deoxynucleoside triphosphate (dNTPs)

Bốn dNTPs được sử dụng cho PCR khoảng chừng 100 mM/mồi nucleotide bao gồm: dATP (dexoxyadenosine triphosphate), dCTP (dexoxycytosine triphosphate), dGTP (dexoxyguanosine triphosphate), dTTP (dexoxythimine triphosphate)

Tuy nhiên nồng độ dNTPs phụ thuộc vào:

Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Phản ứng PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ qua hai giai đoạn: Giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả giảm hẳn vì nhiều nguyên nhân:

Sự phân hủy và cạn kiệt của các thành phần phản ứng

Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng

Các bản sao vừa được tổng hợp không kết với mồi mà bắt cặp với nhau

Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng

Thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt

độ thật nhanh và chính xác Tuy nhiên, vì mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên một loại thiết bị Ống nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một nghiên cứu phải cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo

nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuếch đại (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Sự ngoại nhiễm cũng được đề cập vì nó gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của kỹ thuật này Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán dự phòng vì hậu quả có thể rất ngiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất có thể là những sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước Người ta đã chứng minh rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ làm cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết

bị và dụng cụ trong phòng thí nghiệm…Rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau

đó

Các sai sót do Taq polymerase gây ra Việc sao chép bởi Taq polymerase cho

tỷ lệ sai số khá cao 10-4 (nghĩa là cứ 1000 nucleotide thì enzyme sẽ gắn sai 1 nucleotide) Vì vậy ta phải xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại Điều này có ý nghĩa rất lớn nếu cần xác định trình tự nuleotide của DNA

2.2.8 Giá trị sử dụng của PCR

Kỹ thuật này có ý nghĩa rất lớn vì:

Thời gian thực hiện nhanh, chỉ mất khoảng 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA cần quan tâm

Đơn giản và ít tốn kém do được thực hiện trong các ống plastic nhỏ gồm các thành phần tối thiểu được sử dụng

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật nested-PCR (nPCR)

Kỹ thuật nPCR được phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR Trong kỹ thuật này, có 2 cặp mồi khác nhau được sử dụng nhưng chỉ để nhằm khuếch đại đặc hiệu một đoạn gen và phản ứng PCR phải được thực hiện 2 lần Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ nhất Cặp mồi thứ nhất ở lần chạy PCR thứ nhất, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định và đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần 1 Sản phẩm của PCR lần 1, sau đó sẽ là mẫu của PCR lần

2 Cặp mồi thứ 2 sẽ bắt cặp phía trong (nested) của sản phẩm của PCR lần 1 Sản phẩm PCR lần 2 sau đó sẽ khuếch đại đoạn gen cần xác định Kỹ thuật nPCR gia tăng độ nhạy của phản ứng nhờ tổng số chu kỳ được thực hiện nhiều hơn Độ đặc hiệu của nPCR gia tăng là do sự bắt cặp của primer thứ 2 chỉ xảy ra chủ yếu với đoạn gen được nhân lên bởi phản ứng PCR thứ nhất

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian

Nghiên cứu được tiến hành từ ngày 01/02/2012 đến 15/07/2012

3.1.2 Địa điểm

Bệnh viện thú y Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Đối tượng khảo sát

Trên heo sau cai sữa đến hạ thịt bị tiêu chảy nghi do L intracellularis

3.3 Nội dung thực hiện

1 Khảo sát triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và bệnh tích vi thể do

L intracellularis gây ra

2 Xây dựng quy trình nested-PCR để phát hiện L intracellularis trên những

heo được mổ khám

3 Xác định tỷ lệ dương tính với L intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR

3.4 Vật liệu, nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm

3.4.1 Vật liệu

Dụng cụ lấy mẫu: dao mổ (cán số 4), kéo cắt mô, kẹp mô, găng tay y tế, khẩu

trang (face mask), ủng, áo blouse

Dụng cụ đựng mẫu: túi nylon hoặc hũ đã được hấp khử trùng để chứa phân

và ruột heo khi lấy mẫu

Dụng cụ bảo quản mẫu: thùng đá và tủ lạnh Thùng đá dùng để bảo quản

mẫu từ nơi lấy mẫu về phòng thí nghiệm, tủ lạnh bảo quản mẫu phải luôn được giữ

ở -20 0C

Máy chụp hình để ghi lại bệnh tích đại thể và bệnh tích vi thể

Dụng cụ phòng thí nghiệm dùng để chẩn đoán L intracellularis ống

eppendorf (1,5 ml), giá đỡ eppendorf, micropipette các loại 0,5-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl, đầu côn 10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl, găng tay, hộp nhựa, ống nghiệm, giấy paraffin

Thiết bị phòng thí nghiệm để chẩn đoán L intracellularis: tủ sấy khô, water

bath 65 0C, bể ủ nhiệt khô 37 0C, máy ly tâm, cân điện tử, thiết bị khuếch đại DNA, bồn diện di, máy đọc gel, máy chụp ảnh

3.4.2 Nguyên liệu dùng cho phản ứng nested-PCR

Được cung cấp bởi hãng Promega (Mỹ), bao gồm:

Các cặp mồi dùng để chẩn đoán L intracellularis

Taq DNA polymerase xúc tác cho quá trình tái bản DNA từ bản mẫu đã bắt cặp với mồi có sự hiện diện của MgCl2.

4dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) cung cấp năng lượng và base trong quá trình phản ứng

MgCl2, dung dịch đệm PCR

Thang chuẩn

3.4.3 Hóa chất

Hóa chất dùng cho chiết tách DNA

Dung dịch đệm ly giải Nuclei Lysis Solution, dung dịch RNase, dung dịch Protein Precipitation Solution, isopropanol, ethanol 70 %, dung dịch DNA

Rehydration Solution

Hóa chất dùng cho nested-PCR

Nước không chứa nuclease, Green God Taq Master Mix, 2X, thang chuẩn,

loading dye buffer

Hóa chất dùng pha TBE và điện di

EDTA, ethidium bromide 50mg/ml, acid boric, nước cất 2 lần, thạch agarose