Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của nấm

Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của nấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN NHƢ NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC KHÓA: 28 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana ACCOSIATED WITH INSECT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY PROFESSOR STUDEN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC TERM: 28 HCMC 9/2006 iii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.  ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  TS. Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hƣng đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. TĨM TẮT Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên cơn trùng gây hại ” đƣợc thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005 tại trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trần Nhƣ Ngọc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Võ Thị Thu Oanh Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thƣờng của cơn trùng dẫn đến cơn trùng bị chết khơ Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt cơn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản xuất nơng nghiệp . Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian trên một số cơn trùng gây hại . 2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 liên quan đến tính độc của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana 3. Sau khi thực hiện phản ứng PCR ta sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng IST1-5.8S-IST2 của nấm Beauveria bassiana và vùng Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae 4. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1.Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trên mơi PGA: Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA(Potato-Glucose-Agar),kết quả chúng tôi đã thu đƣợc một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy : RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6 ,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 . 2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trƣờng lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu đƣợc sinh khối nấm ,rửa lại với nƣớc cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi đƣợc nấm ở dạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -800C cho đến khi sử dụng . 3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích đƣợc DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA của các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ đƣợc DNA của 12 mẫu nấm. 4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết quả thu đƣợc sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria 5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6 dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR .kếtquả chƣa nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dòng nấm do mức độ tƣơng đồng giữa các dòng nấm khá cao .Tuy nhiên thu đƣợc kích thƣớc các band trên gel so với Ladder là hoàn toàn trùng khớp với kích thƣớc band DNA chuẩn của các dòng nấm Beauveria . MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ . iii Tóm tắt . iv Mụclục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách các bảng . x Danh sách các hình xi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1.Đặt vấn đề 1 1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài . 1 1.2.1.Mục đích 1 1.2.2.Mục tiêu 2 1.3.Yêu cầu nghiên cứu . 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1.Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học 3 2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh 4 2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae 5 2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille . 6 2.3.Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm nấm . 8 2.4.Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm 9 2.5.Hoạt tính sinh học 11 2.6.Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc . 11 2.6.1.Nghiên cứu trong nƣớc . 11 2.6.2.Nghiên cứu ngoài nƣớc 12 2.7.Vai trò của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 14 2.8.Phản ứng PCR . 14 2.8.1.Giới thiệu chung về PCR 14 2.8.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả PCR . 15 2.8.3.Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR 16 2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR . 16 2.9. Đọc trình tự bằng máy đọc tự động 17 2.10.Phân tích RFLP . 17 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1.Thời gian và địa điểm 19 3.1.1.Thời gian 19 3.1.2.Địa điểm 19 3.2. Vật liệu và hóa chất 19 3.2.1.Vật liệu . 19 3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm . 19 3.2.1.2.Các Primer dùng trong thí nghịêm . 19 3.2.2.Hóa chất và môi trƣờng . 19 3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm . 19 3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di 20 3.2.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR . 20 3.2.2.4.Môi trƣờng . 20 3.2.3.Các thiết bị chính 21 3.3.Nôi dung nghiên cứu . 21 3.4.Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.4.1.Phục hồi các chủng nấm . 21 3.4.2.Chủân bị môi trƣờng lỏng . 22 3.4.3.Phƣơng pháp ly trích DNA . 22 3.4.4.Phƣơng pháp tinh sạch DNA 23 3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR . 24 3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae . 24 3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille . 25 3.4.6.Điện di và đọc kết quả . 26 3.4.6.1.Điện di trên gel agarose 26 3.4.6.2.Đọc kết quả điện di 26 3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27 3.4.7.1.Tinh sạch sản phẩm PCR 27 3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27 3.4.8.Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự 28 3.4.9.Điện di và ghi nhân kết quả . 29 3.4.10. Phân tích RFLP . 29 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1. Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm 30 4.2. Kết quả ly trích DNA . 30 4.3. Kết quả tinh sạch DNA 32 4.4. Kết quả PCR . 33 4.5. Kết quả phân tích RFLP . 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1.Kết luận . 36 5.2.Đề nghị 36 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium 9 Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh trên ong 13 Hình 4.1 Nấm Beauveria và Metarrhizium 30 Hình 4.2 Kết quả ly trích . 31 Hình 4.3 Kết quả tinh sạch 32 Hình 4.4:Kết quả PCR . 34 Hình 4.5:Kết quả phân tích RFLP . 35 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4 SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1 RNBT1.7 : Rầy nâu Bến Tre 1.7 DONG3.1 : Dòng 3.1 BXĐTG6 : Bọ xít đen Tiền Giang 6 RMTĐ3 : Rầy mềm Thủ Đức 3 PULQ2 : Rệp vải mềm nâu tím Quận 2 SR : Sâu róm BRVT6 : Bọ rầy Vũng Tàu 6 BHBD6 : Bọ hà Bình Dƣơng 6 PM : pico mol Ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base CZA : Czapek – Dox SDS : Sodium dodecyl sulphate PGA : Potato glucose agar SDA : Soduim dedocyl sulphate RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature PCR : Polymerase Chains Reaction RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid ITS : Intenal Transcribed Spacer Taq : Thermus aquaticus TAE : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat TE : Tris ethylene diamine tetra acetate ix [...]... lý yếu tố di truyền trong gen (Viện Lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long )….Đây chính là những thành tựu trong lĩnh vực Bảo Vệ Thực Vật nói chung và của Cơng nghệ Sinh học nói riêng Chính vì tính chất quan trọng của ngành Bảo Vệ Thực Vật (cũng nhƣ Cơng Nghệ Sinh Hoc) trong Nơng Nghiệp và đời sống, nên chúng tơi đã thực hiện đề tài Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Metarrhizium... xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây độc nhằm tạo ra đƣợc thuốc trừ sâu sinh học có hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong cơng tác bảo vệ thực vật hiện nay 2 1.2.2 Mục tiêu Bằng kỹ thuật RFLP và đọc trình tự cho phép xác định gen Pr1 và vùng gen ITS1 - 5.8S - ITS2 sau đó tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1 giữa các dòng nấm. .. Beauveria bassiana trên một số sâu hại cây trồng 2 Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện gen liên quan tới tính độc của 2 chủng nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1) và Beauveria bassiana, vùng ITS1 -5.8S – ITS2 3 Xác định tính đa dạng di truyền của gen Pr1 và gen ITS1 - 5.8S - ITS2 trên nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana vuille bằng phƣơng pháp RFLP và phƣơng pháp giải trình tự (Sequencing)... nucleotide của vùng gen ITS1- 5.8S -ITS2 giữa các dòng nấm Beauveria bassiana 1.2.3 u cầu nghiên cứu Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana từ nhiều cây trồng khác nhau Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana bằng phƣơng pháp PCR Sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa. .. nghiên cứu trên thế giới về nấm đƣợc áp dụng, một số kỹ thụât đƣợc áp dụng trong 8 nhận di n nấm Beauveria bassiana vuille những nghiên cứu gần đây là :sử dụng Isozymes (St Legent et al , 1992;Poprawski et al ,1998), rRNA (Rakotonirainy et al ,1991), phân tích RFLP Sequences (Kosir,Macpherson và Khatchatourians.,1991 ; Maurer et al ,1997) Trong đó vịêc áp dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với PCR cho kết... thể cơn trùng Sự phát tán có hiệu quả cao hay khơng ở mức độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào 2.5 Hoạt tính sinh học - Các nấm di t sâu cũng đƣợc chú ý nhiều nhƣ một sinh vật sản sinh các enzyme, toxin và các chất hoạt tính sinh học khác Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết các nấm Muscardine(ví dụ: nấm Muscardine trắng: Beauveria bassiana ,nấm Muscardine xanh: Metarrhizium... cao nấm men và muối khống thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 109 bào tử/gam Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lƣng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 108 bào tử/ml Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm - Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nòi nấm có hiệu lực di t... đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn Nấm gây bệnh cho cơn trùng có mặt ở trong cả 4 lớp nấm: nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất tồn Deurteromycetes - Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: trong lớp nấm này, các lồi ký sinh trên cơn trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales Đặc biệt có những họ nấm gồm tất cả các lồi đều là ký sinh... Lớp nấm túi Ascomycetes: trong lớp nấm túi có bộ Laboubiniades là những nấm ngoại ký sinh cơn trùng có chun tính cao, còn các lồi nấm túi khác đều là nội ký sinh của cơn trùng Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho cơn trùng là: Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales) - Lớp nấm đảm Basidiomycetes: trong lớp nấm đảm chỉ ở hai giống có các lồi gây bệnh trên cơn trùng, đó là giống Septobasidium và Uredinella... những bệnh di truyền, đƣợc sử dụng trong điều tra tội phạm để xác định những ngƣời bị tình nghi ở cấp độ phân tử, đƣợc sử dụng trong xác địnhquan hệ quyết thống và là một cơng cụ hữu hiệu trong việc giải trình tự các bộ gen ngƣời 2.8.4 Những hạn chế của phƣơng pháp PCR - Trừ vài trƣờng hợp rất cá biệt, phƣơng pháp PCR khơng hoạt động đƣợc với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb Việc sử dụng PCR đối với các độ . HỌC ***000*** TRẦN NHƢ NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH. ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH