Bước đầu ứng dụng kỹ thuật southern Blot phân tích đa dạng di truyền nấm

Bước đầu ứng dụng kỹ thuật southern Blot phân tích đa dạng di truyền nấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐẶNG TRẦN ANH THƢ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐẶNG TRẦN ANH THƢ KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  POPULATION STRUCTURE OF Magnaporthe grisea EXAMINED INITIALLY BY SOUTHERN BLOT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student LE DINH DON DANG TRAN ANH THU TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM TẠ  TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh. Thầy Nguyễn Đức Sáng đã giúp đỡ tôi về hóa chất và vật liệu nghiên cứu trong thời gian làm đề tài. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận. Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập. CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN Cha Mẹ, các em và người thân trong gia đình đã ủng hộ và hỗ trợ con về mặt vật chất cũng như tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa học này. TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006 Đặng Trần Anh Thư ii TÓM TẮT KHÓA LUẬN  ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”. Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN  Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea.  Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho phù hợp.  Phƣơng pháp nghiên cứu: - Thực hiện ly trích và phân cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn - Tiến hành phân tách các đoạn DNA cắt giới hạn trên gel agarose, chuyển và cố định DNA lên màng - Thực hiện phản ứng lai với phân tử probe là DNA plasmid được đánh dấu và phát hiện bằng huỳnh quang - Sử dụng phần mềm để phân tích tính đa dạng di truyền.  Kết quả: - DNA ly trích tốt và thực hiện thành công phản ứng cắt giới hạn - Biến nạp và ly trích thành công các loại plasmid được cung cấp để đánh dấu sư dụng cho phản ứng lai phát hiện MAGGY trong genome của M. grisea - Thực hiện phản ứng lai với probe pMGY-SB thành công đối mẫu đối chứng là plasmid pMGY-SB.  Kết luận : Do quy trình Southern blot chưa hoàn thiện trong điều kiện phòng thí nghiệm ở TT PTTNHS của trường Đại học Nông Lâm và hạn chế về mặt thời gian nên kết quả của phản ứng lai đã không đi đến thành công. Do đó, không có cơ sở để phân tích sự đa dạng di truyền trên nấm M. grisea. iii MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách các chữ viết tắt . vi Danh sách các hình . vii Danh sách các bảng . viii 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1. Sơ lược về cây lúa . 3 2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) . 3 2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa . 3 2.2.2. Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa 4 2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh . 5 2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh 5 2.3. Phương pháp Southern blot 6 2.4. Enzyme cắt giới hạn . 7 2.5. Các phương pháp chuyển DNA lên màng 8 2.5.1. Phương pháp mao dẫn hướng lên 8 2.5.2. Phương pháp mao dẫn hướng xuống . 9 2.5.3. Phương pháp mao dẫn hai chiều . 9 2.5.4. Phương pháp chuyển bằng điện 9 2.5.5. Phương pháp chuyển bằng chân không . 9 2.6. Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot 10 2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea 10 2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea 12 iv 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành . 14 3.2. Đối Tượng khảo sát 15 3.3. Nội dung thực hiện . 15 3.4. Vật liệu và hóa chất 16 3.4.1. Dụng cụ và thiết bị 16 3.4.2. Hóa chất . 16 3.5. Phương pháp nghiên cứu 17 3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm M. grisea (isolate) 17 3.5.1.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm . 17 3.5.1.2. Ly trích DNA theo phương pháp lysis 18 3.5.1.3. Phương pháp tinh sạch DNA 18 3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 18 3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp 18 3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) 19 3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp . 19 3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit . 21 3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid . 22 3.5.4. Tạo mẫu lai 22 3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn . 23 3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 23 3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phương pháp mao dẫn hướng lên 24 3.5.4.4. Làm khô màng . 25 3.5.4.5. Cố định DNA lên màng 25 3.5.5. Lai southern 26 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai . 26 3.5.5.2. Rửa màng sau khi lai 26 v 3.5.5.3. Phát hiện kết quả trên phim X-ray 27 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. . 28 4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α 30 4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn 31 4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi được cắt bằng EcoRV và BamHI với probe SB . 33 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 38 5.1. Kết luận . 38 5.2. Đề nghị . 38 TÀI NIỆU THAM KHẢO 49 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: base pair B: Bam HI Ctv cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol DIG: Digoxigenin E: Eco RV ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid H: Hind III HRP: Horseradish peroxydase Kb: kilobase PCR: Polymerase Chain Reaction RE: Restriction Enzyme RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: Ribonucleic acid RT: Reverse transcrip SDS: Sodium dodecyl sulfate SSC: Saline sodium citrate TAE: Tris Acetate EDTA TBE: Tris-base Boric EDTA UV: Ultraviolet (light) w/v: Weight for volume vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) . 4 Hình 2.2. Bào tử nấm M. grisea chụp dưới kính hiển vi 5 Hình 2.3. Vòng đời của nấm M. grisea . 6 Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY 10 Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea 28 Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi được xử lý với RNAse 30 Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8 31 Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn . .32 Hình 4.5. Kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai . 34 Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film . 35 [...]... kĩ thuật này đã được áp dụng thành công trong việc nghiên cứu về 2 sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea Ở nước ta, những nghiên cứu như vậy còn rất ít Xuất phát từ tình hình trên, tôi đã thực hiện đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern blot phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”, nhằm phân tích được cấu trúc di truyền giữa các dòng nấm. .. loại nấm sợi ngày nay được phân vào nhóm Ty3-gypsy với một vài ngoại lệ MAGGY có nhiều coppy trong bộ gen M grisea phân lập được từ cây lúa, cây kê đuôi cáo, và một số loại cỏ khác, nhưng chúng không tìm thấy trong nấm M grisea phân lập từ lúa mì [8] 2.8 Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm Magnaporthe grisea Hamer và ctv (1989) là những người đầu. .. hữu tính có thể là nguyên nhân tạo nên sự đa dạng di truyền trong quần thể nấm M grisea [14] Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra đời như kĩ thuật PCR, Southern blot, đọc trình tự v.v giúp cho quá trình nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể sinh vật thuận lợi hơn Những kỹ thuật này đã được ứng dụng để nghiên cứu sự đa hình trong quần thể dựa trên những DNA... 5.4.1 Mục đích Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn bằng phương pháp Southern blot 5.4.2 Yêu cầu - Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Magnaporthe grisea - Ly trích DNA các dòng nấm Magnaporthe grisea - Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt DNA genome bằng các enzyme giới hạn - Tạo được phân tử probe đánh dấu từ DNA plasmid - Thiết lập được phản ứng lai và phát... cho lúa Le Dinh Don và ctv (1999) đã tiến hành phân tích cấu trúc di truyền của quần thể nấm M grisea gây bệnh đạo ôn trên vùng Đồng bằng Sông Hồng (1998) và Đồng bằng Sông Cửu Long (1996) Ứng dụng phương pháp Southern blot sử dụng probe chứa một đoạn phân lập từ MAGGY và đã phát hiện được 5 dòng chứa đoạn gen MAGGY Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa các nòi ở hai vùng trồng lúa này Đầu tiên, khả... EcoRV và HindIII để ở thể tích 25 µl và 50 µl như sau: Bảng 3.2 Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl BamHI HindIII EcoRV Thể tích DNA DNA DNA 8 µl (1µg) 10X đệm BamHI 10X đệm HindIII 10X đệm EcoRV 2,5 µl Enzyme BamHI Enzyme EcoRV Enzyme HindIII 05 µl Nước Nước Nước 14 µl Tổng cộng 25 µl Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl BamHI Hind III Eco RV Thể tích DNA... Các enzym cắt thông dụng ………………………………………… 7 Bảng 3.1 Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai………… 16 Bảng 3.2 Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl………………… 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl……… …23 Bảng 4.1 Những khó khăn và những giải pháp khắc phục trong thực hiện phản ứng lai Southern ……………………………… …36 viii 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 5.3 Đặt vấn đề... dòng có gen kháng Pi-ks và Pi-ta Thứ hai, các nòi ở khu vực phía Bắc thì đa dạng về cấu trúc dòng hơn các nòi ở khu vực phía Nam Motoaki Kusaba và ctv (1999) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể nấm M grisea được phân lập từ nhiều loại kí chủ khác nhau bằng sự đa hình các đoạn MAGGY trong DNA genome Kusaba nhận ra sự hiện di n với số lượng bản sao nhiều của MAGGY trong genome, thực hiện đọc... (1996) sử dụng probe pCB586 để phát hiện đoạn MGR586 trong quần thể nấm M grisea Phân tích sự giảm phân của MGR586 Shull và Hamer đã tìm ra được một đa hình mới là MGR586-P2 P2 được tạo ra do một đoạn chèn gần, đó là một retrotransposon chứa đoạn LTR Kết quả các ông đưa ra rằng những vị trí DNA đánh dấu có thể siêu biến tái sắp xếp chính xác Le Dinh Don và ctv (1998) phân tích cấu trúc quần thể nấm M grisea... mầm của bào tử nấm làm cây bệnh tạo và tập trung chất coumain khiến cây lúa bị lùn Hình 2.2 Bào tử nấm Magnaporthe grisea chụp dƣới kính hiển vi (Nguồn: http://www.cbwinfo.com/Biological/PlantPath/PyG.html) 6 Hình 2.3 Vòng đời của nấm Magnaporthe grisea (Nguồn: http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_ Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm) 2.3 Phƣơng pháp Southern blot Southern blot (Southern 1975) . “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern blot phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”, nhằm phân tích. BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN