Ứng dụng kỹ thuật southern blot phân tích đa dạng di truyền nấm Magnaphorthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



ĐẶNG TRẦN ANH THƯ

BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT

SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI

TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea

GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA

LUẬN VĂN KỸ SƯ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT

SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI

TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea

GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA

LUẬN VĂN KỸ SƯ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐẶNG TRẦN ANH THƯ KHÓA: 2002 - 2006

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006

Trang 3

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC

Professor Student

LE DINH DON DANG TRAN ANH THU TERM: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006

Trang 4

i

LỜI CẢM TẠ



TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN

Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này

Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh

Thầy Nguyễn Đức Sáng đã giúp đỡ tôi về hóa chất và vật liệu nghiên cứu trong thời gian làm đề tài

Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận

Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập

CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN

Cha Mẹ, các em và người thân trong gia đình đã ủng hộ và hỗ trợ con về mặt vật chất cũng như tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa học này

TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006 Đặng Trần Anh Thư

Trang 5

ii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN



ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng

08/2006 “Bước đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng

di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”

Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN

 Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp

Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến

phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea

 Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm

Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho

phù hợp

 Phương pháp nghiên cứu:

- Thực hiện ly trích và phân cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn - Tiến hành phân tách các đoạn DNA cắt giới hạn trên gel agarose, chuyển và cố định DNA lên màng

- Thực hiện phản ứng lai với phân tử probe là DNA plasmid được đánh dấu và phát hiện bằng huỳnh quang

- Sử dụng phần mềm để phân tích tính đa dạng di truyền  Kết quả:

- DNA ly trích tốt và thực hiện thành công phản ứng cắt giới hạn

- Biến nạp và ly trích thành công các loại plasmid được cung cấp để đánh

dấu sư dụng cho phản ứng lai phát hiện MAGGY trong genome của M grisea

- Thực hiện phản ứng lai với probe pMGY-SB thành công đối mẫu đối

chứng là plasmid pMGY-SB  Kết luận :

Do quy trình Southern blot chưa hoàn thiện trong điều kiện phòng thí nghiệm ở TT PTTNHS của trường Đại học Nông Lâm và hạn chế về mặt thời gian nên kết quả của phản ứng lai đã không đi đến thành công Do đó, không có cơ sở để

phân tích sự đa dạng di truyền trên nấm M grisea

Trang 6

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cây lúa 3

2.2 Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) 3

2.2.1 Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa 3

2.2.2 Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa 4

2.2.3 Đặc điểm phát sinh bệnh 5

2.2.4 Nguyên nhân gây bệnh 5

2.3 Phương pháp Southern blot 6

2.4 Enzyme cắt giới hạn 7

2.5 Các phương pháp chuyển DNA lên màng 8

2.5.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên 8

2.5.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống 9

2.5.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều 9

2.5.4 Phương pháp chuyển bằng điện 9

2.5.5 Phương pháp chuyển bằng chân không 9

2.6 Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot 10

2.7 Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M grisea 10

2.8 Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm M grisea 12

Trang 7

iv

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 14

3.2 Đối Tượng khảo sát 15

3.3 Nội dung thực hiện 15

3.4 Vật liệu và hóa chất 16

3.4.1 Dụng cụ và thiết bị 16

3.4.2 Hóa chất 16

3.5 Phương pháp nghiên cứu 17

3.5.1 Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm M grisea (isolate) 17

3.5.1.1 Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm 17

3.5.1.2 Ly trích DNA theo phương pháp lysis 18

3.5.1.3 Phương pháp tinh sạch DNA 18

3.5.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 18

3.5.2.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 18

3.5.2.2 Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) 19

3.5.2.3 Kiểm tra kết quả biến nạp 19

3.5.2.4 Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit 21

3.5.3 Thực hiện đánh dấu plasmid 22

3.5.4 Tạo mẫu lai 22

3.5.4.1 Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn 23

3.5.4.2 Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 23

3.5.4.3 Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phương pháp mao dẫn hướng lên 24

Trang 8

v

3.5.5.3 Phát hiện kết quả trên phim X-ray 27

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Ly trích DNA tổng số của nấm M grisea 28

4.2 Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α 30

4.3 Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M grisea bằng enzym cắt giới hạn 31

4.4 Phản ứng lai DNA M grisea sau khi được cắt bằng EcoRV và BamHI với probe SB 33

Trang 9

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

Trang 10

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) 4

Hình 2.2 Bào tử nấm M grisea chụp dưới kính hiển vi 5

Hình 2.3 Vòng đời của nấm M grisea 6

Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY 10

Hình 4.1 DNA tổng số của nấm M grisea 28

Hình 4.2 DNA của các nguồn nấm M grisea sau khi được xử lý với RNAse 30

Hình 4.3 Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8 31

Hình 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn 32

Hình 4.5 Kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai 34

Hình 4.6 Kết quả phát hiện trên X-ray film 35

Trang 11

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các enzym cắt thông dụng……… 7 Bảng 3.1 Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai………… 16 Bảng 3.2 Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl……… 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl……… …23 Bảng 4.1 Những khó khăn và những giải pháp khắc phục

trong thực hiện phản ứng lai Southern ……… …36

Trang 12

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

5.3 Đặt vấn đề

Magnaporthe grisea (Hebert) Barr (anamorph, Pyricularia grisea (Cooke)

Sacc.) là nguyên nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật thuộc họ Gramineae, Cannaceae, Cyperaceae và Zingiberaceae [12] Đặc biệt, loại nấm này là nguyên nhân

gây bệnh cháy lá (đạo ôn) trên cây lúa (Oryza sativa), đây là một loại bệnh nghiêm

trọng và gây tổn thất lớn đối với các nước trồng lúa trên thế giới Hàng năm, năng suất lúa gạo do bệnh này gây ra giảm 30% trên toàn thế giới Ở Việt Nam, đạo ôn cổ gié đã gây hại 138.000 ha trong năm 1991 và 217.000 ha trong năm 1992 ở đồng bằng Sông Hồng Bệnh cũng đã gây hại nghiêm trọng ở đồng bằng Sông Cửu Long từ 1978-1981 [11] Theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tổng diện tích bị nhiễm bệnh đạo ôn trong vụ Đông Xuân 2003-2004 là 37.029 ha (tăng 3 lần so với Đông Xuân 2003), vụ Hè Thu 2006 là 38.346 ha lúa bị nhiễm đạo ôn lá và 4046 ha bị nhiễm đạo ôn cổ bông

Trong những năm gần đây, người trồng lúa đã áp dụng nhiều biện pháp phòng trừ như: phun thuốc diệt nấm và tăng cường trồng giống kháng trên diện rộng Thuốc diệt nấm có thể giảm một phần thiệt hại của bệnh nhưng không tiêu diệt được bệnh Những giống kháng có thể kháng được bệnh đạo ôn nhưng chỉ có thể duy trì được tính kháng trong một thời gian ngắn Điều này có thể được giải thích rằng nấm

Magnaporthe grisea có sự đa dạng di truyền trong quần thể [11] Một số giả thuyết

cho rằng những yếu tố chuyển vị (transposon) [12], thể dị hạch (heterokaryosis), và sự tái tổ hợp trong sinh sản hữu tính có thể là nguyên nhân tạo nên sự đa dạng di truyền

trong quần thể nấm M grisea [14]

Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra đời như kĩ thuật PCR, Southern blot, đọc trình tự v.v giúp cho quá trình nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể sinh vật thuận lợi hơn Những kỹ thuật này đã được ứng dụng để nghiên cứu sự đa hình trong quần thể dựa trên những DNA marker như: RFLP, ALP, AFLP, RAPD, DAF, SSR, AP-PCR, SSCP, MRDHV-DNA, SNP [1] Trên thế giới, các kĩ thuật này đã được áp dụng thành công trong việc nghiên cứu về

Trang 13

sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea Ở nước ta, những nghiên cứu như

vậy còn rất ít

Xuất phát từ tình hình trên, tôi đã thực hiện đề tài “Bước đầu ứng dụng kỹ

thuật Southern blot phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”, nhằm phân tích được cấu trúc di truyền

giữa các dòng nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở các tỉnh

đồng bằng Sông Cửu Long

5.4 Mục đích – Yêu cầu 5.4.1 Mục đích

Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh

đạo ôn bằng phương pháp Southern blot 5.4.2 Yêu cầu

- Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Magnaporthe grisea - Ly trích DNA các dòng nấm Magnaporthe grisea

- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt DNA genome bằng các enzyme giới hạn - Tạo được phân tử probe đánh dấu từ DNA plasmid

- Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray

Trang 14

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về cây lúa

Lúa thuộc họ Gramieae, loại Oryza, loài Oryza sativa Lúa đang được trồng

thuộc loài phụ Indica (lúa tiên) và Japonica (lúa cánh) Lúa là một loại cây lương thực quan trọng trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Đông Nam Á Lúa có giá trị dinh dưỡng cao và được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, cung cấp năng lượng cho con người sống và hoạt động Cây lúa có nguồn gốc lâu đời và đã được thuần hóa từ cây lúa hoang dại, bán hoang dại, dị hợp tử và đầy những biến dị Quá trình thuần hóa cũng là quá trình lai tạo tự nhiên, đột biến gen do môi trường và sự chọn lọc của con người qua hàng ngàn năm

Việt Nam là một nước nhiệt đới nóng ẩm, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát dục của cây lúa, vì vậy hầu hết các địa phương đều có trồng lúa Nơi quá cao không có hệ thống thủy lợi, người ta cũng trồng lúa cạn Do vị trí địa lý nước ta chạy dọc theo bờ biển, địa hình, địa thế cao thấp khác nhau, có điều kiện khí tượng thủy văn khác nhau, nên hình thành các vụ lúa và các vùng trồng lúa khác nhau Nước ta có ba vùng trồng lúa lớn là: vùng lúa Bắc bộ và bắc Trung bộ, vùng lúa Trung và nam Trung bộ, vùng lúa ở Nam bộ [5]

Lúa thường gặp rất nhiều loại bệnh mà nguyên nhân chủ yếu là do nấm, vi khuẩn và số ít là do virus Bệnh do nấm gây ra điển hình như: bệnh đạo ôn, đốm nâu, bệnh khô vằn và một số bệnh khác Bệnh do vi khuẩn gây ra như: cháy bìa lá lúa, bệnh vàng lá lúa Bệnh do virus gây ra như lùn soắn lá lúa Trong đó, bệnh do nấm gây ra là thường gặp nhất và gây tổn thất nhiều nhất [6]

2.2 Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn)

2.2.1 Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa

Bệnh được ghi nhận và mô tả đầu tiên tại Trung Quốc vào năm 1637 Năm 1704, M Tsuchiya (Nhật) bắt đầu nghiên cứu hiện tượng cháy lá trên cây lúa Sau đó, bệnh được báo cáo có ở nhiều quốc gia khác như là Ý (1788), Mỹ (1876) và Ấn Độ (1913) Đây là bệnh phân bố rộng và có mặt trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới [2] Ở Nhật từ năm 1953-1960, thiệt hại về năng suất là 2,98%, tính riêng trong năm

Trang 15

1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24% trong tổng thất thu do sâu, bệnh, bão lũ Bệnh có thể làm mất trắng như ở Hà Đông (Việt Nam) Đối với bệnh thối cổ gié, ước tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỉ lệ hạt kém phẩm chất gia tăng 5% Ở Miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà Đông bị thiệt hại nặng Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao điểm của bệnh là tháng 11-12 dương lịch và tháng 5-6 dương lịch Các huyện Châu Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là những nơi thường có bệnh [6]

2.2.2 Triệu chứng bệnh cháy lá trên cây lúa

Bệnh cháy lá lúa là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là bệnh đạo ôn Khi dịch cháy lá xảy ra trên diện rộng thì năng suất và sản lượng sẽ giảm rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế Tác nhân gây bệnh có thể tấn công mọi giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ cho đến trước trổ thì gọi là bệnh cháy lá Bệnh có thể gây hại trên cổ lá nên gọi là thối cổ lá, hoặc gây hại trên cổ bông nên được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem vỏ hạt lúa

Trên mạ: vết bệnh có hình thoi nhỏ, màu hồng hoặc nâu vàng Bệnh nặng, từng

đám vết bệnh liên kết kế tiếp nhau tạo thành những mảng cháy khô trên lá và thân làm cho cây mạ khô héo dần rồi chết

Trang 16

Trên lá: vết bệnh hình thoi màu nâu nhạt, rộng ở phần giữa và nhọn ở hai đầu,

giữa vết bệnh có màu xám tro, xung quanh nâu đậm, vòng ngoài cũng có màu nâu nhạt Kích thước vết bệnh biến thiên từ một chấm nhỏ như mũi kim đến chiều dài 1,5cm, khi bệnh nặng các vết bệnh nối với nhau tạo thành những vệt lớn làm cho lá bị

cháy

Trên thân, cổ bông: ban đầu trên lá có một chấm nhỏ màu nâu xám, về sau lớn

dần bao quanh đốt thân làm thân thắt lại, trên cổ bông làm bông bị bạc (xuất hiện sớm), bông bị gãy gục (xuất hiện chậm khi hạt đã chắc)

Trên hạt: vết bệnh không định hình có màu đen hoặc nâu đen [6]

2.2.3 Đặc điểm phát sinh bệnh

Bệnh phát sinh thất thường, tùy thuộc vào yếu tố ngoại cảnh Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ thấp (200C), ẩm độ không khí cao và có gió mạnh Khi không có đủ ánh sáng do mây mù, lúa sẽ tập trung nhiều Glutamic và nhiều amino acid khác nên sẽ tăng tính nhiễm của cây.[6]

2.2.4 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh do nấm Magnaporthe grisea (Herbert) Barr (anamorph, Pyricularia

grisea (Cooke) Sacc.), thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp Hyphomycetes Đặc

điểm của nấm này là sinh bào tử có kích thước 20-22 x 10-12 µm Cành bào tử phân sinh có hình trụ, đa bào màu nhạt có từ 3-6 đốt, trên mỗi cành có từ 3-10 bào tử Bào tử phân sinh có hình quả lê, có từ 2-3 ngăn ngang, không màu, có vỏ mỏng

Nấm M grisea sinh ra hai loại độc tố: acid alpha-picolinic (C6H5NO2) và

pyricularin (C18H14N2O3) Các độc tố này ức chế sự phát triển của cây mạ và sự nảy

mầm của bào tử nấm làm cây bệnh tạo và tập trung chất coumain khiến cây lúa bị lùn

Hình 2.2 Bào tử nấm Magnaporthe grisea chụp dưới kính hiển vi

(Nguồn: http://www.cbwinfo.com/Biological/PlantPath/PyG.html)

Trang 17

Hình 2.3 Vòng đời của nấm Magnaporthe grisea

(Nguồn: http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_ Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm)

2.3 Phương pháp Southern blot

Southern blot (Southern 1975) là phương pháp để kiểm tra sự hiện diện của một đoạn gen nào đó trong genome, với sự chính xác và độ đặc hiệu cao Đầu tiên cần tách chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo kích thước DNA được biến tính trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M), sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao dẫn (màng lai thường sử dụng là màng nilon hoặc nitrocellulose) Vị trí của các đoạn DNA trên gel, được giữ yên khi chuyển lên màng lai

Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng xạ lai với các đoạn DNA trên màng lai, tạo nên các phân tử DNA lai Tiến hành lai phân tử bằng cách cho vào hộp lai chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai, chứa mồi có đánh dấu phóng xạ Đặt màng lai vào hộp lai ở nhiệt độ 650C trong 3 – 8 giờ, sau đó thêm dịch lai với chế độ nhiệt 650C, lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng Rửa màng lai bằng dung dịch SSC (NaCl, natri citrat, và nước) ở nhiệt độ 650C hai đến ba lần, thấm khô bằng giấy lọc hoặc sấy khô ở 650

C Thực hiện phóng xạ tự ghi bằng phim X quang nhạy ở nhiệt độ - 200

C, xử lý dưới ánh sáng tử ngoại trong 4 giây để kiểm tra kết quả lai [13]

Trang 18

2.4 Enzyme cắt giới hạn

Trong phân tích genome, restriction endonuclease là nhóm enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng Đó là nhóm DNAse nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 – 6 cặp nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn kiểu sắp xếp khác nhau) Trường hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu gồm bốn cặp nucleotide, cứ 44 = 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt Khi các enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 46 = 4096 cặp nucleotide có một chỗ bị cắt Người ta xem nó như là chìa khóa để nghiên cứu kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant)

Các enzyme này được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950 Nó bao gồm một phần của tính chất giới hạn (restriction) viết tắt R, và một phần của tính chất cải tiến (modification) viết tắt là M Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể, và những nhân tố di truyền lạ Hệ thống R-M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật tiền nhân (prokaryote) như là một hệ thống miễn dịch [7]

Bảng 2.1 Các enzym cắt thông dụng

Enzyme Chuỗi mã di truyền bị tác động

BamHI BglII EcoRI HindIII

HpaI KpnI PstI SmaI

SacI SalI AluI Taq

G/GATCC A/GATCT G/AATTC A/AGCTT GTT/AAC GGTAC/C CTGCA/G CCC/GGG GAGCT/C G/TCGAC

AG/CT T/CGA

Trang 19

Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính:

- Một là restriction endonuclease, viết tắt là R-Enase, rất chuyên tính tại một vị trí nào đó, nó có nhiệm vụ phân hủy DNA ngoại sinh (exogenus DNA)

- Hai là modification methylase của DNA, còn được gọi là methyltranferase, viết tắt là M-MTase, có sự chuyên tính về chuỗi mã rất đồng nhất M-MTase có nhiệm vụ cải tiến và bảo vệ DNA nội sinh (endogenus DNA) không bị

phân hủy bởi R-Enase [7]

2.5 Các phương pháp chuyển DNA lên màng 2.5.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên

Sau quá trình điện di, những phân đoạn DNA được giữ trong gel Gel này được đặt trên một dòng lưu chất và dòng lưu chất này vận chuyển trên bề mặt của một vật thể rắn, phẳng (Southern, 1975) Dòng dịch lỏng này sẽ lưu chuyển qua miếng gel bằng lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm [14]

Tốc độ vận chuyển của DNA phụ thuộc vào kích thước của DNA và nồng độ gel agarose được sử dụng Đối với những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn 1 kb thì hầu hết nó được vận chuyển nhanh, đối với những đoạn DNA có kích thước lớn thì sự vận chuyển của chúng chậm chạp hơn thường mất khoảng 18 giờ và ít có hiệu quả [6]

2.5.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống

Những đoạn phân tử DNA được giữ trong gel để trực tiếp bên dưới một dòng lưu chất alkaline buffer và sự tồn lưu của chúng trên bề mặt của màng Khi đó, dòng dung dịch đệm sẽ lưu chuyển qua gel nhờ lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm ở dưới Sự vận chuyển những đoạn DNA nhanh và cường độ tín hiệu khoảng 30% khi được chuyển bằng hệ thống hướng lên Sự cải tiến này có hiệu quả khi thực hiện sự di

chuyển những đoạn phân DNA thông qua gel [14] 2.5.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều

Khi những đoạn trình tự đích hiện diện ở nồng độ cao thì phương pháp mao dẫn được sử dụng vận chuyển DNA đồng thời (hiện tượng mao dẫn hướng lên và hướng xuống) và nhanh từ một gel đơn đến hai màng nitrocellulose hoặc nylon Đệm chuyển là dung dịch đệm có trong gel và hiệu quả vận chuyển kém Không dùng phương pháp

Trang 20

này đối với những thử nghiệm đòi hỏi tính nhạy cao Tuy nhiên, phương pháp này có thể được sử dụng để phân tích plasmid, acteriophages, hoặc cosmid 235 [14]

2.5.4 Phương pháp chuyển bằng điện

Theo phương pháp này, những phân đoạn DNA sẽ di chuyển từ gel đến màng lai thông qua dòng điện Dung dịch đệm đóng vai trò lưu dẫn dòng điện Do sự điện giải, tính dẫn điện của dung dịch giảm dần, vì thế cần sử dụng một lượng dung dịch đệm thích hợp để dòng điện luôn ổn định trong khi chuyển Tốc độ chuyển phụ thuộc vào kích thước đoạn DNA, nồng độ gel và hiệu điện thế dòng điện [14]

2.5.5 Phương pháp chuyển bằng chân không

Phương pháp này tương tự phương pháp mao dẫn Buồng chân không sẽ kéo dung dịch chuyển xuyên qua gel và màng, DNA từ gel sẽ di chuyển theo sự di chuyển của dung dịch đệm đến màng So với phương pháp mao dẫn, phương pháp này nhanh

và hiệu quả hơn [14]

2.6 Probe đánh dấu được sử dụng trong Southern blot

Probe là những đoạn acid nucleic (DNA, RNA hoặc oligonucletide) đã biết rõ trình tự và kích thước, dùng để định vị các đoạn acid nucleic cần nghiên cứu có trình tự bổ sung với trình tự của probe, qua một phản ứng chuyên biệt gọi là lai phân tử Probe có độ đặc hiệu cao, do đó nó có thể phát hiện ra đoạn gen cần tìm trong hàng ngàn đoạn DNA hoặc RNA khác nhau Có hai hệ thống đánh dấu probe Hệ thống đánh dấu (labeling) bằng chất đồng vị phóng xạ như 32

P, 35S, 125I, 3H, được phát hiện bằng hiện tượng phóng xạ tự ghi hoặc sử dụng các loại máy đếm Geiger- Muller Hệ thống đánh dấu không dùng chất đồng vị phóng xạ như Biotin, Enzyme, Chemiluminescence, Fluorescence, Kháng thể (Antibodies) Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng phóng xạ bao gồm các hệ thống có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”, “digoxigenin - antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin” Cả ba hệ thống này, thể probe lai có thể sẽ được phát hiện với cơ chất chromogenic Cơ chất này sẽ tạo ra ánh sáng đối với enzyme có trong hệ thống [2] Đánh dấu probe được thực hiện bằng một số phương pháp sau: phương pháp nick – translation, phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên), phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi),

phương pháp photobiotin

Trang 21

2.7 Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M grisea

Transposon là yếu tố thường gặp trong cả prokaryote và eukaryote, đây là

những vùng có khả năng chuyển vị trong genome Trong những năm gần đây, những yếu tố này được phát hiện tăng số lượng trong các loài nấm sợi Transposon của nấm cũng giống như transposon của của các loài eukaryote khác, chúng được phân thành 2 nhóm chính Các yếu tố nhóm I chuyển vị qua trung gian RNA, các yếu tố nhóm II chuyển vị trực tiếp từ DNA sang DNA Yếu tố nhóm I phân thành 3 loại: retrotransposon LTR mã hóa enzyme RT (reverse transcription) và có chứa LTR (long terminal repeat) ở cả hai đầu, retrotransposon LINE cũng mã hóa RT và có đuôi polyA nhưng không có LTR và yếu tố SINE thể hiện đặc tính cần phải phiên mã bằng polymerase RNA III và không có gen RT Sự biểu hiện của các transposon trong vi sinh vật luôn được quy định hoàn toàn bởi genome kí chủ Nhưng hoạt tính của chúng lại rất khác nhau tùy theo điều kiện xử lý: shock nhiệt, chiếu tia UV, nuôi cấy mô, lai và chủng với vi khuẩn hoặc xử lý với những yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [17]

M grisea là một loại nấm có phổ kí chủ rất rộng, chúng có thể kí sinh trên hơn 50

loại thực vật thân cỏ và một số loài cây 1 lá mầm khác [11] Loại nấm này phân hóa và gồm

một số loại tác nhân gây bệnh chuyên biệt cho kí chủ Tác nhân Oryza gây bệnh cho cây lúa (Oriza sativa), Setaria gây bệnh trên loài kê đuôi cáo (Setaria italica), Panicum gây bệnh trên loài kê thường (Panicum miliaceum), Triticum là tác nhân gây bệnh trên lúa mì (Triticum aesticum), Eleusine là tác nhân gây bệnh trên kê hình ngón tay (Eleusine

coracana) và digitaria tác nhân gây bệnh trên loài cỏ crabgrass (Digitaria sanguinalis) [17]

Hình 2.4 Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY

Các phân đoạn của nó pMGY18, pMGY23 (dòng kẻ đậm) và probe SB (bằng dòng kẻ trắng) để đánh giá số lượng bản sao của MAGGY trong genome Tên viết tắt của các enzym cắt: BamHI (B), EcoRV (E), HindIII (H), PstI (P), SalI (S).(Yukio Tosa và ctv, 1995)

Trang 22

Genome M grisea có 6 nhiễm sắc thể, có trọng lượng phân tử là 38 megabase

và kích thước mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau Có nhiều transposon được tìm thấy

trong genome của M grisea tạo nên những trình tự DNA lập lại được gọi là MGR (M

grisea repeat), các MGR này giúp phân biệt các cá thể trong một quần thể nấm M grisea đa hình Một số MGR được tìm thấy trong quần thể nấm M grisea: MGR583,

MGR586, MGSR1, Grasshopper, MAGGY, Fosburi và Pot2 [9, 16] Nhóm I gồm các retrotransposon LTR Grasshopper, MAGGY và fosbury, retrotransposon MGR583-

LINE, yếu tố MGSR1-SINE và Mg-SINE, nhóm II gồm MGR586 hoặc Pot3 và Pot2

MGR583 được cho là những yếu tố cũ, đã xuất hiện rất sớm trong quần thể M grisea trong quá trình tiến hóa của nó, LTR-retrotransposon MAGGY và Grasshopper thì bị

giới hạn, và được cho là những yếu tố mới cái mà gần đây mới xuất hiện trong quần

thể nấm Pyricularia bằng sự di chuyển ngang Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng

MAGGY là yếu tố hoạt động mạnh nhất trong các yếu tố được kiểm tra về sự chuyển

vị trong quần thể M grisea [17]

MAGGY là một retrotransposon kích thước 5,6 kb, được phân tách từ nấm

Magnaporthe grisea và có 2 ORF và các LTR có kích thước 253-bp ( Farman và ctv

1996) ORF1 mã hóa chuỗi polypeptide gồm 457 amino acid, ORF2 có đặc tính của

gen pol mã hóa một polypeptide có chức năng protease Hầu hết các retrotransposon được tìm thấy trong các loại nấm sợi ngày nay được phân vào nhóm Ty3-gypsy với một vài ngoại lệ MAGGY có nhiều coppy trong bộ gen M grisea phân lập được từ

cây lúa, cây kê đuôi cáo, và một số loại cỏ khác, nhưng chúng không tìm thấy trong

nấm M grisea phân lập từ lúa mì [8]

2.8 Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền

của quần thể nấm Magnaporthe grisea

Hamer và ctv (1989) là những người đầu tiên tìm ra một họ những trình tự DNA

lập lại trong genome của M grisea được gọi là MGR586 Ứng dụng phương pháp

DNA-fingerprinting sử dụng probe MGR586 đã mở ra một hướng mới trong nghiên

cứu cấu trúc của quần thể nấm M grisea Sau đó, những nghiên cứu này được phát

triển xa hơn trong nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm gây bệnh cháy lá trong các vùng trồng lúa trên thế giới Một vài trình tự DNA lập lại trong quần thể nấm

này cũng được tìm thấy sau đó như: Pot2, Fosbury, MGSR1, MAGGY và được sử

Trang 23

dụng thay thế cho probe MGR586 Trong đó, MAGGY được xem là probe tốt nhất vì

trong một số trường hợp nó có thể cho thấy sự khác biệt giữa các nòi nấm M grisea

trong cùng một kí chủ

Hamer và ctv (1992) đã sử dụng probe MGR586, lai chéo với các dòng là tác nhân gây bệnh cho lúa và những dòng không gây bệnh trong phòng thí nghiệm Kết quả ông đã tìm được 57 đoạn DNA cắt giới hạn được lai với probe MGR586 của dòng gây bệnh trên lúa và phát hiện ra 8 nhóm liên kết Những kết quả đó cho phép Hamer

xây dựng bản đồ 3 gen sắc tố (Alb1, Rsy1 và Buf1), vị trí lai (Mat1), tổ chức tạo nhân con (Rdn1), gen Smo1 và hai đa hình RFLP liên kết với Smo1 Kết quả của Hamer đã

chỉ ra rằng vị trí của các MGR586 được phân bố một cách ngẫu nhiên trong genome

của nấm M grisea

Yukio Tosa và ctv (1995) đã sử dụng hai probe pMGY23 và pMGY18 được tách dòng từ MAGGY, để phân tích sự phân bố của retrootransposon MAGGY trong

các dòng Pyricularia được phân lập từ các loài thực vật một lá mầm ở nhiều nước

khác nhau Kết quả ông đã tìm thấy được nhiều bản sao của MAGGY trong các nòi

phân lập từ lúa và kê đuôi cáo (Setaria italica) Điều này chứng tỏ các nòi là tác nhân gây bệnh trên lúa có quan hệ di truyền gần với nòi từ loài Setaria

Pradeep Kachroo và ctv (1995) sử dụng phương pháp Southern blot với probe

Mg-SINE, phân tích genome của các nòi M grisea Qua nghiên cứu Kachroo đã phát

hiện ra khoảng 100 bản sao của Mg-SINE trên một thể đơn bội trong cả các nòi gây bệnh cho lúa và các nòi không gây bệnh cho lúa

Verel Shull và John E Hamer (1996) sử dụng probe pCB586 để phát hiện đoạn

MGR586 trong quần thể nấm M grisea Phân tích sự giảm phân của MGR586 Shull

và Hamer đã tìm ra được một đa hình mới là MGR586-P2 P2 được tạo ra do một đoạn chèn gần, đó là một retrotransposon chứa đoạn LTR Kết quả các ông đưa ra rằng những vị trí DNA đánh dấu có thể siêu biến tái sắp xếp chính xác

Le Dinh Don và ctv (1998) phân tích cấu trúc quần thể nấm M grisea ở Nhật

Bản bằng phương pháp DNA fingerprinting Don đã sử dụng Probe SB lai với MAGGY và MGR586 Kết quả đã cho thấy rằng có hai dòng liên kết trong quần thể nấm, hai dòng này chỉ ra khả năng gây độc tương tự nhau MAGGY thể hiện trong các nhóm cũng tương tự như MGR586, mặc dù hai yếu tố nay khác nhau về tính chất và

Trang 24

cấu trúc Điều này cho thấy rằng MAGGY có thể thay thế cho MGR586 trong những

nghiên cứu khác trong quần thể các nòi M grisea gây bệnh cho lúa

Le Dinh Don và ctv (1999) đã tiến hành phân tích cấu trúc di truyền của quần

thể nấm M grisea gây bệnh đạo ôn trên vùng Đồng bằng Sông Hồng (1998) và Đồng

bằng Sông Cửu Long (1996) Ứng dụng phương pháp Southern blot sử dụng probe chứa một đoạn phân lập từ MAGGY và đã phát hiện được 5 dòng chứa đoạn gen MAGGY Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa các nòi ở hai vùng trồng lúa này Đầu

tiên, khả năng gây độc rất khác nhau đặc biệt là trên những dòng có gen kháng Pi-ks và Pi-ta Thứ hai, các nòi ở khu vực phía Bắc thì đa dạng về cấu trúc dòng hơn các nòi ở

khu vực phía Nam

Motoaki Kusaba và ctv (1999) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể

nấm M grisea được phân lập từ nhiều loại kí chủ khác nhau bằng sự đa hình các đoạn

MAGGY trong DNA genome Kusaba nhận ra sự hiện diện với số lượng bản sao nhiều của MAGGY trong genome, thực hiện đọc trình tự vùng ITS2 để xây dựng sơ đồ mối quan hệ giữa các dòng Những kết quả cho thấy rằng MAGGY di chuyển ngang trong

di truyền quần thể nấm M grisea

Những kết quả nghiên cứu đó đã xây dựng một cơ sở dữ liệu về bản đồ di truyền

của quần thể nấm M grisea kí sinh trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là trên cây lúa

Cơ sở dữ liệu đó có thể được sử dụng cho những nghiên cứu sau này

Trang 25

Các dòng nấm Magnaporthe grisea được cung cấp từ Viện Lúa Đồng Bằng

Sông Cửu Long

3.3 Nội dung thực hiện

- Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea

- Thiết lập phản ứng cắt DNA genome bằng enzyme cắt giới hạn

- Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn

E.coli DH5