3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.2.Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp
- Cấy 30 l dịch vi khuẩn E.coli DH5 vào 3 ống nghiệm chứa 3 ml môi trường LB lỏng.
- Nuôi cấy lắc ở 370
C trong 4 giờ đến khi đạt được mật độ khoảng 108 tế bào/ml.
- Chuyển ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy vào thùng nước đá giữ lạnh trong
- Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, đổ bỏ phần dịch bên trên thu phần sinh khối ở bên dưới, lập lại bước này 3 lần.
- Thêm 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu
được, votex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa.
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf để làm khô kết tủa.
- Thêm 150 l CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf hòa tan phần kết tủa trên, thêm 20 l glycerol 98% trộn đều và trữ ở -700C.
3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989)
- Hút 30 l dịch tế bào vi khuẩn E.coli DH5 đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1,5 ml, thêm một thể tích phù hợp tương ứng với 100ng của DNA plasmid, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá 20 phút
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf vào nước đá, giữ lạnh trong 2 phút.
- Thêm 800 l môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200 l huyền phù tế bào đã biến nạp ở trên cho vào 3 ml môi trường
LB chứa kháng sinh Ampiciline với nồng độ 70 g/ml, nuôi cấy lắc ở 370C qua đêm.
Tôi tiến hành cùng một quy trình trên với tế bào khả nạp nhưng không cho DNA plasmid vào để làm đối chứng.
3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp
Kết quả biến nạp có thể được kiểm tra trực tiếp bằng cách nuôi trong môi trường LB chứa kháng sinh với nồng độ 70 g/ml. Những tế bào vi khuẩn nào có chứa plasmid thì có thể sống và tăng sinh trong môi trường kháng sinh, cón những tế bào nào không chứa plasmid thì không kháng lại được kháng sinh và chết. Từ đó, tôi có thể chọn lọc được dòng vi khuẩn chứa plasmid, và ly trích được plasmid mà tôi cần sử dụng với số lượng lớn.
Phƣơng pháp chiết tách plasmid sử dụng SDS-kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989)
Nguyên tắc của phương pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng, Sau khi màng tế bào bị phá vỡ, dưới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh được sự phân hủy của enzyme DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách triết, làm cho DNA genome và DNA plasmid bị biến tính. Sau đó, trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA plasmid sẽ được phục hồi nhanh chóng, DNA của bộ gen có kích thước lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA plasmid. Vì vậy, DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein và DNA genome của tế bào sẽ bị tủa suống. Như vậy, ta có thể tách DNA plasmid ra khỏi tế bào của bộ gen mà it bị lẫn DNA genome.
Chọn những ống vi khuẩn tăng sinh được trong môi trường kháng sinh ở trên để ly trích DNA plasmid theo quy trình sau:
- Hút địch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000vòng/phút trong 1 phút ở 200C để thu sinh khối.
- Hút bỏ dịch bên, tiếp tục hút dịch vi khuẩn từ những ống nghiệm tương ứng cho vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
- Cho 150 l dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, votex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
- Thêm 200 l dung dịch II, đảo nhẹ khoảng 8 lần (dịch trong eppendorf trở nên nhớt), sau đó thêm tiếp 150 l dung dịch III, đảo nhẹ eppendorf (chú ý trong bước này không nên votex).
- Ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút ở 200C, thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tương ứng.
- Thêm 1 l RNAse vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi mới thu được, ủ 370C
- Cho vào mỗi eppendorf 300 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng.
- Cho vào mỗi eppendorf 300 l chloroform/isoamylalcohol (24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng.
- Thêm vào mỗi eppendorf trên 300 l isopropanol, ủ -200C 30 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. hút bỏ dịch nổi thu kết tủa.
- Rửa tủa trên bằng ethanol 70% 3 lần, úp ngược eppendorf trên giấy thấm để làm khô DNA.
- Thêm 20 l TE 1X vào eppendorf để hòa tan kết tủa.
- Hút 4 l chạy điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra kết quả ly trích
3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit
DNA plasmid để sử dụng làm probe phải có độ tinh sạch cao nên tôi tiến hành ly trích DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid mini kit của Bio-Rad. Quy trình ly trích như sau:
- Chuyển 1ml dịch vi khuẩn vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch nổi thu sinh khối, lập lại bước này 3 lần.
- Thêm 250 l dung dịch đệm hòa tan (resuspension solution), votex hoặc dùng pipet làm tan kết tủa trong dung dịch.
- Thêm 250 l dung dịch ly trích (lysis solution), đảo ngược eppendorf 6-8 lần.
- Thêm 350 l dung dịch trung hòa (neutralization solution) trong vòng 5 phút sau khi cho dung dịch ly trích, đảo ngược từ 6-8 lần (không votex).
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 5 phút, thu dịch nổi.
- Trong khi ly tâm, tiến hành chèn cột vào ống do bộ kit cung cấp (capless wash).
- Hút dịch nổi cho vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để DNA
plasmid gắn vào màng, bỏ phần dịch bên dưới ống, lập lại bước này một lần nữa.
- Thêm 750 l dung dịch rửa vào cột, ly tâm 1 phút, sau đó ly tâm tiếp một phút.
- Loại bỏ dịch rửa chuyển cột chứa plasmid sang eppendorf 1,5 ml, thêm 50 l dung dịch elution vào màng, để 1 phút, ly tâm 1phút để tách plasmid ra khỏi màng, thu phần dung dịch chứa DNA plasmis.
3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid pMGY-SB bằng biotin
Chúng tôi sử dụng plasmid pMGY-SB đã được ly trích ở trên, có chứa đoạn MAGGY có kích thước 0,56 kp để tạo probe. Trước khi thực hiện phản ứng đánh dấu cần phải pha loãng dung dịch cross - linker thành dung dịch có nồng độ sử dụng, dung dịch này có thể bảo quản lạnh 2–80C trong một tuần. Bên cạnh đó, DNA plasmid cũng cần phải được pha loãng với nước tới nồng độ 10 ng / µl dùng để đánh dấu (nồng độ muối trong mẫu DNA nên được giữ ở mức thấp nhất, không quá 50 mM). Thực hiện phản ứng đánh dấu theo kit của Amersham gồm các bước như sau:
- Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl, biến tính hoàn toàn bởi nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nước đang sôi mạnh.
- Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4000 vòng/30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống.
- Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer vào DNA đã được làm
lạnh, đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá. - Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent, trộn nhẹ, đều.
- Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross - linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4000 vòng / 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy.
- Ủ 30 phút ở 370C cho phản ứng xảy ra.
- Probe có thể được dùng ngay, trong trường hợp muốn bảo quản lâu hơn, probe đã đánh dấu được giữ trong 50 %V glycerol ở - 150C đến – 300C trong 6 tháng (không cần xử lý gì thêm dung dịch probe này sau khi bảo quản).
3.5.4. Tạo mẫu lai
Sử dụng genomic DNA của các nòi đã được ly trích ở trên, tôi đã thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn BamHI, EcoRV và HindIII để ở thể tích 25 µl và 50 µl như sau:
Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl
BamHI HindIII EcoRV Thể tích
DNA 10X đệm BamHI Enzyme BamHI Nước DNA 10X đệm HindIII Enzyme EcoRV Nước DNA 10X đệm EcoRV
Enzyme HindIII Nước 8 µl (1µg) 2,5 µl 05 µl 14 µl Tổng cộng 25 µl Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl
BamHI HindIII Eco RV Thể tích
DNA 10X đệm BamHI Enzyme BamHI Nước DNA 10X đệm HindIII Enzyme EcoRV Nước DNA 10X đệm EcoRV
Enzyme HindIII Nước 16 µl (2-3 g) 5 l 1µl 28 µl Tổng cộng 50 l
Tôi tiến hành trộn đều thành phần của các phản ứng cắt theo tổng thể tích đã tính toán. Sau đó, hỗn hợp đó được phân chia đều thành các phản ứng riêng lẻ ra các eppendorf để thực hiện phản ứng cắt. DNA được thêm vào eppendorf chứa hỗn hợp trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở 370C trong khoảng 2 giờ (có thể qua đêm nếu cần thiết). Sản phẩm của phản ứng cắt được kiểm tra trên gel agarose 0,8%, các mẫu được bố trí theo kiểu xen kẽ, liên tiếp nhau mẫu DNA chưa cắt, đến mẫu sản phẩm cắt.
3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt DNA genome của nấm M. grisea trên gel agarose
Tôi thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, với kích thước gel 20 cm x 15 cm x 0,5 cm, gel được gắn lược 20 giếng, thực hiện bố trí như sau:
Giếng 1: Hút 10 µl DNA plasmid dùng để tạo probe như một đối chứng dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 2-9: Hút 25µl mẫu (2µg DNA đã được cắt bằng enzym cắt giới hạn) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 10: Hút 10 µl DNA plasmid dùng để tạo probe như một đối chứng dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 11-20: Hút 25µl mẫu (2µg DNA đã được cắt bằng enzym cắt giới hạn) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Tiến hành điện di ở hiệu điện thế là 50 V, trong 3 giờ. Sau đó, gel được cắt bỏ giếng, nhuộm ngắn trong ethidium bromide trong 1 - 2 phút, rửa sạch và chụp gel lấy lại hình ảnh để biện luận kết quả. Miếng gel đó sẽ được làm biến tính trước khi chuyển lên màng (chú ý miếng gel trước khi chuyển lên màng không nên để lâu trong không khí vì như thế sẽ làm cho bề mặt miếng gel bị khô và ảnh hưởng không tốt đến quá trình chuyển lên màng. Thời gian giữ gel là 15 - 30 phút khi nó được ngâm trong dung dịch đệm)
3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên
Biến tính DNA trên gel trƣớc khi chuyển lên màng nitrocellulose
Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE 0,5X. Chúng tôi thực hiện biến tính DNA như sau:
- Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần nước rửa.
- Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl
0,15 M), phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn bởi dung dịch, đem lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, rửa lại gel bằng nước cất vô trùng, đổ bỏ phần nước rửa.
- Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0), miếng gel cũng phải được ngấm hoàn toàn
trong dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.
Chuyển DNA lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên (thiết bị chuyển lên màng nitrocellulose đã đƣợc cải tiến)
Khi đã hoàn thành giai đoạn biến tính DNA trên gel agarose bằng dung dịch biến tính, tiến hành chuyển lên màng theo các bước sau:
- Dùng hộp nhựa hình chủ nhật (30 cm x 20 cm) có chứa 500 ml đệm SSC
6X, phía trên có đặt một tấm mica (24 cm x 20 cm) làm bệ của hệ thống mao dẫn.
- Cắt một tấm giấy lọc có kích thước phù hợp (30cm x 15 cm) được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt khí dùng que thủy tinh gạt theo một chiều) và hai đầu giấy ngấm vào trong dung dịch đệm để làm cầu mao dẫn.
- Úp ngược miếng gel và đặt lên trên giấy lọc, giữa miếng gel và giấy lọc tránh có bọt khí.
- Đặt màng Hybond N có kích thước (20 cm x 12 cm) được làm ướt bằng SSC 2X lên trên miếng gel tránh để bọt khí.
- Đặt hai tấm giấy lọc có kích thước 20 cm x 12 cm được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X lên trên màng.
- Đặt một chồng giấy thấm có kích thước 20 cm x 12 cm với độ cao vừa phải lên trên giấy lọc, màng và gel.
- Trên cùng được đặt vài miếng mica để giữ hệ thống và tạo lực mao dẫn. - Khoảng trống xung quanh hộp nhựa được phủ bằng saran wrap, giảm sự tác
động của môi trường xung quanh. Hệ thống được giữ qua đêm (16 giờ).
3.5.4.4. Làm khô màng nitrocellulose
Sau 16 giờ , chúng ta tiến hành làm khô màng theo cách sau:
- Loại bỏ các thành phần ở trên cho đến khi tới màng thì dừng lại.
- Đặt màng vào trong tủ sấy ở 65-800C trong khoảng 1 giờ cho đến khi các góc màng co lại là được.
3.5.4.5. Cố định DNA lên màng nitrocellulose
Màng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENE
LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng
hướng lên). Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong hộp kín cho đến khi tiến hành lai).
3.5.5. Thực hiện lai Southern sử dụng probe pMGY-SB 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai
Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 550C, đồng thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 550C. Song song đó, chúng tôi tính toán các thông số sau:
Diện tích màng: 20 x 12 = 240 (cm2 ) Thể tích đệm lai: 0.2 x 240 = 48 (ml) Nồng độ probe cần: 10 x 48 = 480 (ng) Thể tích probe: 480 / 10 =48 (µl)
Qui trình thực hiện phản ứng lai
Bước 1: Tiền lai
Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở 550C và dung dịch đệm lai cũng đã được làm nóng đến 550C, tiến hành rửa ống lai bằng nước cất vô trùng, sau đó bơm vào ống lai 40 ml dung dịch đệm lai. Dùng kẹp đặt màng vào ống lai sao cho bề không có DNA tiếp xúc với thành ống lai. Thời gian cho bước này là 15 phút.
Bước 2: Lai
Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 48 µl probe, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai (tránh nhỏ trực tiếp lên màng), phản ứng được thực hiện trong một thời gian dài, có thể để phản ứng qua đêm là phù hợp nhất (12 giờ).
3.5.5.2. Rửa màng nitrocellulose sau khi lai
Trước khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến 550C. Thực hiện rửa màng theo các bước sau:
- Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1.