3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng
Biến tính DNA trên gel trƣớc khi chuyển lên màng nitrocellulose
Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE 0,5X. Chúng tôi thực hiện biến tính DNA như sau:
- Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần nước rửa.
- Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl
0,15 M), phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn bởi dung dịch, đem lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, rửa lại gel bằng nước cất vô trùng, đổ bỏ phần nước rửa.
- Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0), miếng gel cũng phải được ngấm hoàn toàn
trong dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.
Chuyển DNA lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên (thiết bị chuyển lên màng nitrocellulose đã đƣợc cải tiến)
Khi đã hoàn thành giai đoạn biến tính DNA trên gel agarose bằng dung dịch biến tính, tiến hành chuyển lên màng theo các bước sau:
- Dùng hộp nhựa hình chủ nhật (30 cm x 20 cm) có chứa 500 ml đệm SSC
6X, phía trên có đặt một tấm mica (24 cm x 20 cm) làm bệ của hệ thống mao dẫn.
- Cắt một tấm giấy lọc có kích thước phù hợp (30cm x 15 cm) được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt khí dùng que thủy tinh gạt theo một chiều) và hai đầu giấy ngấm vào trong dung dịch đệm để làm cầu mao dẫn.
- Úp ngược miếng gel và đặt lên trên giấy lọc, giữa miếng gel và giấy lọc tránh có bọt khí.
- Đặt màng Hybond N có kích thước (20 cm x 12 cm) được làm ướt bằng SSC 2X lên trên miếng gel tránh để bọt khí.
- Đặt hai tấm giấy lọc có kích thước 20 cm x 12 cm được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X lên trên màng.
- Đặt một chồng giấy thấm có kích thước 20 cm x 12 cm với độ cao vừa phải lên trên giấy lọc, màng và gel.
- Trên cùng được đặt vài miếng mica để giữ hệ thống và tạo lực mao dẫn. - Khoảng trống xung quanh hộp nhựa được phủ bằng saran wrap, giảm sự tác
động của môi trường xung quanh. Hệ thống được giữ qua đêm (16 giờ).