3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.4.5. Cố định DNA lên màng
Màng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENE
LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng
hướng lên). Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong hộp kín cho đến khi tiến hành lai).
3.5.5. Thực hiện lai Southern sử dụng probe pMGY-SB 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai
Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 550C, đồng thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 550C. Song song đó, chúng tôi tính toán các thông số sau:
Diện tích màng: 20 x 12 = 240 (cm2 ) Thể tích đệm lai: 0.2 x 240 = 48 (ml) Nồng độ probe cần: 10 x 48 = 480 (ng) Thể tích probe: 480 / 10 =48 (µl)
Qui trình thực hiện phản ứng lai
Bước 1: Tiền lai
Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở 550C và dung dịch đệm lai cũng đã được làm nóng đến 550C, tiến hành rửa ống lai bằng nước cất vô trùng, sau đó bơm vào ống lai 40 ml dung dịch đệm lai. Dùng kẹp đặt màng vào ống lai sao cho bề không có DNA tiếp xúc với thành ống lai. Thời gian cho bước này là 15 phút.
Bước 2: Lai
Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 48 µl probe, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai (tránh nhỏ trực tiếp lên màng), phản ứng được thực hiện trong một thời gian dài, có thể để phản ứng qua đêm là phù hợp nhất (12 giờ).
3.5.5.2. Rửa màng nitrocellulose sau khi lai
Trước khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến 550C. Thực hiện rửa màng theo các bước sau:
- Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1. Nhiệt độ và số vòng quay của buồng lai giống như khi lai, thời gian rửa là 10 phút.
- Lặp lại bước trên cũng trong 10 phút.
- Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng ra và cho vào hộp nhựa sạch với bề có DNA nằm trên. Cho vào đó dung dịch rửa 2 (secondary wash buffer) khoảng 50 ml, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Lặp lại bước trên trong 10 phút. Lúc này màng có thể được giữ trong dung dịch rửa 2 trong 30 phút để chuẩn bị cho bước phát hiện.
3.5.5.3. Phát hiện kết quả bắt cặp giữa probe và đoạn DNA đích bằng huỳnh quang và thể hiện trên X-ray phim
Chuẩn bị màng với chất phát hiện CDP - Star
Màng sau khi được rửa lần 2, sẽ được phủ lên trên một lớp dịch của chất phát hiện, chất này làm cho các phân tử probe phát sáng. Các bước thực hiện như sau:
- Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp khăn giấy.
- Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran wrap với bề có DNA hướng lên trên.
- Hút 1000 µl chất phát hiện CDP- Star nhỏ lên trên màng.
- Dùng một tấm saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí.
- Sau đó, màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với kích thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để màng bị khô).
Ủ màng nitrocellulose với X-ray phim trong cassette
Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica 30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của màng. Đậy cassette lại và tính thời gian ủ 30 phút hoặc 1 giờ (thường phản ứng sẽ có tín hiệu sáng tốt nhất sau 1 giờ từ khi cho chất phát hiện vào). Tùy theo tính chất probe mà thời gian ủ phản ứng phát hiện khác nhau. Các thao tác trên được thực hiện trong buồng tối.
Khi đã hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim sẽ được đem ra khỏi cassette và ngâm trong dung dịch developer trong 5 phút. Sau đó, lấy phim ra và ngâm trong dung dịch fixer khoảng 3 phút. Cuối cùng đem phim ra rửa dưới vòi nước sạch và dùng kẹp treo lên giá làm khô ở nhiệt độ phòng.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea.
Giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn tuy dễ thực hiện nhưng không đơn giản. Để có thể triết tách được một lượng DNA tốt và có thể sử dụng cho những nghiên cứu sau này, thì ngoài phương pháp cần phải có một kinh nghiệm trong thao tác. Giai đoạn này đóng vai trò quan trọng đầu tiên cho phép phản ứng lai thành công hay không.Việc tách chiết phải đảm bảo có lượng DNA có trong mẫu và lượng DNA phải đủ lớn để có thể phát hiện được qua lai với probe. Các thao tác phải nhẹ nhàng để tránh DNA bị gãy. Kết quả tách chiết có ý nghĩa cao là phải đảm bảo độ tinh khiết cao không còn hóa chất ly trích sót lại.
Sau khi tiến hành tách chiết DNA theo đúng qui trình, chúng tôi thu được lượng DNA của các mẫu như sau:
Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea.
Nấm sau khi nuôi cấy trong máy lắc định ôn 370C, qua 72 giờ được ly trích DNA, DNA sau ly trích được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút.
Kết quả điện di trong hình 4.1 cho thấy, tất cả các mẫu đều thu được DNA tổng số có nồng độ cao và ít bị đứt gãy. Tuy nhiên, các mẫu còn lẫn tạp chất nhiều. Các vệt sáng kéo dài phía dưới có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy. Lỗi này có thể la do lắc mạnh trong quá trình sau khi cho phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), khiến DNA bị đứt gãy nhiều. Mặt khác do quá trình ly trích tôi không sử dụng enzym RNAse nên lượng RNA lẫn tạp trong mẫu còn nhiều. Riêng mẫu CT72 và CT64 có hai băng, điều này có thể lý giải là trong quá trình nuôi cấy mẫu bị nhiễm khuẩn và do DNA genomic vi khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ hơn nên di chuyển trước và tạo thành 2 băng. Từ thực nghiệm, chúng tôi rút ra được những điểm cần lưu ý trong quá trình ly trích:
- Cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối trong quá trình cấy và tăng sinh khối sợi nấm. Nếu môi trường tăng sinh không bị nhiễm khuẩn thì sau khi ta thu sinh khối là phần sợi nấm thì phần dịch còn lại trong và có màu vàng óng.
- Bước thu sinh khối không nên để sợi nấm quá khô, tốt nhất nên nghiễn sinh khối nấm trong nitow lỏng ngay sau khi thu thí chất lượng DNA sẽ tốt hơn. CT64 CT375 LA415 CT104 LA18 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72 KG216 KG531
- Thao tác phải nhẹ nhàng trong khi ly trích, dặc biệt là sau khi thêm hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), chỉ nên nghiêng ống nghiệm (hoặc eppendorf) một cách cẩn thận không nên lắc mạnh.
- Thu phần dịch nổi không nên hút phần cặn phía dưới, đặc biệt là không được hút vào phenol phía dưới. Phenol có thể phá hủy DNA sau khi ly trích. - Khi thêm isopropanol (ethanol 100%) thì ta nên ủ trong tủ -200C trong 30-
60 phút, để DNA có thể tủa hoàn toàn.
- DNA phải được rửa nhiều lần với ethanol 70% để loại bỏ bớt tạp chất và nên làm khô DNA hoàn toàn (có thể để trong tủ cấy qua đêm).
- Khi điện di DNA tổng số thì nồng độ gel từ 0,6-0,8% là phù hợp.
Tuy nhiên, để đảm bảo cho phản ứng cắt và phản ứng lai xảy ra tốt hoặc biết được nguyên nhân nếu phản ứng không cho kết quả tốt, tôi cố gắng hoàn thiện tốt từng giai đoạn. Sản phẩm ly trích còn nhiều tạp nhiễm, do đó tôi tiến hành loại bỏ tạp nhiễm bằng RNAse.
Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi đƣợc xử lý với RNAse.
DNA sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút.
Nhìn chung, kết quả tinh sạch tương đối tốt nhưng DNA còn bị đứt gãy nhiều. Một số mẫu không có DNA mà chỉ là những vệt sáng mờ như mẫu CT375, KG535,
LA415 LA18 KG531 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72
CT72, KG531. Nguyên nhân có thể do trong thao tác không cẩn thận làm DNA bị đứt gãy hoặc do DNA không tủa hoàn toàn và do đó không thu được DNA. Để khắc phục hiện tượng này tôi đề nghị nên sử dụng NaOAc kết hợp với ethanol để DNA có thể kết tủa tốt hơn. Tuy nhiên với dộ tinh sạch đó ta có thể sử dụng để thực hiện làm mẫu cho phản ứng lai.
4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α
Sau khi biến nạp, tôi chọn phương pháp chọn lọc trực tiếp trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 70µg/ml, để chọn lọc những dòng vi khuẩn E.coli DH5α có chứa plasmid. Kết quả ly trích vi khuẩn E.coli DH5α được nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 370
C:
Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8%.
DNA plasmid ly trích từ vi khuẩn E.coli DH5α tăng sinh trong môi trường LB chứa 70µg/ml Ampicilin. Plasmid được điện di trên gel agarose 1%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50V, thời gian 45 phút. Mẫu pMGY-SB (1,2), pEBA 18 (3,4), pMGR-T1 (5,6).
Kết quả cho thấy quá trình biến nạp thành công và vi khuẩn chứa plasmid có thể sống trong môi trường kháng sinh (70 g/ml). Các mẫu 2,4,6 là mẫu plasmid chuẩn được cung cấp để thực hiện biến nạp, mẫu 1, 3 là mẫu plasmid được ly trích trong đó có sử dụng RNAse, mẫu 5 không sử dụng enzyme RNAse trong quá trình ly trích nên còn lẫn tạp chất nhiều. Kết quả ly trích không có lẫn DNA genomic của vi khuẩn.
Riêng mẫu 4 và 5 có hai băng, nguyên nhân là do plasmid tồn tại ở hai dạng: dạng vòng và dạng xoắn.
4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn
Trong 30 dòng nấm Magnaporthe grisea ly trích được, tôi chọn ra 10 dòng để thực hiện phản ứng cắt với hai enzym BamHI và EcoRV, nhằm chuẩn bị mẫu cho phản ứng lai. Tôi thực hiện phản ứng cắt với thể tích là 40µl, nồng độ mẫu DNA được cắt là 2 µg, ủ ở 370C qua đêm. Sau đó, hút 4 µl sản phẩm cắt và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả điện di như sau:
a)
b)
Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn.
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%, trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50V, thời gian 1 giờ. Hình a) các mẫu DNA được cắt bằng enzyme BamHI, hình b) các
mẫu DNA được cắt bằng EcoRV. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Kết quả cho thấy sản phản ứng cắt không hoàn toàn đối với các mẫu số 1 và 2 trên cả hai enzym EcoRV và BamHI. Phản ứng cắt không tốt có thể là do mẫu DNA ly trích không được tốt nên không thực hiện được phản ứng cắt. Những mẫu cắt không hoàn toàn và những mẫu cắt quá vụn như vậy sẽ không có ý nghĩa trong quá trình tạo mẫu lai. Phản ứng cắt không hoàn toàn nguyên nhân là do nồng độ DNA quá nhiều so với nồng độ mà một đơn vị enzym có thể cắt được.
4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi đƣợc cắt bằng EcoRV và BamHI với probe SB
Thí nghiệm 1:Lai ở 550C, thời gian lai là 16 giờ, thời gian ủ phát hiện là 30 phút.
Sản phẩm cắt DNA genome của M. grisea với hai enzyme EcoRV và BamHI được dùng làm mẫu lai, 15 µl mẫu được load trên miếng gel agarose 0,8% kích thước 20 x 15 x 0,7 cm. Plasmid pMGY-SB được bố trí là mẫu đối chứng dương cho phản ứng lai. Probe đánh dấu sử dụng cho phản ứng lai là plasmid pMGY-SB có kích thước 3,54 kp. Điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V, thời gian 4 giờ. DNA sau khi điện di được chuyển lên màng trong thời gian 16 giờ. Sau đó, tiến hành phản ứng lai ở 550C, thời gian là 16 tiếng. Tôi thực hiện bước phát hiện, tác nhân phát hiện được cho trực tiếp lên màng lai, để 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ tác nhân phát hiện thừa rồi ủ màng lai với phim trong thời gian 30 phút. Rửa phim với dung dịch rửa phim.
Sản phẩm lai xuất hiện trên nền phim sau khi rửa. Đây là kết quả của sự bắt cặp giữa probe đánh dấu với DNA plasmid và DNA genomic của nấm M.grisea sau khi ly trích. Các mẫu DNA được cắt bằng 2 enzyme BamHI và EcoRV thì sự bắt cặp với probe không xảy ra. Kết quả này chứng minh được DNA được biến tính hoàn toàn trên gel và có thể bắt cặp được với probe đánh dấu, nhiệt độ lai là 550C, thời gian lai là 16 giờ thì probe đã bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu, nhưng không đặc hiệu. Điều này có thể chứng tỏ rằng nhiệt độ lai thấp. Tuy nhiên, các mẫu sử dụng làm thí nghiệm thì không có hiện tượng bắt cặp. Điều này có thể được lý giải từ những nguyên nhân sau:
- Quá trình chuyển DNA lên màng chưa hoàn toàn do nồng độ gel cao và kích thước gel dày (0,7cm), cũng có thể do kích thước DNA lớn nên khó chuyển lên màng.
- Trình tự DNA mục tiêu hiện diện trên màng ít, probe không thể phát hiện được.
- Sự liên kết giữa trình tự DNA mục tiêu với probe đánh dấu lỏng lẻo, nên trong quá trình rửa màng, probe đã bị cuốn trôi theo dung dịch rửa.
Thí nghiệm 2: Lai ở 600C, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút
Tôi thực hiện phản ứng lai với các mẫu LA415 (1), LA18 (2), VL265 (3), VL 37 (4), VL 52 (5), VL45 (6), AG 518 (7), TG24 (8), KG535 (9) được cắt bằng hai enzyme BamH I và Eco RV. Khắc phục những nguyên nhân nêu ở thí nghiệm 1 tôi thực hiện các bước có cải tiến. 30 µl mẫu được load vào giếng trên miếng gel kích thước 20 x 15 x 0,5 cm, điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V, thời gian 6 giờ. Thời gian chuyển DNA lên màng là 20 giờ. Tôi thực hiện phản ứng lai ở 600C, thời gian 20 tiếng. Kết quả thực hiện như sau:
Hình 4.5. kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai.
ĐC(+) 1 2 3 4 5 6 7 8 9ĐC (+)1 2 3 4 5 6 7 8 9 BamHI EcoRI
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện thế 50V, thời gian 5 giờ, trong đệm TAE 0,5X. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4),
VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)).
Kết quả tạo mẫu lai cho thấy sản phẩm cắt chưa tốt để thực hiện một phản ứng lai. Các mẫu 2 và 7 bị cắt quá vụn nên các mẫu điện di có thể bị chạy ra ngoài sau một thời gian điện di quá dài. Mẫu 1 và 9 được đánh giá là tốt nhất. So sánh về kích thước của sản phẩm cắt với plasmid pMGY-SB có kích thước 3,52 kb, thì ta thấy các đoạn DNA cắt ra từ genome đều có kích thước nhỏ hơn 3,5 kb, từ đó có thể nhận xét rằng kích thước các đoạn phân cắt có thể quá nhỏ và điều này cũng ảnh hưởng tới khả năng bắt cặp của DNA mục tiêu với probe. Các băng điện di không thẳng do điện cực ở máy điện di không ổn định trong quá trình điện di hoặc do bồn điện di bị rung trong quá trình điện di. Trong điều kiện này, kết quả điện di tạo mẫu lai không phản ánh thực được sự di chuyển theo kích thước của các đoạn DNA từ đó kết quả phản ứng lai không có ý nghĩa khi phân tích sự đa dạng. Những kết luận rút ra được là :
- Sản phẩm cắt phải có nồng độ đều nhau.
- Sản phẩm cắt phải tạo thành một vết sáng đêu trên gel sau khi điện di