Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana

Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên côn trùng gây hại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƯ NGỌC

KHÓA: 28

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY

***000***

RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN

Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana

ACCOSIATED WITH INSECT

GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

PROFESSOR STUDEN

VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC TERM: 28

HCMC 9/2006

iii

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:

 Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô

đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi

 ThS Võ Thị Thu Oanh đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

 TS Bùi Minh Trí –Trưởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

 Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm

 Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hưng đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

 Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phượng Vĩ Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi

 Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

TĨM TẮT

Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của

hai dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên cơn trùng

gây hại ” được thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005 tại trường Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Đề tài do Trần Như Ngọc thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS Võ Thị Thu Oanh

Đối tượng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria

bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại Nấm này cĩ tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng

hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thường của cơn trùng dẫn đến cơn trùng bị chết khơ

Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dịng nấm

Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana

giúp chọn lọc đúng những dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana

cĩ tính độc đảm bảo hoạt tính diệt cơn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản xuất nơng nghiệp

Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

1 Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian

trên một số cơn trùng gây hại

2 Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 liên quan đến tính độc của hai dịng nấm Metarrhizium anisopliae và

3 Sau khi thực hiện phản ứng PCR ta sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng

enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng IST1-5.8S-IST2 của nấm

Beauveria bassiana và vùng Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae

4 Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này

với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank)

Kết quả thu được như sau:

1.Phục hồi các dịng nấm Metarrhizium và Beauveria trên mơi PGA:

Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trường Agar),kết quả chúng tôi đã thu được một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy : RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6 ,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96

PGA(Potato-Glucose-2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trường

lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu được sinh khối nấm ,rửa lại với nước cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi được nấm ở dạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -800C cho đến khi sử dụng

3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích

được DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA của các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản

phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ được DNA của 12 mẫu nấm

4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết quả thu được sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria

5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6

dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR kếtquả chưa

nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dòng nấm do mức độ tương đồng giữa các dòng nấm khá cao Tuy nhiên thu được kích thước các band trên gel so với Ladder là

hoàn toàn trùng khớp với kích thước band DNA chuẩn của các dòng nấm Beauveria

MỤC LỤC

CHƯƠNG

TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii

1.3.Yêu cầu nghiên cứu 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học 3

2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh 4

2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae 5

2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille 6

2.3.Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm nấm 8

2.4.Sơ lược về phương thức xâm nhiễm 9

2.5.Hoạt tính sinh học 11

2.6.Một số nghiên cứu trong và ngoài nước 11

2.6.1.Nghiên cứu trong nước 11

2.6.2.Nghiên cứu ngoài nước 12

2.7.Vai trò của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 14

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1.Thời gian và địa điểm 19

3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm 19

3.2.2.2 Các hóa chất dùng trong điện di 20

3.2.2.3 Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR 20

3.2.2.4.Môi trường 20

3.2.3.Các thiết bị chính 21

3.3.Nôi dung nghiên cứu 21

3.4.Phương pháp nghiên cứu 21

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm 30

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium 9

Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh trên ong 13

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4

SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1 RNBT1.7 : Rầy nâu Bến Tre 1.7 DONG3.1 : Dòng 3.1

BXĐTG6 : Bọ xít đen Tiền Giang 6 RMTĐ3 : Rầy mềm Thủ Đức 3

PULQ2 : Rệp vải mềm nâu tím Quận 2 SR : Sâu róm

BRVT6 : Bọ rầy Vũng Tàu 6 BHBD6 : Bọ hà Bình Dương 6 PM : pico mol

Ng : nano gram nm : nano mol

g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA

dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA

UI : unit international bp : base pair

Kb : kilo base CZA : Czapek – Dox

SDS : Sodium dodecyl sulphate PGA : Potato glucose agar SDA : Soduim dedocyl sulphate

RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature

PCR : Polymerase Chains Reaction

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid

ITS : Intenal Transcribed Spacer Taq : Thermus aquaticus

TAE : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat TE : Tris ethylene diamine tetra acetate

ix

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay với tốc độ phát triển như vũ bão của khoa học và công nghệ đã kéo theo hàng loạt những thay đổi trong đời sống xã hội của con người: kinh tế, chính trị, xã hội,… rồi đến đời sống vật chất, tinh thần,… Thông qua đó đặt ra một vấn đề hết sức cấp thiết làm sao giải quyết tốt vấn đề lương thực thực phẩm cho con người Thực tế cho thấy việc áp dụng thành công trong khoa học – công nghệ vào sản xuất nông nghịêp nhằm nâng cao năng xuất cây trồng đã được ứng dụng từ nhiều năm nay và đã đem lại nhiều kết quả đáng kể như: tạo giống bưởi không hạt, bưởi da xanh có chất lượng tốt, mùi vị ngon, ngọt và không xử lý hóa chất (Viện Cây Ăn Quả Miền Nam); hay tạo giống lúa ngắn ngày có khả năng chống chịu tốt, hạt gạo mềm, dẻo, thơm, đặc biệt là năng suất tăng so với nhiều giống trước đó bằng việc xử lý yếu tố di truyền trong gen (Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long )….Đây chính là những thành tựu trong lĩnh vực Bảo Vệ Thực Vật nói chung và của Công nghệ Sinh học nói riêng

Chính vì tính chất quan trọng của ngành Bảo Vệ Thực Vật (cũng như Công Nghệ Sinh Hoc) trong Nông Nghiệp và đời sống, nên chúng tôi đã thực hiện đề tài

“Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm

Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên côn trùng gây hại” Từ

việc xác định chính xác trình tự của nucleotide trên gen phát sinh độc tố của nấm ký sinh trên côn trùng gây hại cho hoa màu, ta có thể chủ động hơn trong quá trình tác động lên gen gây độc, nhằm diệt nấm đạt hiệu quả cao nhất, giảm thiệt hại do côn trùng phá hoại, nâng cao năng suất cây trồng, tạo sản phẩm sạch, an toàn và thân thiện với môi trường

1.2 Mục đích và yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích

Làm cơ sở khoa học cho việc xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây độc nhằm tạo ra được thuốc trừ sâu sinh học có hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay

2

1.2.2 Mục tiêu

Bằng kỹ thuật RFLP và đọc trình tự cho phép xác định gen Pr1 và vùng gen ITS1 - 5.8S - ITS2 sau đó tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1 giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae, và trình tự nucleotide của vùng gen ITS1- 5.8S -ITS2 giữa các dòng nấm Beauveria bassiana

1.2.3 Yêu cầu nghiên cứu

Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana từ

nhiều cây trồng khác nhau

Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana bằng phương pháp PCR

Sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện

sự đa hình trong phạm vi vùng gen độc Pr1 của các dòng nấm Metarrhizium

anisopliae và ITS1 – 5.8S – ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana

Xác định trình tự nucleotide của vùng gen gây độc Pr1 và ITS1 – 5.8S – ITS2

trên hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basisiana

1.3 Đối tượng nghiên cứu

Một số loài thuộc hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana

vuille thu thập ở các tỉnh thành khác nhau như: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Tiền

Giang, Bến Tre, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho côn trùng trên các đối tượng cây trồng khác nhau

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay

Dưới áp lực tạo ra nguồn sản phẩm nông nghiệp với sản lượng cao, chất lượng tốt, giảm giá thành và giảm ảnh hưởng đến môi trường, chúng ta phải tăng cường sử dụng biện pháp sinh học một cách có hệ thống

Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây trồng nông lâm nghiệp theo định hướng tăng cường sử dụng các tác nhân sinh học và chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc là một hướng nghiên cứu ứng dụng mới mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, bảo vệ môi trường và cân bằng sinh thái

Có nhiều cách để sử dụng biện pháp sinh học, bao gồm: Sử dụng ký sinh thiên địch chuyên tính, thường là ký sinh

Sử dụng ký sinh thiên địch không chuyên tính, thường là các loài ăn thịt sâu hại

Biện pháp dòng hoá đực làm cho sâu hại không thể sinh sản được Sử dụng vi sinh vật có ích

Biện pháp dẫn dụ giới tính để phòng trừ sâu hại

Biện pháp sinh học trong IPM giúp cho việc loại bỏ một số nhược điểm của các biện pháp hoá học thường dùng trước đây

Ưu điểm của biện pháp vi sinh vật gồm:

Ngăn chặn sự phát triển tính kháng trong quần thể sâu bệnh và cỏ dại Giảm bớt hoặc giảm hoàn toàn sử dụng thuốc hoá học, giữ được quần thể sâu hại phát triển ở mức thấp nhất, tránh bộc phát thành dịch

Bảo vệ được côn trùng có ích và các vi sinh vật có ích khác, hạn chế sâu bệnh thứ cấp trở thành sâu bệnh chính

Bảo vệ được sức khỏe con người và tránh ô nhiễm môi trường (Trần Văn Mão, 2004)

2.2 Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng

Cũng như vi khuẩn, nhiều nấm liên quan với côn trùng như sinh vật cộng sinh hoặc hoại sinh, nhưng có nhiều loài nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tượng bệnh lý và dẫn đến sự chết của côn trùng Theo Steinhaus (1949) (trích dẫn Nguyễn Lân Dũng,

4

1981) nấm ký sinh côn trùng trong tự nhiên có thể gây chết thường xuyên với tỷ lệ cao cho nhiều loài côn trùng gây hại và là những tác nhân điều hoà quần thể vi sinh vật trong tự nhiên rất hiệu quả Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thường, vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng Cơ thể côn trùng chết do nấm không bị tan rã, mà thường giữ nguyên hình dạng ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm (Nguyễn Lân Dũng, 1981).Nấm gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thủy sống dưới nước đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn Nấm gây bệnh cho côn trùng có mặt ở trong cả 4 lớp nấm: nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất toàn Deurteromycetes

- Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: trong lớp nấm này, các loài ký sinh trên côn trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales Đặc biệt có những họ nấm gồm tất cả các loài đều là ký sinh trên côn trùng như Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae

- Lớp nấm túi Ascomycetes: trong lớp nấm túi có bộ Laboubiniades là những nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, còn các loài nấm túi khác đều là nội ký sinh của côn trùng Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là:

Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales)

- Lớp nấm đảm Basidiomycetes: trong lớp nấm đảm chỉ ở hai giống có các loài

gây bệnh trên côn trùng, đó là giống Septobasidium và Uredinella

- Lớp côn trùng đều thuộc bộ Moniliades Những giống Beauveria, Spicana,

Metarrhizium, Cephalosporium và Sorosporella chứa các loài nấm khi xâm nhiễm vào côn

trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định.

2.2.1 Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae

Metschinikov đã phát hiện nấm này đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì,Chúng gây bệnh cho côn trùng sống trong đất Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong các bộ phận nội quan Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh xám Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào loài và tuổi vật chủ cũng như nguồn bệnh ban đầu Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình phát triển bệnh lý thì côn trùng chết

- Nấm Metarrhizium anisopliae có 2 dạng: M anisopliae var major có bào tử dài với kích thước bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M anisopliae var anisopliae

có bào tử ngắn với kích thước bào tử túi là 3,5 – 9.0(thường 5,0 – 8,0) m Nấm xanh

(nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng,

Nguyễn Huy Văn, 2000)

- Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ:

Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài), Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài) Nấm xanh có thể nuôi cấy trên môi trường thức ăn nhân tạo

- Metarrhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ

Coleoptera Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm

bệnh bởi Metarrhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997) Ngoài ra Metarrhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi

Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc

họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae Nấm này phân

bố rộng trong tự nhiên

- M anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu

tối hoặc hồng vỏ quế Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trường PGA sau 10 ngày nuôi cấy ở 20oC có đường kính 2 cm

Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ) Ở những

nơi không có côn trùng cũng phân lập được Metarrhizium anisopliae: nang của Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng

cỏ ở New Zealand Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nước Đức, ở đất rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông, đất đầm lầy trồng cây đước, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân

lập được Metarrhizium anisopliae

* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarrhizium anisopliae:

Không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có chitin

Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5

Metarrhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin

(lông và da côn trùng) (Trần Văn Mão, 2004)

2.2.2 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille

- Nấm Beauveria bassiana cũng như Metarrhizium anisopliae là nấm thiên

địch ký sinh trên côn trùng gây hại, bào tử nấm thường có kích thước thường dài hơn 3µmdạng bào tử túi.Nấm Beauveria bassiana thuộc lớp: Deuteromycetes, họ

Moniliacea, bộ Moniliales, Giống: Beauveria.Giống Beauveria thường được chia thành 3 loài: Beauveria bassiana, Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh côn trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương

Giang, 1997)là nấm trắng thường gây bệnh cho:rầy nâu, sâu cuốn lá, sâu dục thân,bọ xích hại lúa, bọ xích đen,….Nó hủy hoại các mô mềm và dịch cơ thể ký chủ, chúng phát triển bên ngoài rồi mọc đầy trên cơ thể ký chủ, hút hết dưỡng chất cho đến khi ký chủ chết, khi ký chủ chết nó hình thành bào tử và phát tán bào tử trong không khí nhờ nước và gió.Tuy nhiên để phát tán nó đòi hỏi cần phải có ẩm độ kéo dài để bào tử có thể lan đi nhờ gió và nước

- Bào tử trần hình cầu (đường kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-5,5 x 1,3 m) Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi trường, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng, Nấm khi mọc trên côn trùng thường có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề mặt trơn và có nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi( Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển là khỏang trên dưới 250C tốt nhất từ 250

C- 300C trong trường PDA (Potato-Dextrose-Agar), trong khỏang 3-6 ngày nuôi cấy

nấm phát trịển mạnh lúc này nấm có màu vàng nhạt hoặc màu trắng, đường viền đôi khi có màu kem hoặc hơi đỏ.Bào tử thường có hình cầu, hình trứng, có khi chiều dài

lên tới 20 m với 1 m chiều rộng Có khỏang 9 lòai Beauveria bassiana được phân

lập, sử dụng trong nghiên cứu trong kỹ thuật rRNA Sequencing.

Theo Veliska (1967), giá trị pH môi trường từ 3 - 9 không ảnh hưởng tới sự

phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral(1970) nấm

Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trường, pH

thuận lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0 Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả

năng phát triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,4 (trích dẫn bởi

Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp Giống như hầu hết các loại nấm

diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành

thành viên trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên Vì là vật ký sinh chuyên hóa rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính Khả năng nhiễm thành công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm khác nhau: qua lớp cutin, qua đường tiêu hóa, qua đường hô hấp và

qua lỗ của thân Ngoài ra, nấm Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong

điều kiện môi trường không thuận lợi dưới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh

dưỡng kết lại thành một thể rắn chắc).Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria

bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì: chúng có thể phát triển trên môi trường dinh

dưỡng, có thể được chế tạo ở dạng chế phẩm sinh học, và tiêu diệt một lượng không nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào

tử nảy mầm Tên thông thường của độc tố là beauverixin, công thức hóa học C45H57O9N3 - ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)3 Đó là một loại depxipeptit vòng có điểm sôi 93 - 94oC (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Vì tính chất quan trọng của nấm trong vai trò điều khiển cân bằng sinh học trong tự nhiên nói chung và trong bảo vệ thực vật nói riêng nên hiện nay nhiều nghiên cứu trên thế giới về nấm được áp dụng, một số kỹ thụât được áp dụng trong

8

nhận diện nấm Beauveria bassiana vuille những nghiên cứu gần đây là :sử dụng

Isozymes (St Legent et al , 1992;Poprawski et al ,1998), rRNA Sequences (Rakotonirainy et al ,1991), phân tích RFLP (Kosir,Macpherson và Khatchatourians.,1991 ; Maurer et al ,1997) Trong đó vịêc áp dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với PCR cho kết quả khả quan hơn cả

2.3 Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm

Nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana được nghiên cứu sản xuất để

trừ một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí nghịêm và ở nhà lưới Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lưng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2% Hiệu

lực diệt các loài rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động

từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài rầy hại lúa trong vụ

Dùng nấm B bassiana vuille để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm) Nấm B bassiana không gây ảnh

hưởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần Văn Mão, 2004)

Nấm M anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu

Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M flavoviride gây chết 100% châu

chấu thí nghiệm sau 7 ngày Chế phẩm nấm diệt châu chấu được tiến hành ở Bà Rịa –Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tương đối tốt nhưng không đều (Trần Văn Mão, 2004) Nghiên cứu gần đây của Hệ Thống Nghiên Cứu Nông Nghiệp Hội Đồng Khoa

Học Công nghệ Việt Nam cho kết quả như sau:nấm Beauveria bassiana ký sinh trên

sâu róm hại thông có khả năng trừ sâu là đến 93.6% Còn tác dụng khi sử dụng kết

hợp hai lọai nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae trong vịêc trừ hại

cho bọ dừa đạt hiệu quả từ 56%-97% (www.vnast .gov.vn/index asp……)

Ở Bolivia, các nhà nghiên cứu thuộc công ty PROBIOMA đã sản xuất thành công nhiều chế phẩm sinh học từ nhiều loài nấm thiên dịch khác, trong đó có hai loài

nấm phổ biến là Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae và chế phẩm trên

thị trường là: ProbioBass, ProbioMet

BASSIANA VUILLE DIỆT CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium (Nguồn : www.probioma.org.bo)

2.4 Sơ lược về phương thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng

- Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua lớp vỏ cơ thể Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm Nấm tiết ra loại men làm mềm lớp vỏ chiti mầm, qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh được côn trùng chích hút và cả những pha phát triểncủa côn trùng như trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký sinh được

- Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đường miệng.Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các bào nội quan để gây bệnh Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm sống ở nước Dưới tác động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tượng ngừng nhu động ruột của vật chủ Bào tử nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng nhưng rất ít

Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết

Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên

10

trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết

- Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển qua màu xanh lục

- Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trưởng phát triển để hoàn thành một chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới Nấmgây bệnh côn trùng có tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất định của vật chủ Nhiều trường hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng, có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau

- Để có thể gây được những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên Đặc điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thước của nó Điều đó tạo khả năng phát tán rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng Sự phát tán có hiệu quả cao hay không ở mức độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào

gồm 18 nguồn Beauveria và 10 nguồn Metarrhizium Chúng được phân lập từ các

loại côn trùng khác nhau, gồm sâu đo xanh, châu chấu hại cam, sâu khoang hại lạc, rầy nâu hại lúa, sâu đục thân ngô, sâu xanh hại bông, sâu cắn gié, bọ xít đen, bọ xít

dài (Nguyễn Văn Tuất, 2000)

- Theo Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn được môi trường nhân giống cho

các chủng Metarrhizium anisopliae là môi trường Saubouraund có bổ sung vỏ trấu.Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ Beauveria

bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thông và cho biết sâu chết 80% sau

một năm xử lý

- Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm, sản xuất và ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Ngoài ra, ở nước ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu hại đậu nành Theo Tống Kim Thuần, Vũ Quang Côn (2001), các vi nấm có khả năng gây bệnh sâu hại

trên đậu tương chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae và Normurea rileyi Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại thuộc bộ cánh vảy –

Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng - Hemiptera

- Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nước ta khá phong phú Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương

pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 108 bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt nhất theo phương pháp này là 10 ngày, chế phẩm được làm khô ở nhiệt độ 45o

C trong 8 giờ và có thể được bảo quản trong thời gian 6 tháng Khi thử nghiệm phương pháp lên men chìm có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trường có pepton, cao nấm

men và muối khoáng thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 109

bào tử/gam Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lưng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 108 bào tử/ml Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm

- Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nòi nấm có hiệu lực diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy Sử dụng phương pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn được các chủng nấm diệt sâu có độc tính cao Từ

các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập được 9 chủng nấm Beauveria bassiana

từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có hiệu lực diệt trùng ấu

12

trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trưởng thành và sâu xanh da láng nhưng ở các mức độ

khác nhau Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng

khoai lang ở Thủ Đức Thị Hương Giang, 1997)

- Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế

bassiana và Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ

cánh cứng hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ

cả thành trùng và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa

2.6.2 Nghiên cứu ngoài nước

- Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại có lịch sử khá lâu đời, Meschnikoff (1884) là người đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Theo Juntin L.Hatting, Richard A Humber, Tadeusz J Poprawski và Ray M Miller (1999), các nghiên cứu về nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi được định hướng từ năm1995-1998, và cho biết trong 8 lòai nấm được tìm thấy đều lan truyền và giết

chết rầy mềm, gồm có 6 lòai thuộc Entomophthorale Pandora neoaphidis,

Connidiobolus thromdoides, C.corcnatus, Entomophthora planhoniana và Neozygites fresenii) và hai lòai thuộc Hyphomycetes (Beauveria bassiana, verticillium lecanii)

Theo A.M Kammp và M J Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất

bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria

bassiana và Verticillium lecanii được đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm , 3mm,

4mm tương ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trường khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm

Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trường PDA ở độ

sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trường

YPDA và độ sâu của môi trường thì không đáng kể Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), thì Codaira Y (1961) đã tách được hai độc tố

ở nấm Metarrhizium anisopliae là destruxin A, liều gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng

lượng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lượng cơ thể

.

Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana ký sinh trên ong

(nguồn: wescaco.ars.usda.gov)

Glare và Inwood (1998) đã so sánh di truyền các giống Beauveria phân lập

từ New Zealand bằng hai phương pháp RAPD và RFLP Kết quả phân tích RAPD sử dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập được thành 4 nhóm có kiểu di

truyền khác nhau: nhóm nhân không đồng nhất B bassiana/B brongniartii, nhóm B

bassiana, nhóm B brongniartii và một nhóm gồm các giống Beauveria khác Sử dụng

enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy có sự khác biệt về di truyền

giữa giống B bassiana và nhóm nhân không đồng nhất B bassiana/B brongniartii

2.7 Phương pháp phát hiện gen Pr1 và vùng ITS1 -5.8S – ITS2:

Có nhiều phương pháp khác nhau (như ELISA, allozyme electrophoresis hoặc RFLPs) có những ưu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc đòi hỏi số lượng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993) Sự phân lập DNA thì tốn nhiều thời gian và giới hạn số lượng mẫu có thể phân tích được trong thời gian thích hợp RAPD – PCR thì cũng được sử dụng để mô tả đặc điểm những giống

Metarrhizium anisopliae Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thường

không ổn định, chỉ có thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuôi cấy ở ký chủ

Sử dụng phương pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của

những giống Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana lây nhiễm trên côn

trùng Đó là phương pháp kết hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR),

dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St Leger và ctv, 1992) được tiết ra bởi nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S – ITS2 được tiết ra bởi nấm Beauveria bassiana và men cắt giới hạn các sản phẩm

PCR hai vùng này