3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng
Sử dụng genomic DNA của các nòi đã được ly trích ở trên, tôi đã thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn BamHI, EcoRV và HindIII để ở thể tích 25 µl và 50 µl như sau:
Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl
BamHI HindIII EcoRV Thể tích
DNA 10X đệm BamHI Enzyme BamHI Nước DNA 10X đệm HindIII Enzyme EcoRV Nước DNA 10X đệm EcoRV
Enzyme HindIII Nước 8 µl (1µg) 2,5 µl 05 µl 14 µl Tổng cộng 25 µl Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl
BamHI HindIII Eco RV Thể tích
DNA 10X đệm BamHI Enzyme BamHI Nước DNA 10X đệm HindIII Enzyme EcoRV Nước DNA 10X đệm EcoRV
Enzyme HindIII Nước 16 µl (2-3 g) 5 l 1µl 28 µl Tổng cộng 50 l
Tôi tiến hành trộn đều thành phần của các phản ứng cắt theo tổng thể tích đã tính toán. Sau đó, hỗn hợp đó được phân chia đều thành các phản ứng riêng lẻ ra các eppendorf để thực hiện phản ứng cắt. DNA được thêm vào eppendorf chứa hỗn hợp trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở 370C trong khoảng 2 giờ (có thể qua đêm nếu cần thiết). Sản phẩm của phản ứng cắt được kiểm tra trên gel agarose 0,8%, các mẫu được bố trí theo kiểu xen kẽ, liên tiếp nhau mẫu DNA chưa cắt, đến mẫu sản phẩm cắt.
3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt DNA genome của nấm M. grisea trên gel agarose
Tôi thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, với kích thước gel 20 cm x 15 cm x 0,5 cm, gel được gắn lược 20 giếng, thực hiện bố trí như sau:
Giếng 1: Hút 10 µl DNA plasmid dùng để tạo probe như một đối chứng dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 2-9: Hút 25µl mẫu (2µg DNA đã được cắt bằng enzym cắt giới hạn) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 10: Hút 10 µl DNA plasmid dùng để tạo probe như một đối chứng dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 11-20: Hút 25µl mẫu (2µg DNA đã được cắt bằng enzym cắt giới hạn) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Tiến hành điện di ở hiệu điện thế là 50 V, trong 3 giờ. Sau đó, gel được cắt bỏ giếng, nhuộm ngắn trong ethidium bromide trong 1 - 2 phút, rửa sạch và chụp gel lấy lại hình ảnh để biện luận kết quả. Miếng gel đó sẽ được làm biến tính trước khi chuyển lên màng (chú ý miếng gel trước khi chuyển lên màng không nên để lâu trong không khí vì như thế sẽ làm cho bề mặt miếng gel bị khô và ảnh hưởng không tốt đến quá trình chuyển lên màng. Thời gian giữ gel là 15 - 30 phút khi nó được ngâm trong dung dịch đệm)
3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên
Biến tính DNA trên gel trƣớc khi chuyển lên màng nitrocellulose
Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE 0,5X. Chúng tôi thực hiện biến tính DNA như sau:
- Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần nước rửa.
- Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl
0,15 M), phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn bởi dung dịch, đem lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, rửa lại gel bằng nước cất vô trùng, đổ bỏ phần nước rửa.
- Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0), miếng gel cũng phải được ngấm hoàn toàn
trong dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.
Chuyển DNA lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên (thiết bị chuyển lên màng nitrocellulose đã đƣợc cải tiến)
Khi đã hoàn thành giai đoạn biến tính DNA trên gel agarose bằng dung dịch biến tính, tiến hành chuyển lên màng theo các bước sau:
- Dùng hộp nhựa hình chủ nhật (30 cm x 20 cm) có chứa 500 ml đệm SSC
6X, phía trên có đặt một tấm mica (24 cm x 20 cm) làm bệ của hệ thống mao dẫn.
- Cắt một tấm giấy lọc có kích thước phù hợp (30cm x 15 cm) được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt khí dùng que thủy tinh gạt theo một chiều) và hai đầu giấy ngấm vào trong dung dịch đệm để làm cầu mao dẫn.
- Úp ngược miếng gel và đặt lên trên giấy lọc, giữa miếng gel và giấy lọc tránh có bọt khí.
- Đặt màng Hybond N có kích thước (20 cm x 12 cm) được làm ướt bằng SSC 2X lên trên miếng gel tránh để bọt khí.
- Đặt hai tấm giấy lọc có kích thước 20 cm x 12 cm được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X lên trên màng.
- Đặt một chồng giấy thấm có kích thước 20 cm x 12 cm với độ cao vừa phải lên trên giấy lọc, màng và gel.
- Trên cùng được đặt vài miếng mica để giữ hệ thống và tạo lực mao dẫn. - Khoảng trống xung quanh hộp nhựa được phủ bằng saran wrap, giảm sự tác
động của môi trường xung quanh. Hệ thống được giữ qua đêm (16 giờ).
3.5.4.4. Làm khô màng nitrocellulose
Sau 16 giờ , chúng ta tiến hành làm khô màng theo cách sau:
- Loại bỏ các thành phần ở trên cho đến khi tới màng thì dừng lại.
- Đặt màng vào trong tủ sấy ở 65-800C trong khoảng 1 giờ cho đến khi các góc màng co lại là được.
3.5.4.5. Cố định DNA lên màng nitrocellulose
Màng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENE
LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng
hướng lên). Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong hộp kín cho đến khi tiến hành lai).
3.5.5. Thực hiện lai Southern sử dụng probe pMGY-SB 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai
Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 550C, đồng thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 550C. Song song đó, chúng tôi tính toán các thông số sau:
Diện tích màng: 20 x 12 = 240 (cm2 ) Thể tích đệm lai: 0.2 x 240 = 48 (ml) Nồng độ probe cần: 10 x 48 = 480 (ng) Thể tích probe: 480 / 10 =48 (µl)
Qui trình thực hiện phản ứng lai
Bước 1: Tiền lai
Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở 550C và dung dịch đệm lai cũng đã được làm nóng đến 550C, tiến hành rửa ống lai bằng nước cất vô trùng, sau đó bơm vào ống lai 40 ml dung dịch đệm lai. Dùng kẹp đặt màng vào ống lai sao cho bề không có DNA tiếp xúc với thành ống lai. Thời gian cho bước này là 15 phút.
Bước 2: Lai
Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 48 µl probe, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai (tránh nhỏ trực tiếp lên màng), phản ứng được thực hiện trong một thời gian dài, có thể để phản ứng qua đêm là phù hợp nhất (12 giờ).
3.5.5.2. Rửa màng nitrocellulose sau khi lai
Trước khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến 550C. Thực hiện rửa màng theo các bước sau:
- Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1. Nhiệt độ và số vòng quay của buồng lai giống như khi lai, thời gian rửa là 10 phút.
- Lặp lại bước trên cũng trong 10 phút.
- Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng ra và cho vào hộp nhựa sạch với bề có DNA nằm trên. Cho vào đó dung dịch rửa 2 (secondary wash buffer) khoảng 50 ml, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Lặp lại bước trên trong 10 phút. Lúc này màng có thể được giữ trong dung dịch rửa 2 trong 30 phút để chuẩn bị cho bước phát hiện.
3.5.5.3. Phát hiện kết quả bắt cặp giữa probe và đoạn DNA đích bằng huỳnh quang và thể hiện trên X-ray phim
Chuẩn bị màng với chất phát hiện CDP - Star
Màng sau khi được rửa lần 2, sẽ được phủ lên trên một lớp dịch của chất phát hiện, chất này làm cho các phân tử probe phát sáng. Các bước thực hiện như sau:
- Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp khăn giấy.
- Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran wrap với bề có DNA hướng lên trên.
- Hút 1000 µl chất phát hiện CDP- Star nhỏ lên trên màng.
- Dùng một tấm saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí.
- Sau đó, màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với kích thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để màng bị khô).
Ủ màng nitrocellulose với X-ray phim trong cassette
Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica 30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của màng. Đậy cassette lại và tính thời gian ủ 30 phút hoặc 1 giờ (thường phản ứng sẽ có tín hiệu sáng tốt nhất sau 1 giờ từ khi cho chất phát hiện vào). Tùy theo tính chất probe mà thời gian ủ phản ứng phát hiện khác nhau. Các thao tác trên được thực hiện trong buồng tối.
Khi đã hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim sẽ được đem ra khỏi cassette và ngâm trong dung dịch developer trong 5 phút. Sau đó, lấy phim ra và ngâm trong dung dịch fixer khoảng 3 phút. Cuối cùng đem phim ra rửa dưới vòi nước sạch và dùng kẹp treo lên giá làm khô ở nhiệt độ phòng.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea.
Giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn tuy dễ thực hiện nhưng không đơn giản. Để có thể triết tách được một lượng DNA tốt và có thể sử dụng cho những nghiên cứu sau này, thì ngoài phương pháp cần phải có một kinh nghiệm trong thao tác. Giai đoạn này đóng vai trò quan trọng đầu tiên cho phép phản ứng lai thành công hay không.Việc tách chiết phải đảm bảo có lượng DNA có trong mẫu và lượng DNA phải đủ lớn để có thể phát hiện được qua lai với probe. Các thao tác phải nhẹ nhàng để tránh DNA bị gãy. Kết quả tách chiết có ý nghĩa cao là phải đảm bảo độ tinh khiết cao không còn hóa chất ly trích sót lại.
Sau khi tiến hành tách chiết DNA theo đúng qui trình, chúng tôi thu được lượng DNA của các mẫu như sau:
Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea.
Nấm sau khi nuôi cấy trong máy lắc định ôn 370C, qua 72 giờ được ly trích DNA, DNA sau ly trích được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút.
Kết quả điện di trong hình 4.1 cho thấy, tất cả các mẫu đều thu được DNA tổng số có nồng độ cao và ít bị đứt gãy. Tuy nhiên, các mẫu còn lẫn tạp chất nhiều. Các vệt sáng kéo dài phía dưới có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy. Lỗi này có thể la do lắc mạnh trong quá trình sau khi cho phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), khiến DNA bị đứt gãy nhiều. Mặt khác do quá trình ly trích tôi không sử dụng enzym RNAse nên lượng RNA lẫn tạp trong mẫu còn nhiều. Riêng mẫu CT72 và CT64 có hai băng, điều này có thể lý giải là trong quá trình nuôi cấy mẫu bị nhiễm khuẩn và do DNA genomic vi khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ hơn nên di chuyển trước và tạo thành 2 băng. Từ thực nghiệm, chúng tôi rút ra được những điểm cần lưu ý trong quá trình ly trích:
- Cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối trong quá trình cấy và tăng sinh khối sợi nấm. Nếu môi trường tăng sinh không bị nhiễm khuẩn thì sau khi ta thu sinh khối là phần sợi nấm thì phần dịch còn lại trong và có màu vàng óng.
- Bước thu sinh khối không nên để sợi nấm quá khô, tốt nhất nên nghiễn sinh khối nấm trong nitow lỏng ngay sau khi thu thí chất lượng DNA sẽ tốt hơn. CT64 CT375 LA415 CT104 LA18 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72 KG216 KG531
- Thao tác phải nhẹ nhàng trong khi ly trích, dặc biệt là sau khi thêm hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), chỉ nên nghiêng ống nghiệm (hoặc eppendorf) một cách cẩn thận không nên lắc mạnh.
- Thu phần dịch nổi không nên hút phần cặn phía dưới, đặc biệt là không được hút vào phenol phía dưới. Phenol có thể phá hủy DNA sau khi ly trích. - Khi thêm isopropanol (ethanol 100%) thì ta nên ủ trong tủ -200C trong 30-
60 phút, để DNA có thể tủa hoàn toàn.
- DNA phải được rửa nhiều lần với ethanol 70% để loại bỏ bớt tạp chất và nên làm khô DNA hoàn toàn (có thể để trong tủ cấy qua đêm).
- Khi điện di DNA tổng số thì nồng độ gel từ 0,6-0,8% là phù hợp.
Tuy nhiên, để đảm bảo cho phản ứng cắt và phản ứng lai xảy ra tốt hoặc biết được nguyên nhân nếu phản ứng không cho kết quả tốt, tôi cố gắng hoàn thiện tốt từng giai đoạn. Sản phẩm ly trích còn nhiều tạp nhiễm, do đó tôi tiến hành loại bỏ tạp nhiễm bằng RNAse.
Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi đƣợc xử lý với RNAse.
DNA sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút.
Nhìn chung, kết quả tinh sạch tương đối tốt nhưng DNA còn bị đứt gãy nhiều. Một số mẫu không có DNA mà chỉ là những vệt sáng mờ như mẫu CT375, KG535,
LA415 LA18 KG531 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72
CT72, KG531. Nguyên nhân có thể do trong thao tác không cẩn thận làm DNA bị đứt gãy hoặc do DNA không tủa hoàn toàn và do đó không thu được DNA. Để khắc phục hiện tượng này tôi đề nghị nên sử dụng NaOAc kết hợp với ethanol để DNA có thể kết tủa tốt hơn. Tuy nhiên với dộ tinh sạch đó ta có thể sử dụng để thực hiện làm mẫu cho phản ứng lai.
4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α
Sau khi biến nạp, tôi chọn phương pháp chọn lọc trực tiếp trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 70µg/ml, để chọn lọc những dòng vi khuẩn E.coli DH5α có chứa plasmid. Kết quả ly trích vi khuẩn E.coli DH5α được nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 370
C:
Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8%.
DNA plasmid ly trích từ vi khuẩn E.coli DH5α tăng sinh trong môi trường LB chứa 70µg/ml Ampicilin. Plasmid được điện di trên gel agarose 1%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50V, thời gian 45 phút. Mẫu pMGY-SB (1,2), pEBA 18 (3,4), pMGR-T1 (5,6).
Kết quả cho thấy quá trình biến nạp thành công và vi khuẩn chứa plasmid có thể sống trong môi trường kháng sinh (70 g/ml). Các mẫu 2,4,6 là mẫu plasmid chuẩn được cung cấp để thực hiện biến nạp, mẫu 1, 3 là mẫu plasmid được ly trích trong đó có sử dụng RNAse, mẫu 5 không sử dụng enzyme RNAse trong quá trình ly trích nên còn lẫn tạp chất nhiều. Kết quả ly trích không có lẫn DNA genomic của vi khuẩn.
Riêng mẫu 4 và 5 có hai băng, nguyên nhân là do plasmid tồn tại ở hai dạng: dạng vòng và dạng xoắn.
4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn
Trong 30 dòng nấm Magnaporthe grisea ly trích được, tôi chọn ra 10 dòng để