4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M.grisea
Trong 30 dòng nấm Magnaporthe grisea ly trích được, tôi chọn ra 10 dòng để thực hiện phản ứng cắt với hai enzym BamHI và EcoRV, nhằm chuẩn bị mẫu cho phản ứng lai. Tôi thực hiện phản ứng cắt với thể tích là 40µl, nồng độ mẫu DNA được cắt là 2 µg, ủ ở 370C qua đêm. Sau đó, hút 4 µl sản phẩm cắt và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả điện di như sau:
a)
b)
Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn.
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%, trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50V, thời gian 1 giờ. Hình a) các mẫu DNA được cắt bằng enzyme BamHI, hình b) các
mẫu DNA được cắt bằng EcoRV. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Kết quả cho thấy sản phản ứng cắt không hoàn toàn đối với các mẫu số 1 và 2 trên cả hai enzym EcoRV và BamHI. Phản ứng cắt không tốt có thể là do mẫu DNA ly trích không được tốt nên không thực hiện được phản ứng cắt. Những mẫu cắt không hoàn toàn và những mẫu cắt quá vụn như vậy sẽ không có ý nghĩa trong quá trình tạo mẫu lai. Phản ứng cắt không hoàn toàn nguyên nhân là do nồng độ DNA quá nhiều so với nồng độ mà một đơn vị enzym có thể cắt được.
4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi đƣợc cắt bằng EcoRV và BamHI với probe SB
Thí nghiệm 1:Lai ở 550C, thời gian lai là 16 giờ, thời gian ủ phát hiện là 30 phút.
Sản phẩm cắt DNA genome của M. grisea với hai enzyme EcoRV và BamHI được dùng làm mẫu lai, 15 µl mẫu được load trên miếng gel agarose 0,8% kích thước 20 x 15 x 0,7 cm. Plasmid pMGY-SB được bố trí là mẫu đối chứng dương cho phản ứng lai. Probe đánh dấu sử dụng cho phản ứng lai là plasmid pMGY-SB có kích thước 3,54 kp. Điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V, thời gian 4 giờ. DNA sau khi điện di được chuyển lên màng trong thời gian 16 giờ. Sau đó, tiến hành phản ứng lai ở 550C, thời gian là 16 tiếng. Tôi thực hiện bước phát hiện, tác nhân phát hiện được cho trực tiếp lên màng lai, để 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ tác nhân phát hiện thừa rồi ủ màng lai với phim trong thời gian 30 phút. Rửa phim với dung dịch rửa phim.
Sản phẩm lai xuất hiện trên nền phim sau khi rửa. Đây là kết quả của sự bắt cặp giữa probe đánh dấu với DNA plasmid và DNA genomic của nấm M.grisea sau khi ly trích. Các mẫu DNA được cắt bằng 2 enzyme BamHI và EcoRV thì sự bắt cặp với probe không xảy ra. Kết quả này chứng minh được DNA được biến tính hoàn toàn trên gel và có thể bắt cặp được với probe đánh dấu, nhiệt độ lai là 550C, thời gian lai là 16 giờ thì probe đã bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu, nhưng không đặc hiệu. Điều này có thể chứng tỏ rằng nhiệt độ lai thấp. Tuy nhiên, các mẫu sử dụng làm thí nghiệm thì không có hiện tượng bắt cặp. Điều này có thể được lý giải từ những nguyên nhân sau:
- Quá trình chuyển DNA lên màng chưa hoàn toàn do nồng độ gel cao và kích thước gel dày (0,7cm), cũng có thể do kích thước DNA lớn nên khó chuyển lên màng.
- Trình tự DNA mục tiêu hiện diện trên màng ít, probe không thể phát hiện được.
- Sự liên kết giữa trình tự DNA mục tiêu với probe đánh dấu lỏng lẻo, nên trong quá trình rửa màng, probe đã bị cuốn trôi theo dung dịch rửa.
Thí nghiệm 2: Lai ở 600C, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút
Tôi thực hiện phản ứng lai với các mẫu LA415 (1), LA18 (2), VL265 (3), VL 37 (4), VL 52 (5), VL45 (6), AG 518 (7), TG24 (8), KG535 (9) được cắt bằng hai enzyme BamH I và Eco RV. Khắc phục những nguyên nhân nêu ở thí nghiệm 1 tôi thực hiện các bước có cải tiến. 30 µl mẫu được load vào giếng trên miếng gel kích thước 20 x 15 x 0,5 cm, điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V, thời gian 6 giờ. Thời gian chuyển DNA lên màng là 20 giờ. Tôi thực hiện phản ứng lai ở 600C, thời gian 20 tiếng. Kết quả thực hiện như sau:
Hình 4.5. kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai.
ĐC(+) 1 2 3 4 5 6 7 8 9ĐC (+)1 2 3 4 5 6 7 8 9 BamHI EcoRI
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện thế 50V, thời gian 5 giờ, trong đệm TAE 0,5X. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4),
VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)).
Kết quả tạo mẫu lai cho thấy sản phẩm cắt chưa tốt để thực hiện một phản ứng lai. Các mẫu 2 và 7 bị cắt quá vụn nên các mẫu điện di có thể bị chạy ra ngoài sau một thời gian điện di quá dài. Mẫu 1 và 9 được đánh giá là tốt nhất. So sánh về kích thước của sản phẩm cắt với plasmid pMGY-SB có kích thước 3,52 kb, thì ta thấy các đoạn DNA cắt ra từ genome đều có kích thước nhỏ hơn 3,5 kb, từ đó có thể nhận xét rằng kích thước các đoạn phân cắt có thể quá nhỏ và điều này cũng ảnh hưởng tới khả năng bắt cặp của DNA mục tiêu với probe. Các băng điện di không thẳng do điện cực ở máy điện di không ổn định trong quá trình điện di hoặc do bồn điện di bị rung trong quá trình điện di. Trong điều kiện này, kết quả điện di tạo mẫu lai không phản ánh thực được sự di chuyển theo kích thước của các đoạn DNA từ đó kết quả phản ứng lai không có ý nghĩa khi phân tích sự đa dạng. Những kết luận rút ra được là :
- Sản phẩm cắt phải có nồng độ đều nhau.
- Sản phẩm cắt phải tạo thành một vết sáng đêu trên gel sau khi điện di (smear) thì mới có thể dùng làm mẫu cho phản ứng lai.
- Hiệu điện thế không nên quá cao có thể chạy ở 30V trong thời gian khoảng 32 h (Le Dinh Don, 2000).
- Nồng độ gel từ 0,7-0,8% là phù hợp để DNA có thể được chuyển lên màng
sau khi điện di.
- Dung dịch đệm điện di phải sạch thì mới đảm bảo quá trình chuyển lên màng thành công.
Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film.
Kết quả lai với probe pMGY-SB, Lai ở 55oC, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện thế 50V, thời gian 5 giờ, trong đệm TAE 0,5X. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)).
Quy trình thực hiện tuy có cải tiến nhưng kết quả không thay đổi nhiều. Tất cả những mẫu lai được cắt bằng hai enzym cắt BamHI và EcoRV sau khi chuyển lên màng, lai với probe và đều cho kết quả âm tính khi phát hiện trên X-ray film. Mẫu đối chứng dương là những sản phẩm có kích thước nhỏ và đều chứa trình tự bổ sung với probe, nên khả năng bắt cặp với probe là rất cao.
Bảng 4.1. Những khó khăn và những giải pháp khắc phục trong thực hiện phản ứng lai Southern
Phương pháp Khó khăn Cách giải quyết
1. thực hiện phản ứng cắt với thể tích lớn để có thể tạo được một lượng mẫu có nồng độ cao.
2. Điện di tạo mẫu lai
1. Thể tích phản ứng lớn khó có thể bơm vào giêng điện di. 2. thực hiện quá trình điện di khó đạt được. 1. cô đọng sản phẩm cắt bằng phương pháp sau: - thêm NaOAc (1/10V). - thêm ethanol 100% (2V).
2. Điện di ở hiệu điện thế 30V, thời gian >4 giờ,
ĐC(+) 1 2 3 4 5 6 7 9ĐC (+)1 2 3 4 5 6 7 8 9 BamHI EcoRI
3. Chuyển lên màng.
4. thực hiện phản ứng lai.
3. DNA chuyển lên màng không hoàn toàn, và khó gắn kết lên màng.
4. Lai không chuyên biệt, bắt cặp không hoàn toàn.
điện di trong đệm TBE 1X để sự phân tách DNA được tốt hơn.
3. Thực hiện điện di trong gel nồng độ thấp và độ dày nhỏ hơn 0,5 cm. Có thể thực hiện chuyển bằng điện. Quá trình phơi khô màng nên phơi khô ở 800C trong vaif giờ. 4. Nhiệt độ lai có thể tăng lên 680C, để sự bắt cặp chuyên biệt hơn.
So sánh với kết quả của Nguyễn Văn Lẫm và Lê Minh Kha (2005), sản phẩm PCR có kích thước 6,26 bp được sử dụng để đánh dấu probe đồng thời được sử dụng làm đối chứng dương. Kết quả phản ứng lai vẫn chỉ có mẫu đối chứng dương (sản phẩm PCR) cho tín hiệu bắt cặp sau khi lai. Nguyên nhân mà Nguyễn Văn Lẫm và Lê Minh Kha (2005) đưa ra là do nồng độ DNA thấp không đủ tín hiệu để phát hiện sự bắt cặp giữa trình tự đích và probe, nguyên nhân thứ hai là do DNA không được chuyển hoàn toàn lên màng bắng phương pháp mao dẫn hướng lên. Khắc phục nguyên nhân thứ nhất tôi đã tiến hành tạo mẫu DNA với nồng độ cao hơn (2µg), nhưng để tạo ra được một phản ứng cắt có thể cắt được một lượng DNA có nồng độ cao thì phải thực hiện ở thể tích lớ, điều đó lại gây khó khăn trong việc load mẫu điện di. DNA được load đầy giếng làm đo lượng mẫu sau khi điện di không cô đọng lại dưới đáy miếng gel từ đó tạo một khoảng cách lớn giữa DNA cần chuyển với màng nitrocellulose dẫn đến hiệu quả chuyển không tốt. Qua thực nghiệm tôi đã rút ra được những kinh nghiệm sau: (Bảng 4.1)
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1. Kết luận
Những nội dung thực hiện đưa ra tôi đã hoàn thành được những nội dung sau: - Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea, DNA ly trích có
thể được sử dụng cho phản ứng lai.
- Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn tốt.
- Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5 .
- Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn.
- Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid pMGY-SB thành công cho phản ứng lai. - Tạo mẫu cho quá trình lai tuy hoàn thành nhưng chưa thực hiện tốt và cần
phải có nhiều cải tiến.
Với những thuận lợi sẵn có về trang thiết bị, điều kiện làm việc và tầm quan trọng của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn ở nước ta, chúng tôi có một vài đề nghị như sau:
- Tiếp tục hoàn thiện quy trình Southern blot.
- Tiếp tục hoàn thiện việc phân tích đa dạng di truyền của nấm M. grisea bằng phương pháp RFLP.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Huỳnh Văn Thái, Phạm Duy, 2005. Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 . Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm TP. HCM.
2. Lê Minh Kha, Nguyễn Văn Lẫm, 2005. Thiết lập quy trình Southern blot. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công NGhệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3. Lê Minh Triết, 2003. Bài Giảng Môn Học Cây Lúa. Khoa Nông Học- Đại Học
Nông Lâm TP. HCM.
4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh Học Phân Tử-Giới Thiệu Phương
5. Nguyễn Thị Thư Hương, 2004. Xác định gen gây độc của nấm Metarrhizium ký sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án thạc sĩ. Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
6. Võ Thị Thu Oanh, 2000. Bệnh Cây Chuyên Khoa. Khoa Nông Học- Đại Học Nông Lâm TP. HCM.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
7. Derek Robinson, Paul R.Walsh, and Joseph A. Bonventre, 2001. Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. Wiley-Liss, Inc, p 224-244. 8. Hitoshi Nakayashiki, Kanako Kiyotomi, Yukio Tosa, and Shigeyuki Mayama,
1999. Transposition of the Retrotransposon MAGGY in Heterologous Species of Filamentous Fungi. Laboratory of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kobe University, Kobe 657-8501, Japan.
9. Hamer JE, Farral L, Orbach MJ, Valent B, Chumley FG, 1989. Host specie- specific conservation of a family of repeat DNA sequences in the genome of a fungal plant pathogen. Proc Nat Acad Sci USA 86: 9981-9985)
10.Jose Romao and John E. Hamer, 1992. Genetic organization of repeated DNA sequence family in the rice.department ò Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette.
11. Le Dinh Don, 2000.DNA-fingerprinting Analysis and PCR-based Diagnosis of the Population of Magnaporther grisea. The Graduate School of Science and Technology Kobe University, pp 31-37.
12.Le Dinh Don,Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999. Annals of the Phytopathological Scociety of Japan.
13.Motoaki Kusaba, Yukio Eto, Le Dinh Don, Natsuka Nishimoto, Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999. Genetic diversity in
Pyricularia isolates from varios Hosts Revealed by Polymorphisms of Nuclear Ribosomal DNA and the Distribution of the MAGGY Retrostranposon. Annals of the Phytopathological Society of Japan.
14.Sambrook Joseph and Rusell W.David, 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Volume 1. 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
15.Verel Shull John E. Hamer, 1996. Springer- Verlag.
16.Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki, Hideyuki Hyodo, Shigeyuki Mayama, Hạime Kato and Sally A. Leong, 1995. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. Support.
17.Y. Eto, K. Ikeda, I. Chuma, T. Kataoka, S. Kuroda, N. Kikuchi, L. D. Don, M. Kusaba, H. Nakayashiki, Y. Tosa, S. Mayama, 2000. Comparative analyses of the distribution of various transposable element in Pyricularia and their activity during and after the sexual cycle. Springer-Verlag.
CÁC TRANG WEB
http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm http://www.biology.kenyon.edu/Mycrobial_Biorealm/eukaryote/magnaporthe/magnap orthe.html