3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.2.3.Kiểm tra kết quả biến nạp
Kết quả biến nạp có thể được kiểm tra trực tiếp bằng cách nuôi trong môi trường LB chứa kháng sinh với nồng độ 70 g/ml. Những tế bào vi khuẩn nào có chứa plasmid thì có thể sống và tăng sinh trong môi trường kháng sinh, cón những tế bào nào không chứa plasmid thì không kháng lại được kháng sinh và chết. Từ đó, tôi có thể chọn lọc được dòng vi khuẩn chứa plasmid, và ly trích được plasmid mà tôi cần sử dụng với số lượng lớn.
Phƣơng pháp chiết tách plasmid sử dụng SDS-kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989)
Nguyên tắc của phương pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng, Sau khi màng tế bào bị phá vỡ, dưới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh được sự phân hủy của enzyme DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách triết, làm cho DNA genome và DNA plasmid bị biến tính. Sau đó, trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA plasmid sẽ được phục hồi nhanh chóng, DNA của bộ gen có kích thước lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA plasmid. Vì vậy, DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein và DNA genome của tế bào sẽ bị tủa suống. Như vậy, ta có thể tách DNA plasmid ra khỏi tế bào của bộ gen mà it bị lẫn DNA genome.
Chọn những ống vi khuẩn tăng sinh được trong môi trường kháng sinh ở trên để ly trích DNA plasmid theo quy trình sau:
- Hút địch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000vòng/phút trong 1 phút ở 200C để thu sinh khối.
- Hút bỏ dịch bên, tiếp tục hút dịch vi khuẩn từ những ống nghiệm tương ứng cho vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
- Cho 150 l dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, votex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
- Thêm 200 l dung dịch II, đảo nhẹ khoảng 8 lần (dịch trong eppendorf trở nên nhớt), sau đó thêm tiếp 150 l dung dịch III, đảo nhẹ eppendorf (chú ý trong bước này không nên votex).
- Ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút ở 200C, thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tương ứng.
- Thêm 1 l RNAse vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi mới thu được, ủ 370C
- Cho vào mỗi eppendorf 300 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng.
- Cho vào mỗi eppendorf 300 l chloroform/isoamylalcohol (24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng.
- Thêm vào mỗi eppendorf trên 300 l isopropanol, ủ -200C 30 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. hút bỏ dịch nổi thu kết tủa.
- Rửa tủa trên bằng ethanol 70% 3 lần, úp ngược eppendorf trên giấy thấm để làm khô DNA.
- Thêm 20 l TE 1X vào eppendorf để hòa tan kết tủa.
- Hút 4 l chạy điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra kết quả ly trích