nghiên cứu chiết rút chitinase từ lá khoai lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin để sản xuất olygo-chitin

Mục đích của luận văn: Bước đầu nghiên cứu về tính chất của enzyme chitinase từ thực vật lá khoai lang, tìm các điều kiện thích hợp để thu nhận enzyme chitinase và sử dụng enzyme để thủ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

=====***=====

ĐẶNG TRUNG THÀNH

NGHIÊN CỨU CHIẾT RÚT CHITINASE

TỪ LÁ KHOAI LANG VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT OLYGO-CHITIN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ Sau thu hoạch

Mã số: 60.54.10

Người hướng dẫn khoa học: GS TS Trần Thị Luyến

Nha Trang, tháng 06/2008

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan là thực hiện đề tài nghiêm túc, trung thực Các số liệu thu được trong đề tài là kết quả nghiên cứu của bản thân, không sao chép số liệu của các tác giả khác

Người cam đoan

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài thạc sỹ, cũng như bản thân trưởng thành như ngày hôm nay, cho tôi xin được gửi lời cảm ơn tới bố mẹ tôi đã sinh thành và dưỡng dục, động viên giúp đỡ tôi những lúc khó khăn, chia sẻ niềm vui nỗi buồn trong suốt cuộc đời

Cho tôi được cảm ơn tới các thầy cô giáo đã dạy dỗ tận tình, trang bị những kiến thức cần thiết để tôi trưởng thành như ngày hôm nay

Tôi xin cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm khoa Chế biến, các thành viên trong bộ môn Công nghệ Chế biến, các thành viên trong khoa Chế biến đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc, giúp tôi hoàn thành đề tài cũng như động viên tinh thần những lúc khó khăn

Đặc biệt, tôi xin cảm ơn tới GS.TS Trần Thị Luyến Cô không chỉ là người hướng dẫn thực hiện đề tài cho tôi mà còn hướng cho tôi đi theo con đường nghiên cứu khoa học tuy gian khổ nhưng cũng có nhiều vinh quang

Tôi cũng xin cảm ơn tới các bạn cùng học lớp cao học 2004 và bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 : TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 10

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 10

1.1.1.Giới thiệu chung về enzyme 10

1.1.2.Giới thiệu enzyme chitinase 17

1.1.3 Giới thiệu về cây khoai lang 19

1.1.4.Giới thiệu về chitin và một số dẫn xuất của chitin 21

1.2.CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 25

1.2.1 Các công trình nghiên cứu ngoài nước 25

1.2.2 Các công trình nghiên cứu trong nước 29

Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31

2.1.1.Nguồn thu nhận enzyme chitinase 31

2.1.2 Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo-chitin 31

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.2.1.Phương pháp thu nhận và bảo quản nguyên liệu thu chitinase: 33

2.2.2 Bố trí thí nghiệm lựa chọn giống khoai lang thích hợp 33

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tình trạng sâu bệnh của cây, vị trí chiết rút đến hoạt độ chitinase 34

2.2.4 Bố trí thí nghiệm xác định phương pháp tách chiết enzyme chitinase 35

2.2.5 Bố trí thí nghiệm thu nhận chế phẩm enzyme (CPE) 36

2.2.6 Xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương pháp NELSON 38

2.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ chitinase DC và CPE 38

2.2.8 Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của chitinase DC và CPE 39

2.2.9.Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng chế phẩm chitinase (CPE) 39

2.2.10 Các phương pháp phân tích 41

2.2.11 Các thiết bị thí nghiệm đã sử dụng 42

2.2.12 Phương pháp xử lý số liệu 42

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43

3.1.XÁC ĐỊNH LOẠI KHOAI LANG SỬ DỤNG CHIẾT CHITINASE 43

3.1.1 Kết quả chọn giống khoai lang sử dụng chiết rút chitinase 43

3.1.2 Kết quả nghiên cứu hoạt độ chitinase từ các phần khác nhau của cây khoai lang 44

3.1.3 Kết quả nghiên cứu tình trạng sâu bệnh của cây ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase 45

3.2 XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE DC, CPE 3.2.1.Kết quả nghiên cứu tách chiết chitinase DC 47

3.2.2 Kết quả nghiên cứu thu nhận CPE 50

3.3 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘ CHITINASE DC VÀ CPE 55

3.3.1 Kết quả xác định nhiệt độ thích hợp đối với hoạt độ chitinase 55

3.3.2 Kết quả xác định độ bền nhiệt của chitinase 57

3.3.3 Kết quả xác định pH thích hợp đối với hoạt độ chitinase 58

3.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG ENZYME CHITINASE 59

3.4.1 Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân chitin bằng chitinase 59

3.4.2 Hiệu suất thủy phân chitin của chitinase 67

Kết luận và đề xuất ý kiến 73

1.Kết luận: 73

2.Đề xuất ý kiến 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC Hình 3.1 Ảnh hưởng của giống khoai lang khác nhau đến hoạt độ chitinase 43

Hình 3.2 Ảnh hưởng từng phần khác nhau của cây đến hoạt độ chitinase 44

Hình 3.3 Ảnh hưởng tình trạng bệnh đến hoạt độ enzyme thu được 46

Hình 3.4.Ảnh hưởng của dung môi chiết rút đến hoạt độ của chitinase 47

Hình 3.5 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hoạt độ chitinase 48

Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt độ chitinase 49

Hình 3.7.Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hoạt độ của chitinase 50

Hình 3.8.Ảnh hưởng nồng độ ethanol (%) đến hoạt độ chitinase 52

Hình 3.9 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hoạt độ CPE 54

Hình 3.10.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chitinase DC và CPE 55

Hình 3.11.Độ bền nhiệt của chitinase trong DC và CPE 57

Hình 3.12.Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chitinase trong DC và CPE 58

Hình 3.13.Ảnh hưởng của nồng độ CPE và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được 60

Hình 3.14.Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được 62

Hình 3.15.Ảnh hưởng của pH và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được 64

Hình 3.16.Ảnh hưởng của nồng độ huyền phù chitin và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được 65

Hình 3.17.Ảnh hưởng của nồng độ ethanol và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được 67 Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thủy phân chitin 68

Hình 3.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân chitin 69

Hình 3 20: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thủy phân 70

Hình 3 21: Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hiệu suất thủy phân 70 Hình 3.22: Đường chuẩn glucosamine (Phụ lục 2)

8

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học đang có bước phát triển mạnh mẽ Nhiều ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống ngày càng được chú trọng Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học là một xu thế tất yếu trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Các chế phẩm sản xuất bằng con đường sinh học không chỉ thân thiện với môi trường sống, mang lại giá trị kinh tế cao mà còn ứng dụng rất hiệu quả trong nhiều lĩnh vực đời sống Enzyme là một phần không thể thiếu được của công nghệ sinh học Hiện nay, có rất nhiều loại enzyme được nghiên cứu và ứng dụng của chúng ngày càng được mở rộng Trước đây các nghiên cứu tập trung nhiều vào enzyme protease thì ngày nay nhiều loại enzyme khác như cellulase, lipase, chitinase, deacetylase, collagenase, pectinase cũng đã được nghiên cứu và phát triển rộng rãi

Việt Nam có nguồn lợi thủy sản rất dồi dào, ngành công nghệ chế biến phát triển mạnh vì vậy các phế liệu từ chế biến thủy sản rất lớn Một trong các dạng phế liệu là nguồn chitin từ vỏ loài giáp xác như tôm, cua Tận dụng nguồn phế liệu này không những giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các chế phẩm mới có giá trị, làm tăng giá trị kinh tế cho ngành thủy sản

Chitin đã được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và công nghiệp Chitin và dẫn xuất chitosan là hai chất được ứng dụng nhiều nhất Nhưng

do chúng có đặc điểm không hòa tan trong nước nên ứng dụng vẫn có những hạn chế Vì vậy, nghiên cứu các chế phẩm từ chitin như olygo-chitin, olygo-chitosan, glucosamine, N-acetyl-β-D-glucosamine để khắc phục nhược điểm trên, khám phá thêm nhiều đặc tính mới cũng như mở rộng ứng dụng của polymer này là xu hướng nghiên cứu trong thời gian tới

Để tạo ra các chế phẩm có khả năng hòa tan trong nước từ chitin, chitosan có thể dùng phương pháp hóa học, dùng các tia mang năng lượng cao và một số phương pháp khác để cắt đứt mạch polymer của chúng Các phương pháp trên thu được sản phẩm với hiệu suất cao nhưng có nhược điểm lớn là hoạt tính các chế phẩm thấp, nhiều tạp chất, gây ô nhiễm môi trường và gây độc cho người trực tiếp sản xuất

Sử dụng các enzyme chitinase, chitosanase thủy phân chitin, chitosan tạo ra các chế phẩm olygo-chitin, olygo-glucosamine có hoạt tính sinh học cao, điều kiện sản xuất nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường và ít ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động là hướng đi tốt Có thể sử dụng nguồn enzyme chitinase, chitosanase

từ thực vật, động vật và vi sinh vật

Từ yêu cầu cấp thiết của thực tế trên, tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu

chiết rút chitinase từ lá khoai lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin

để sản xuất olygo-chitin

Mục đích của luận văn:

Bước đầu nghiên cứu về tính chất của enzyme chitinase từ thực vật (lá khoai lang), tìm các điều kiện thích hợp để thu nhận enzyme chitinase và sử dụng enzyme

để thủy phân chitin tạo olygo-chitin qua đó mở rộng ứng dụng của chitin và thay thế phương pháp hóa học sản xuất olygo-chitin gây ô nhiễm môi trường và chất lượng sản phẩm thấp

Nội dung nghiên cứu của luận văn:

- Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ lá khoai lang và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này

- Bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase thủy phân chitin thu olygo-chitin

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận văn:

Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần hiểu biết thêm về enzyme chitinase từ lá khoai lang nói riêng và chitinase từ thực vật nói chung

Nghiên cứu đưa ra được các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết rút enzyme chitinase từ lá khoai lang, các yếu tố ảnh hưởng chitinase và bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase chiết rút được vào quá trình thủy phân chitin thu chế phẩm olygo-chitin Kết quả thu được là cơ sở để đánh giá hiệu quả và khả năng ứng dụng của chitinase thực vật vào sản xuất olygo-chitin, từ đó cải thiện được chất lượng và hiệu quả sản phẩm so với phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm

Chương 1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME

1.1.1.Giới thiệu chung về enzyme

Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn (đa số các enzyme có phân tử lượng từ 6.000 đến 1.000.000 dalton) Qua quá trình nghiên cứu cấu trúc, tính chất đã khẳng định bản chất của enzyme là protein Các kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme được cấu tạo từ các L-α-acid amin kết hợp với nhau bằng liên kết peptit [6]

Người ta đã phát hiện ra rằng, các enzyme đã xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra bên trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống được thực hiện một cách nhịp nhàng, cân đối và theo những chiều hướng xác định Chúng không chỉ có khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống mà sau khi được tách ra khỏi tế bào sống chúng vẫn có khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra

Sự khác biệt giữa xúc tác bằng enzyme so với các chất xúc tác vô cơ, hữu cơ

là ở chỗ xúc tác bằng enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn Nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn, hàng triệu lần so với xúc tác bằng các chất vô hoặc hữu cơ

Ví dụ: trong phản ứng thủy phân sacaroza, nếu dùng chất xúc tác là sacaraza thì tốc độ của phản ứng tăng nhanh gấp 2.102 lần so với dùng acid làm chất xúc tác [6]

Đặc điểm ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác là khi sử dụng enzyme làm chất xúc tác có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng như ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể hay ở môi trường bên ngoài, pH thích hợp của enzyme gần pH sinh lý Ngoài ra enzyme còn có khả năng lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng Đó là tính đặc hiệu của enzyme [6], [8]

Ví dụ: Chất xúc tác là acid không có tính đặc hiệu Nó có thể xúc tác thủy phân cắt đứt liên kết peptid của protein, liên kết glucosid của tinh bột, của agar,

carrageennan, chitin vv… trong khi đó enzyme protease chỉ xúc tác thủy phân cắt đứt các liên kết peptid mà không xúc tác để cắt được liên kết glucosid

Do là chất xúc tác đặc biệt, có nhiều ưu việt hơn so với các chất xúc tác khác nên enzyme đang được nghiên cứu và ứng dụng rất mạnh mẽ trong đời sống con người

Enzyme bao gồm hai loại là enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần Enzyme một thành phần (apoenzyme) là enzyme khi bị thủy phân thì sản phẩm của quá trình thủy phân chỉ bao gồm các acid amin Enzym hai thành phần, phân tử enzyme gồm phần protein (apoenzyme) kết hợp với nhóm khác không phải protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme Apoenzyme quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme Coenzyme quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xác tác, trực tiếp tham gia phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính [6], [8], [32]

Tính chất của enzyme: Bản chất của enzyme là protein nên enzyme không

bền với nhiệt Dưới tác dụng của nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính mất khả năng xúc tác Môi trường acid, kiềm mạnh hay muối kim loại nặng cũng làm mất hoạt tính của enzyme

Enzyme có hai dạng biến tính là biến tính thuận nghịch và không thuận nghịch Nếu bị biến tính thuận nghịch, enzyme có khả năng phục hồi lại khả năng xúc tác khi loại bỏ các tác nhân gây biến tính Khi bị biến tính không thuận nghịch, enzyme không thể phục hồi lại khả năng xúc tác khi loại bỏ các tác nhân gây biến tính

Do có kích thước lớn nên enzyme không đi qua màng bán thấm Đây cũng là một tính chất mà người ta sử dụng để tinh sạch enzyme

Enzyme có tính chất lưỡng tính Trong môi trường điện ly có thể tồn tại ở dạng anion, cation hay dạng trung hòa về điện Người ta lợi dụng tính chất trên để phân tách cũng như tinh sạch enzyme (phương pháp điện di)

Cũng giống như protein, các enzyme đều có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không hòa tan trong dung môi không phân cực (aceton, ete vv…) Dung dịch chứa enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước Khi hòa tan enzyme vào trong nước, do phân tử nước có tính chất lưỡng cực sẽ kết

hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrat và có vai trò quan trọng làm môi trường cho các phản ứng sinh

hóa

Trước đây mỗi loại enzyme đều được đặt tên tùy theo tác giả vì vậy không có

sự thống nhất Từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme thành 6 lớp dựa trên tính đặc hiệu phản ứng của enzyme:

1 Oxydoreductaza : các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử

2 Transferaza: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

3 Hydrolaza: các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân

4 Liaza: các enzyme xúc tác phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành liên kết đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào liên kết đôi

5 Izomeraza: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

6 Ligaza: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP…

Mỗi lớp chia thành nhiều tổ Mỗi tổ chia thành nhiều nhóm Ký hiệu của mỗi enzyme bao gồm 4 số, số đầu chỉ lớp, số thứ 2 chỉ tổ, số thứ 3 chỉ nhóm và số thứ 4 chỉ enzyme [32]

Cơ chế tác dụng của enzyme: Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần nhỏ

của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc biệt với cơ chất và phần này gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Đối với enzyme một thành phần thì trung tâm hoạt động được hình thành là

do sự phối hợp giữa các nhóm chức tự do của acid amin Ví dụ: nhóm SH (sunfidryl) của cystein, nhóm NH2 (amin) của lysin, nhóm OH (hydroxyl) của serin, treonin, tyrosin, nhóm COOH (cacboxyl) của aspactic, glutamic, vòng imidazol của histidin, indol của triptophan, guanilic của arginin

Enzyme hai thành phần, trung tâm hoạt động của enzyme được hình thành ngoài các nhóm chức của các acid amin còn có sự tham gia của coenzyme Ví dụ: vitamin, ion kim loại vv…

Yêu cầu của phản ứng hóa học xảy ra là các chất tham gia phản ứng phải va chạm với nhau tại vị trí xảy ra phản ứng và các chất trên phải ở trạng thái hoạt động

tức là đã được hoạt hóa Để hoạt hóa các phân tử thì cần cung cấp năng lượng cho chúng, năng lượng này gọi là năng lượng hoạt hóa

Các chất xúc tác nói chung đều có khả năng làm giảm năng lượng hoạt hóa

mà phản ứng đòi hỏi bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian Qua đó tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng sẽ nhỏ hơn so với trường hợp không

có chất xúc tác Năng lượng hoạt hóa thường nhỏ đối với xúc tác bằng enzyme và nhỏ hơn cả trường hợp có các chất xúc tác thông thường

Ví dụ: Trong phản ứng thủy phân H2O2 tạo thành H2O và O2 nếu không có xúc tác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, xúc tác là keo platin thì năng lượng hoạt hóa là 11.7 Kcal/mol trong khi đó sử dụng enzyme catalase thì năng lượng hoạt hóa chỉ là 5.5 Kcal/mol

Phương trình phản ứng được biểu diễn như sau:

Quá trình xúc tác bằng enzyme trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme-cơ chất (ES) không bền Phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

Giai đoạn 2 : xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng làm cho cơ chất được hoạt hóa, dễ dàng tham gia phản ứng hơn

Giai đoạn 3: sản phẩm được tạo ra và enzyme được giải phóng ở dạng tự do

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme Dưới đây

là một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của chúng:

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản

ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Khi tăng nồng độ của enzyme, tốc

độ phản ứng sẽ tăng nhưng mức độ tăng nồng độ enzyme cũng có giới hạn vì khi

tăng nồng độ enzyme quá lớn vận tốc phản ứng tăng chậm sẽ không có hiệu quả trong thực tế sản xuất

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Như chúng ta đã thấy, trong các phản ứng

có xúc tác là enzyme, có sự hình thành phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất (ES), tiếp đó mới có sự chuyển hóa trong phức chất để tạo ra sản phẩm và giải phóng enzyme ở dạng tự do Tốc độ phản ứng thủy phân tỷ lệ với nồng độ của phức chất trung gian vì vậy nồng độ cơ chất có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ của phản ứng có enzyme xúc tác Theo phương trình Michaelis-Menten, khi nồng độ cơ chất rất thấp vận tốc phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất đã

đủ lớn, nếu tăng lượng cơ chất vận tốc phản ứng sẽ không tăng

Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: Các chất hoạt hóa có thể làm tăng hoạt

độ của enzyme có thể theo các cách khác nhau Chúng có thể loại trừ các chất kìm hãm ra khỏi phản ứng hoặc tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm biến đổi cấu hình không gian của enzyme tạo thuận lợi cho quá trình xúc tác

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Vì enzyme có bản chất là protein nên

tất cả các yếu tố làm biến tính protein đều là các yếu tố kìm hãm hoạt động của enzyme Ngoài ra còn các yếu tố kìm hãm khác tuy không trực tiếp làm biến tính protein nhưng có thể thế chỗ cơ chất, kết hợp vào ngay trung tâm hoạt động của enzyme tạo thành phức chất trung gian (chất kìm hãm cạnh tranh) hoặc kết hợp vào một vị trí nào đó của enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của enzyme theo chiều hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác (chất kìm hãm không cạnh tranh)

Có những trường hợp sản phẩm phản ứng hay dư thừa cơ chất cũng làm kìm hãm phản ứng

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp

tới vận tốc phản ứng của enzyme Nhiệt độ càng tăng thì vận tốc của phản ứng có xúc tác enzyme càng tăng Nhưng vì enzyme có bản chất protein nên nhiệt độ chỉ tăng đến một mức độ giới hạn Nếu vượt quá giới hạn này thì phản ứng sẽ giảm hoặc dừng lại do bản thân enzyme bị biến tính Nhiệt độ mà ở đó tốc độ phản ứng đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích

Nhiệt độ tới hạn là nhiệt độ làm mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác của enzyme Nhiệt độ tối thích của các enzyme không giống nhau, phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme từ thực vật, động vật hay vi sinh vật Nhiệt độ tối thích của enzyme không phải là hằng số mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như:cơ chất, pH môi trường, nồng độ enzyme, nguồn enzyme Khi thời gian tác dụng của enzyme càng dài thì nhiệt độ tối thích càng giảm

Ảnh hưởng của pH: Mỗi loại enzyme sẽ có hoạt tính cao nhất ở một pH xác

định gọi là pH tối thích của enzyme pH ảnh hưởng tới hoạt tính xác tác của enzyme

có thể do nó làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme Nó cũng có thể làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất làm ảnh hưởng tới khả năng hình thành hợp chất trung gian Đa số enzyme có pH tối thích ở vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính

Ảnh hưởng của lượng nước: Nước là chất trực tiếp tham gia vào phản ứng

thủy phân Nước cũng là môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho tiếp xúc của enzyme và cơ chất nên cũng ảnh hưởng nhiều đến tốc độ thủy phân

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Để phản ứng thủy phân được thực

hiện cần có yếu tố thời gian Thời gian dài hay ngắn tùy thuộc vào các yếu tố enzyme, cơ chất, nhiệt độ, pH, các yếu tố hoạt hóa cũng như kìm hãm…

Nguồn thu nhận enzyme: Enzyme có trong tất các các cơ thể động vật, thực

vật và vi sinh vật Tùy theo loại và lượng enzyme tồn tại trong các nguồn trên mà ta chọn đối tượng thích hợp để thu enzyme, ứng dụng chúng trong sản xuất và một số lĩnh vực của đời sống

Các phương pháp tinh sạch enzyme: Có nhiều loại enzyme với các tính

chất khác nhau Vì vậy, hiện nay chưa có phương pháp chung nào có thể tách và làm sạch cho mọi enzyme Khi nghiên cứu một loại enzyme cụ thể cần phải có thực nghiệm để xác định phương pháp tách chiết và tinh sạch phù hợp nhất Việc phân tách và làm sạch enzyme rất phức tạp do lượng enzyme chiếm một tỉ lệ rất nhỏ, luôn tồn tại đồng thời với các loại protein khác có tính chất hóa lý tương tự như enzyme Ngoài ra enzyme bản chất là protein nên cũng rất dễ biến tính, mất khả năng xúc tác khi bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài

Trong các nguồn thu nhận enzyme, để thu enzyme từ thực vật người ta thường chọn dung môi thích hợp để chiết rút enzyme ra khỏi nguyên liệu Enzyme

từ vi sinh vật tồn tại ở hai dạng: enzyme ngoại bào là enzyme được tiết ra môi trường bên ngoài và enzyme nội bào tồn tại bên trong tế bào Enzyme ngoại bào có thể dùng dung môi chiết ngay ra được Đối với dạng enzyme nội bào, để tách chiết dạng enzyme này trước hết phải phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học như xay, nghiền Tiếp đó enzyme được chiết ra bằng các dung môi thích hợp như nước cất, các dung dịch đệm, dung dịch muối sinh lý vv…

Dịch chiết chứa không chỉ có enzyme mà còn có các protein tạp và các tạp chất khác Để tách các tạp chất làm tăng độ sạch, tinh khiết của enzyme phải sử dụng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau Đối với muối, các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng biện pháp thẩm tích hoặc lọc qua cột gel sephadex Để loại các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau : Phương pháp biến tính chọn lọc dưới tác dụng của nhiệt độ hay

pH môi trường: phương pháp này thích hợp đối với loại enzyme có tính bền nhiệt hoặc bền acid Giữ dịch chứa enzyme ở nhiệt độ cao 50 – 700C hoặc pH = 5 trong thời gian xác định các protein tạp bị biến tính và được loại bỏ bằng lọc hay ly tâm

Kết tủa phân đoạn enzyme bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ thích hợp đối với các loại enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi, muối trung tính Khi đó các protein tạp sẽ bị biến tính và được tách ra khỏi dịch chứa enzyme Ngoài

ra còn có các phương pháp khác như: Phương pháp sắc ký, điện di hay lọc gel.vv…

Một số yếu tố gây biến tính enzyme như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc, muối kim loại nặng thường làm mất hoạt tính xúc tác của enzyme, do đó người ta thường dùng các yếu tố này để ức chế hoạt độ của enzyme khi cần thiết [2], [6], [8], [24], [32]

Ứng dụng của enzyme: Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh

vực của cuộc sống Có thể chia ứng dụng của enzyme thành hai hướng chính Hướng thứ nhất: điều hòa định hướng tác dụng của enzyme ngay trong bản thân nguyên liệu có chứa nó Hướng sử dụng này không phổ biến vì chỉ sử dụng được khi bản thân nguyên liệu có tồn tại enzyme Hướng thứ hai là: tách chiết enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

sản xuất Hướng này có ưu điểm là chủ động được nguồn enzyme, có thể dễ dàng điều khiển được hoạt động của nó theo các mục đích khác nhau của quá trình sản

xuất [6], [8]

1.1.2.Giới thiệu enzyme chitinase

Chitinase (EC: 3.2.1.14) là enzym xúc tác thủy phân liên kết glucozit của chitin Do chitin là một polymer giống như cellulose, có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị cơ sở là N-acetyl--D-glucozamine nên sản phẩm thu được khi thuỷ phân chitin bao gồm olygo-chitin, N-acetyl--D- glucozamine

-(1,4)-Khối lượng phân tử chitinase của thực vật nói chung trong khoảng 30 kDa Còn một số trường hợp ngoại lệ khác như enzyme chiết rút từ mầm, chồi và lá của cây khoai lang có khối lượng phân tử khoảng 16 kDa [44], [79]

Chitinase thu được từ các nguồn thực vật khác nhau thì có các giá trị nhiệt

độ, pH tối thích khác nhau, có điểm đẳng điện, khối lượng phân tử khác nhau Đối với các loài thực vật có chứa enzyme chitinase, chúng thường tồn tại ở các vị trí khác nhau của cây như lá, cuống lá, dây, mầm chồi vv…

Chitinase được phân thành hai loại là endochitinase và exochitinase Endochitinase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt ngẫu nhiên các liên kết glucosid trong mạch polymer của chitin Exochitinase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt liên kết glucosid ngoài cùng chuỗi polymer của chitin Theo các nghiên cứu của một số tác giả, đa số các chitinase từ thực vật đều ở dạng endochitinase Chitinase được tìm thấy trong lá cây đậu Hà Lan của tác giả J.D.Mikkelsen, D.B.Collinge (1991), trong lá lúa mạch đen của tác giả Yamaggami, Funatsu (1993), trong lá cây đậu tương của tác giả Wadsworth, J.P.Zikakis (1984), trong lá cây thuốc lá của các tác giả Shinshi, J.Ryals (1990), trong lá cây khoai mỡ của các tác giả D.Koga, T.Ishibashi, K.Yagishita (1984) vv…[37], [44], [75], [80]

Chitinase tồn tại trong thực vật không phải để xúc tác phản ứng thủy phân chitin vì trong thực vật không chứa chitin Các tác giả nghiên cứu về chitinase trong thực vật tin rằng chitinase đóng vai trò là chất kháng thể của thực vật và sự tồn tại của chúng trong thực vật có thể giải thích đó là sự phản ứng trở lại của cơ thể thực vật trước sự tấn công của các loài như côn trùng, động vật gây hại hay vi sinh vật gây bệnh [36], [44], [69], [82]

Cũng giống như các enzyme khác, hoạt độ của chitinase phụ thuộc vào các yếu tố như: nguồn thu nhận enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ chitinase, nồng độ chitin, loại chitin, thời gian thủy phân, các chất hoạt hóa, các chất kìm hãm vv…

Tùy theo nguồn thu chitinase, các chitinase có hoạt độ khác nhau Chitinase thu được từ vi sinh vật thường có hoạt độ cao hơn so với chitinase từ động thực vật Ngoài ra, có thể điều chỉnh khả năng sinh tổng hợp chitinase của vi sinh vật bằng cách chọn chủng thích hợp, hoặc điều chỉnh môi trường nuôi cấy Tùy theo các dạng dẫn xuất của chitin khác nhau cũng ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase Mỗi loại chitinase từ các nguồn khác nhau thích hợp xúc tác thủy phân cơ chất chitin khác nhau Chitinase có thể thích hợp xúc tác thủy phân các loại cơ chất khác nhau của chitin nhưglycol-chitin, colloidal-chitin, swollen-chitin vv…

Nguồn và phương pháp thu nhận enzyme chitinase: Có nhiều nguồn thu

nhận enzyme chitinase Enzyme chitinase có thể tồn tại trong thực vật, động vật và

vi sinh vật Từ các nguồn ở trên, các enzyme chitinase sẽ được tách ra và tinh sạch theo các phương pháp thích hợp

Chitinase thu từ thực vật: Trong thực vật đã có những nghiên cứu và phát

hiện sự tồn tại của chúng ở một số loại cây như cây đậu Hà Lan, đỗ ván, cải bắp, khoai lang, khoai tây, khoai mỡ, trong cây lúa, cây thuốc lá, cây lúa mỳ, lúa mạch vv… [36], [37], [44], [70], [74]…

Chitinase thu từ động vật: Chitinase có tồn tại trong cơ thể một số động

vật Các nhà khoa học đã nghiên cứu tách chiết và làm sạch chitinase thu được từ

gan mực ống Nhật Bản (squid Todarodes pacificus) Chitinase còn thu được từ

huyết thanh của bò Chitinase thu được từ động vật có hoạt độ tương đối cao [53], [54], [59]

Chitinase thu từ vi sinh vật: Một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh

tổng hợp chitinase nếu trong môi trường có chitin làm chất cảm ứng Theo một số tác giả đã nghiên cứu cho thấy một số chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase

mạnh như: Aeromonas sp, Acinetobacter sp strain CHD 101, Eterobacter sp NRG4,

S coelicolar A3, Streptomyces griseus, Streptomyces sp J-13-3, Phaseolus vulgaris, Serratia marcescens E170, Aspergillus fumigatus, Trichoderma viride,

Trichoderma reesei-PC-3-7, Vibrio carchariae, Bacillus circulans, Bacillus brevis, Pseudomonas aeroginose, Serratia plymuthica [41], [55], [56], [68],[73]

Để có thể sinh tổng hợp được chitinase từ vi sinh vật trước hết ta phải phân lập được chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao Sau khi đã xác định được chủng thích hợp, tiến hành nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chủng trong điều kiện nuôi cấy Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase và điều kiện thu nhận chitinase

Các chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase có thể tồn tại ở nhiều nơi khác nhau Có thể phân lập các chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase từ các

phần vỏ giáp xác đang phân hủy hoặc từ bùn của các đìa nuôi tôm vv

1.1.3 Giới thiệu về cây khoai lang

Khoai lang (Ipomoea batatas) là loại cây lương thực được trồng từ lâu đời, là loại hoa màu hằng niên, dễ trồng, nhanh cho thu hái Khoai lang có thể sử dụng cả

lá và củ làm thực phẩm Nhiều nơi gọi khoai lang là Potato còn khoai tây gọi là Irish Potato, khoai lang đỏ có nơi còn gọi là Yam (Yam thường dùng gọi cho khoai mỡ)

Khoai lang là cây rau lương thực đứng hàng thứ bảy trên thế giới sau lúa mì, lúa nước, ngô, khoai tây, lúa mạch, sắn Năm 2004, toàn thế giới đã trồng 9,01 triệu

ha khoai lang, đạt sản lượng 127,53 triệu tấn, sản lượng khoai lang của Việt Nam là 1,65 triệu tấn

Khoai lang có khối lượng đường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước, sắn Khoai lang được sử dụng củ và lá để làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần đây đang được nghiên cứu để làm màng phủ sinh học (bioplastic) Tuỳ theo nhu cầu thị trường mà phân loại củ để chế biến và tiêu thụ phù hợp: củ lớn và củ vừa được dùng để bán tươi và chế biến thực phẩm, củ nhỏ và dây lá dùng cho chăn nuôi, lá của một số giống khoai lang chọn lọc hiện được ưa chuộng để làm rau xanh và làm nước sinh tố Bảng 1: Một số thành phần trong lá khoai lang trong 100 g lá

Thành phần

Lá khoai

Năng lượng (cal)

Protein (%)

Ca (mg)

K (mg) Vit A

(mg)

Vit C (mg)

Lá luộc / 2,6 94 / 3345 5

Nguồn : food composition table.1964 Manila

Tại Việt Nam, khoai lang là cây lương thực ngắn ngày quan trọng, thường được trồng với các loại hoa màu khác xen giữa hai vụ lúa chính Miền Bắc khoai lang đứng thứ 3 về diện tích canh tác sau lúa và ngô, ở miền Nam nó đứng thứ tư sau lúa, cao su và dừa Miền Bắc, khoai lang được trồng nhiều nhất ở các tỉnh Nghệ

An 36,200 ha, Hà Tĩnh 25,500 ha, Thanh Hóa 37,700 ha… trong Nam các tỉnh có diện tích canh tác nhiều như Bến Tre 1300 ha, Vĩnh Long 1900 ha, Cần Thơ 1300

ha, Trà Vinh 1800 ha, Sóc Trăng 1700 ha Nguồn: Tổng cục thống kê Việt nam

2004

Đất trồng: Thích hợp ở vùng đất đỏ và đất xám, đất pha cát ven sông suối, đất thịt tơi xốp Đối với vùng đất đồi khô hạn thì nên trồng vào mùa mưa Cần lên luống, thoát nước, làm đất tơi xốp, ít phèn mặn, pH> 6 Đất phải được dọn sạch cỏ, cày một lần, bừa một lượt trước khi lên luống

Thời vụ: Có thể trồng 4 vụ/năm, thời gian xuống giống tùy theo nông lịch ở

từng địa phương Hai vụ mùa mưa: vụ khoai lang hè thu (trồng tháng 5 thu hoạch đầu tháng 8) luân canh với ngô/lạc/đậu nành/đậu xanh/dưa hấu thu đông Vụ khoai lang thu đông (trồng đầu tháng 8 thu hoạch cuối tháng 10) luân canh với ngô/lạc/đậu nành/đậu xanh của vụ hè thu Hai vụ mùa khô : vụ đông xuân (trồng tháng 11 thu hoạch tháng 2) luân canh với lúa mùa Vụ khoai lang xuân hè (trồng tháng 1 thu hoạch tháng 4) luân canh với lạc/rau/ngô/khoai lang đông xuân Khoai lang trồng mùa khô cần phải chủ động tưới nước Để tăng hiệu quả thu hoạch có thể

bổ sung dưỡng chất bằng bón các loại phân N-P-K

Giống : Có nhiều giống khoai được trồng ở Việt Nam với mục đích khác

nhau Các giống khoai được trồng chủ yếu để thu củ với năng suất cao và chất lượng củ tốt Nhưng có một số giống khoai được trồng chủ yếu để thu lá sử dụng làm thực phẩm, có giống trồng để thu cả củ và lá

Các giống khoai lang có củ, ruột củ với nhiều màu sắc khác nhau, giống vỏ màu trắng, đỏ, hồng, tím, vàng, cam Trong ruột có các màu khác nhau như: trắng, vàng, đỏ, hồng, tím Một số giống khoai được trồng phổ biến là: Hoàng Long, 143,

VX-37, HL4, HL518, HL491, KL1, KL5, K51, KB1, Kokey, Chiêm Dâu, Khoai gạo vv và đặc điểm nhận dạng của chúng

Giống khoai lang Hoàng Long: Là giống có thân màu tím đỏ, lá già xanh

tím, gân lá tím, mặt dưới lá tím, lá hình tim Vỏ củ hồng nhạt, ruột vàng đậm, độ bở của củ trung bình, độ ngọt khá

Giống khoai lang VX-37: Giống khoai có thân tím, đốt ngắn, phân nhánh

nhiều, lá xanh, gân lá tím, lá xẻ thùy nông Củ màu hồng nhạt, ruột vàng nhạt, bở,

ăn ngon Củ hình thành sớm 15-20 ngày sau trồng, tích lũy nhanh, thời gian sinh trưởng ngắn ngày 90 ngày thích hợp với vụ thu đông và đông sớm Khả năng chịu nóng khá, chịu rét kém

Giống khoai lang HL4: Giống có thân chính dài, màu xanh Lá xanh thẫm,

phân thùy 3-5 khía nông, gân lá màu xanh Vỏ củ màu đỏ, ruột màu cam đậm

Giống khoai lang 143: Giống khoai sinh trưởng mạnh, thân lá phát triển

sớm, năng suất chất xanh cao Thân màu xanh sẫm, lá to hình tim, phiến lá mỏng, dây dài phân nhánh ít.Củ màu hồng nhạt, ruột vàng, dạng củ thuôn dài, ăn ngon, bở Khả năng chịu rét khá, tỷ lệ của thương phẩm cao

Giống khoai lang KL5: Giống khoai sinh trưởng thân lá mạnh, khả năng tái

sinh nhanh Thân lá mềm ngọt, thích hợp làm thức ăn gia súc Lá xẻ thùy sâu Củ to thuôn dài, vỏ đỏ tươi, ruột củ màu vàng, chất lượng khá

Giống khoai lang KL1: Giống khoai có lá to hình tim, màu xanh hơi vàng,

cuống lá dài Dạng củ thuôn dài, vỏ và ruột củ màu vàng, ăn ngon và bở

Thu hoạch: Đối với các giống khoai lang phổ biến hiện nay thường thu

hoạch sau 90-100 ngày ở mùa mưa, sau 85-95 ngày ở mùa khô

1.1.4 Giới thiệu về chitin và một số dẫn xuất của chitin

Chitin là một polysaccarit có đạm với khối lượng phân tử lớn Chitin là polymer hữu cơ có trữ lượng lớn, đứng thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose và chúng được tạo ra trung bình 20g/năm/m2 trên bề mặt trái đất Chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do mà hầu hết ở trạng thái liên kết với protein, canxi cacbonat và các hợp chất hữu cơ khác Ví dụ chitin tồn tại ở dạng liên kết với canxi tạo thành lớp vỏ cứng của loài vỏ giáp xác, hay côn trùng [20]

Từ những nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm đặc đều cho ra một kết quả là chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ các đơn vị cơ

sở là N-acetyl--D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết -(1,4) – glucozit

Chitin có công thức phân tử : [C8H13O5N]n

n: phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu

Ví du: Ở tôm hùm n = 700÷800, tôm thẻ n = 400÷500, cua n = 500÷600

Phân tử lượng của chitin: M = (203,09)n

Công thức cấu tạo chitin:

0

0 0

H H H

OH

NHCOCH

0

0 0

3

H H

H H H

OH

NHCOCH n

Tính chất của chitin: Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong

kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ khác như: ete, rượu…

Chitin hòa tan trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối Thioxianat Liti (LiSCN) và muối Thioxianat Canxi [Ca(SCN)2] tạo thành dung dịch keo

Chitin khó hòa tan trong dung dịch Amoniac (NH3), không hòa tan trong thuốc thử Schweizer – Sacrpamonia Điều này có thể là do sự thay đổi nhóm Hydroxyl (-OH) tại vị trí C2 bằng nhóm Acetamin (-NHCOCH3-) đã ngăn cản

sự tạo thành các phức hợp cần thiết

Chitin ổn định với các chất oxy hóa khử như: KMnO4, H2O2, NaClO, Ca(ClO)2… lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất này để tẩy màu chitin và chất lượng chitin vẫn được đảm bảo

Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại có bước sóng trong khoảng 884÷890 nm

Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin sẽ bị khử gốc acetyl tạo thành chitosan

Chitin khi đun nóng trong dung dịch acid HCl đậm đặc sẽ bị thủy phân tạo thành glucosamine và acid acetic Quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở các cầu nối glucosid, tiếp theo là sự loại bỏ nhóm acetyl [20], [23], [35]

Ứng dụng của chitin: Do tính chất của chitin không hòa tan trong nước vì

vậy ứng dụng chitin có phần bị hạn chế hơn so với các dẫn xuất của nó

Chitin được sử dụng để sản xuất da nhân tạo, sản xuất băng, gạc y tế điều trị các vết thương, đặc biệt rất hiệu quả đối với các bệnh nhân bị bỏng Chitin cũng được sử dụng để sản xuất chỉ khâu tự tiêu trong phẫu thuật, ứng dụng trong xử lý nước thải do khả năng hấp thu một số kim loại nặng, ứng dụng trong công nghệ sinh học, công nghệ nano, nông nghiệp, trong công nghiệp, mỹ phẩm vv…

Từ chitin có thể tạo ra rất nhiều loại dẫn xuất bằng các phương pháp khác nhau Mỗi dẫn xuất đều có các tính chất khác nhau, vì vậy việc tạo ra ngày càng nhiều các dẫn xuất sẽ tạo ra nhiều tính chất mới và ứng dụng của chitin ngày càng được mở rộng Từ chitin có thể tạo rất nhiều dẫn xuất khác nhau với nhiều tính chất

và ứng dụng mới Dưới đây là một số dẫn xuất của chitin:

Carboxymethylchitin, Colloidalchitin, Regenerated chitin, Glycol chitin

(O-hydroxyethylatedchitin ), Ethylene glycol chitin, Flake (bông, tuyết) chitin, Swollen chitin, N-acetyl-beta-D-glucosamine, chitobiose (GlcN2), chitotriose (GlcN3), chitotetraose(GlcN4), chitopentaose (GlcN5),GlcN6, CM-chitin (Carboxymethylchitin), Carboxyethyl-chitin, Methyl-chitin, Ethyl-chitin, Hydroxyethyl-chitin, Hydroxypropyl-chitin, Oxidized chitin, Acetyl-chitin, Aminoalkyl-chitin, Allyl-chitin

Olygo-chitin là sản phẩm của quá trình thủy phân chitin theo phương pháp hóa học hoặc sinh học Tùy theo từng điều kiện chế độ thủy phân mà các olygosacharide có khối lượng phân tử khác nhau (số n khác nhau), tính chất khác nhau Olylgo-chitin được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trên thế giới, và ngày càng xuất hiện nhiều thông tin kỹ thuật, nhiều đặc tính quý của các olygo-chitin được công bố Tại Việt Nam các chế phẩm chitosan, olygo-chitin cũng đang được nghiên cứu tại Đại học Nha Trang Đặc điểm khác của olygo-chitin so với chitin, chitosan là nó có khả năng hòa tan trong nước, có hoạt tính sinh học cao nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống

Trong nông nghiệp, olygo-chitin ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của cải bắp, đậu cove và một số loại rau khác Nó có tác dụng tăng năng suất, tăng khả năng kháng bệnh, hạn chế được sử dụng thuốc bảo vệ thực vật góp phần bảo vệ môi

trường Chế phẩm olygo-chitin ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của Ngô Nếu được phun với nồng độ thích hợp khoảng 40ppm, số lần phun là 3 lần/vụ, liều lượng phun 300l/ha năng suất sau khi sử dụng tăng 20% so với đối chứng Các nghiên cứu trên đã được tiến hành tại Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội Chitin, chitosan và các olygo-chitin có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh Đồng thời olygo-chitin còn được sử dụng làm thuốc để hạ cholesterol trong máu [20], [21],[22]

Phương pháp sản xuất chitin và các dẫn xuất của chitin: Trong thực tế,

nguồn chitin tồn tại trong côn trùng, các loài giun, trong loài giáp xác Chitin cũng

có thể được sinh tổng hợp từ vi sinh vật Tại Việt Nam, phế thải từ ngành chế biến thủy sản như vỏ tôm, cua và mực là nguồn chính để sản xuất chitin và các dẫn xuất

từ chitin

Trong thành phần nguyên liệu để sản xuất chitin như vỏ tôm, cua không chỉ chứa chitin mà còn các thành phần khác như protein, sắc tố, và khoáng… vì vậy để thu được chitin phải tiến hành tác các tạp chất đó ra khỏi nguyên liệu

Tách tạp chất là chất khoáng: Sử dụng acid để tách khoáng, trong thành phần cấu tạo của vỏ tôm cua khoáng chiếm một lượng rất lớn, chủ yếu ở dạng CaCO3,

Ca3PO4… có thể sử dụng các acid mạnh để tách khoáng như acid clohydric, acid sunfuric Dùng acid clohydric tốt hơn vì muối có gốc clorua luôn ở dạng hòa tan nên khoáng dễ hòa tan, tách ra và được rửa trôi

Tách protein: sử dụng kiềm loãng (5%) để thủy phân protein còn trong nguyên liệu Sử dụng kiềm để tách protein ra khỏi nguyên liệu ít nhiều cũng ảnh hưởng đến chất lượng của chitin thu được Để tránh ảnh hưởng của môi trường kiềm đến mạch polymer của chitin có thể thay thế bằng các chế phẩm protease để tách protein Phản ứng thủy phân diễn ra nhẹ nhàng, ít ảnh hưởng đến mạch polymer của chitin, chitin thu được có chất lượng tốt hơn [20], [21], [22]

Có rất nhiều dẫn xuất của chitin trong đó chitosan là dẫn xuất được sản xuất

và ứng dụng nhiều nhất hiện nay:

Sản xuất chitosan từ chitin: người ta sản xuất chitosan bằng cách loại bỏ

nhóm acetyl trong mạch polymer của chitin Có thể dùng môi trường kiềm đặc để

loại bỏ nhóm acetyl Phương pháp này ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của chitin

do mạch chitin bị cắt đứt nhiều Chitosan thu được có độ nhớt thấp, tạp chất nhiều, quá trình sản xuất gây ô nhiễm môi trường Hiện nay để nâng cao chất lượng của chitosan thu được, có thể sử dụng enzyme deacetylase để tách nhóm acetyl ra khỏi chitin Như vậy chất lượng của chitin thu được sẽ cao hơn rất nhiều do sử dụng enzyme được thực hiện trong điều kiện nhẹ nhàng, không cần phải sử dụng kiềm đặc và nhiệt độ cao

Sản xuất huyền phù chitin: Chitin tách chiết từ vỏ tôm, cua, mực…được

hòa tan trong HCl đậm đặc, khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở nhiệt độ 400C Chitin tạo thành huyền phù bằng cách thêm từ từ nước lạnh có nhiệt độ 50C Huyền phù chitin là phần bã thu được bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm Huyền phù chitin được rửa bằng nước cất nhiều lần cho đến khi pH = 5 Huyền phù chitin được bảo quản lạnh [23]

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE

1.2.1 Các công trình nghiên cứu ngoài nước

Theo nghiên cứu của Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen (1998)

từ Viện Công nghệ Sinh học Đài Loan Các tác giả đã nghiên cứu về hoạt độ của enzyme chitinase từ cây khoai lang Kết quả nghiên cứu cho thấy: Hoạt độ của chitinase được tìm thấy trong dịch chiết từ các phần khác nhau của cây khoai lang

Cơ chất sử dụng để xác định hoạt độ của enzyme là glycol chitin Theo nghiên cứu thì hoạt độ chitinase chiết được từ các phần khác nhau của cây khoai lang là khác nhau Hoạt độ của chitinase giảm dần khi chiết từ các bộ phận từ cây theo thứ tự lá, chồi (búp), cuống lá, củ Trong cùng điều kiện thí nghiệm, hoạt độ chitinase từ lá cao hơn dây khoai Hoạt độ chitinase từ các lá khoai bị côn trùng cắn sẽ có hoạt độ cao hơn so với các lá còn nguyên vẹn Hoạt độ chitinase từ dây khoai có lá bị côn trùng cắn cũng cao hơn so với dây khoai có lá còn nguyên vẹn Khối lượng phân tử enzyme chitinse của lá và chồi của cây khoai lang khoảng 16 kDa mặc dù khối lượng của hầu hết các chitinase từ thực vật khoảng 30kDa (Boller et al., 1983; Chang et al., 1992; Molanol et al., 1979; Vad et al., 1991; Wadsworth and Zikakis

1984; Yamaggami and Funatsu, 1993) Enzyme chitinase thu được có pH thích hợp

là 5, có nhiệt độ thích hợp là 250C [44], [79]

Neetu Dahiya, Rupinder Tewari, Pam P Tiwari và Gurinder Singh Hoondal (2005) đã nghiên cứu tinh sạch, xác định tính chất và các phản ứng của chitinase thu được từ chủng Enterobacter sp NRG4 Enzyme chitinase chiết được từ

Enterobacter sp NRG4, được tinh sạch bằng cách kết tủa dịch chiết bởi amonium

sulfat, sắc ký trao đổi ion và sắc ký bằng màng lọc sephadex Chitinase thu được có khối lượng phân tử khoảng 60 kDa, có khoảng pH thích hợp từ 4,5 đến 8 (pH tối thích 5,5) Có nhiệt độ tối thích 450C Các ion kim loại có khả năng kích thích làm tăng cường hoạt độ của chitinase như các ion Mg2+, K+ và Ca2+ có khả năng làm tăng hoạt độ từ 13, 16 và 18% Ngược lại có những ion làm bất hoạt chitinase như các ion Cu2+, Co2+, Ag+ và Hg2+ Giá trị Km của chitinase từ Enterobacter sp

NRG4 đối với cơ chất khác nhau là khác nhau và đối với các chủng khác nhau là khác nhau: Km đối với các cơ chất khác nhau được thể hiện như sau: Giá trị Km của

chitinase từ Enterobacter sp NRG4 là 1.43 mg ml-1, 1.41 mg ml-1, 1.8 mg ml-1 and 2.0 mg ml-1, tương ứng với swollen chitin, colloidal chitin, regenerated chitin và glycol chitin [63], [65], [73]

Masaru Mitsutomi (1997) đã nghiên cứu chitinase 19 (chitinase C-1) được

chiết rút từ vi khuẩn streptomyces griseus HUT 6037 Enzyme chitinase C-1 là

enzyme loại endo có thể cắt đứt được liên kết beta- 1,4- N-acetylglucosaminidic và liên kết beta-1,4-glucosaminidic trong khi chitinase chiết rút từ các loại vi sinh vật khác chỉ có thể cắt đứt được liên kết beta- 1,4- N-acetylglucosaminidic của chitin Chitinase thu được từ dịch chiết được tinh sạch bằng sắc ký cho 2 enzyme chitinase C-1 và C-2 có khối lượng phân tử đều bằng 27 kDa, có điểm đẳng điện lần lượt 7.7

và 7.3 Chitinase C-1, C-2 có khoảng pH thích hợp 4.5 đến 6 và bền trong khoảng

pH rất rộng từ 6.5 đến 10 chitinase thu được có khả năng thủy phân chitin, colloidal chitin, glycol chitin, cacboxymethyl chitin, 53% deacetylated chitosan và oligomers của N-acetylglucosamine nhưng enzyme này không thủy phân được 96% deacetylated chitosan [49], [50], [57]

Katsuichiro Okazaki, Hiromasa Maki, Tomomi Imachi và Shigeru Hayakawa

(1997) nghiên cứu hai loại chitinase thu được từ Streptomyces sp J-13-3 là

chitinase A và B với khối lượng phân tử lần lượt 31 và 32 kDa, có điểm đẳng điện lần lượt 3.9 và 3.5 Khoảng pH thích ổn định từ 4 đến 6 đối với chitinase A và chitinase B là 3 đến 7 nhiệt độ thích hợp đối với cả hai enzyme là 450C Hoạt độ của hai enzyme bị ức chế bởi N-bromo và N- cholorosuccunimide (1mM) [54], [55], [64]

G Lundblad, M Elander, J Lind and K Slettengren (1979) đã nghiên cứu và phát hiện sự tồn tại của chitinase có trong huyết thanh của bò Enzyme đã được tinh sạch gấp 1000 lần bằng sắc ký trao đổi ion và lọc gel Khối lượng phân tử khoảng

47 kDa, điểm đẳng điện pI = 5,3 Enzyme thu được có pH thích hợp 1,5 – 3 với cơ chất glycol chitin và 3 – 6 đối với colloidal chitin Đối với cơ chất glycol chitin, enzyme có hoạt độ cao nhất ở nhiệt độ 300C và pH = 5 hoặc ở 400C và pH = 2,4 có

Km = 0.76 mg/ml [59]

Masahiro Matsumiya, Kouji Miyauchi và Atsushi Mochizuki (2002) đã nghiên cứu chitinase từ gan mực Hai enzyme chitinase có khối lượng tương ứng 38 kDa và 42 kDa Với enzyme có khối lượng phân tử 38 kDa có pH thích hợp là 3, chitinase có khối lượng 42 kDa có pH thích hợp là 3 và 9 Km của hai enzyme là 0.071mg/ml và 0.074 mg/ml đối với cơ chất là colloidal chitin Enzyme thu được không chỉ thủy phân được chitin mà còn thủy phân được chitosan với độ deacetyl (DA=95%) [52], [53]

Wolfgang F Osswald, Jeffrey P Shapiro, Hamed Doostdar, Roy E McDonald, Randall P Niedz, C Joseph Nairn, C Jack Hearn and Richard T Mayer

đã nghiên cứu khả năng thủy phân của chitinase và chitosanase từ các nốt sần của trái cam Chitinase được làm sạch bằng cột trao đổi ion và sắc ký lỏng cao áp Có

11 enzyme thu được có khối lượng phân tử từ 26 – 37,4 kDa Enzyme thu được có

pH tối ưu từ 4,5-5,4 Các enzyme đều ở dạng endochitinase Các enzyme đều có khả năng thủy phân chitin và 4 enzyme trong số đó có khả năng thủy phân chitosan và chúng có thể là các chitosanases

Hung TH, Chang YM, Sung HY, Chang CT (2002) đã nghiên cứu tinh sạch

và xác định hoạt tính thủy phân của chitinase và chitosanase từ chồi dứa enzyme được chiết ra từ chồi dứa, được làm sạch bằng cột trao đổi ion và màng lọc gel Chitinase thu được có khả năng thủy phân glycol chitin, có nhiệt độ tối ưu ở 600C

và pH thích hợp bằng 4, có Km = 0.2 mg/ml Đối với chitosan, enzyme thu được thủy phân chitosan có độ deacetyl (DD = 30 – 80%) ở nhiệt độ tối ưu = 500C, pH =

3 và Km = 0.88 mg/ml Enzyme có khối lượng phân tử 32,4 kDa, có điểm đẳng điện 5,9 và enzyme bị ức chế bởi các kim loại nặng như Ag+, Hg2+

Guoqing Xia, Chunsheng Jin, Ju Zhou, Shoujun Yang, Shuzheng Zhang và

Cheng Jin (2001) nghiên cứu chitinase thu được từ chủng Aspergillus fumigatus

YJ-407 Chitinase thu được là enzyme ngoại bào, có khối lượng phân tử khoảng 46 kDa, điểm đẳng điện = 5.6, có nhiệt độ tối ưu 600C và pH tối ưu 5 Enzyme cho hoạt độ cao nhất đối với cơ chất là glycol chitin Enzyme thu được có cả hai dạng là endo và exochitinase Enzyme bị bất hoạt mạnh bởi các ion Pb2+, Fe2+, Mn2+,

Zn2+,Ag+, Hg2+ và hoạt độ của enzyme được tăng khi có mặt của triptophan và các nhóm cacboxyl

Santhana nakapong, Rat pichyangkura (2005) nghiên cứu chitinase từ

Bacillus sp.PP8 Khi nuôi cấy Bacillus sp.PP8 trong môi trường chứa colloidal

chitin, flake chitin hay bột chitin thì phát hiện sự có mặt của cả chitinase và chitosanase nhưng trong môi trường nuôi colloidal chitosan hoặc chitosan có độ deacetyl (DD = 100%) thì chỉ phát hiện sự tồn tại của chitosanase Enzyme chitinase thu được thích hợp với cơ chất là colloidal chitin Nhiệt độ tối ưu cho enzyme 500C và pH tối ưu 8, khối lượng phân tử khoảng 66 kDa Trong dịch chiết cũng có mặt của chitosanase có cùng nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu = 7 [68]

Eva-lena hult, Fuminori Katouno, Taku Uchiyama, Takeshi Watanabe và Junji Sugiyama (2005) đã công bố kết quả nghiên cứu hai loại enzyme chitinase A

và B từ Serratia marcescens 2170 Chitinase thu được sử dụng để thủy phân

beta-chitin trong 20 mM đệm phosphat pH = 6 cùng nhiệt độ 370C trong thời gian 45 giờ với tỉ lệ 0.5 mg/ml và 1mg/ml tương ứng với chitinase A và B cho kết quả tốt [41]

Roy E McDonald, E Berdis and H Doostdar (1996) đã nghiên cứu xác định tính

chất của 7 endochitinases được tách ra từ tế bào của Citrus sinensis (L.) Khối

lượng trung bình của các enzyme từ 23 – 28 kDa và điểm đẳng điện từ 10,3 – 10,4

Shimono K, Matsada H và Kawamukai M (2002) đã nghiên cứu chức năng của chitinase và chitosanase, vai trò của chúng đối với hình thái của các bào tử nấm

Schizosaccharomyces

1.2.2 Các công trình nghiên cứu trong nước

Hiện nay trong nước, các công trình nghiên cứu đang tập trung vào chitin, chitosan và các chế phẩm từ chúng Tập trung nghiên cứu về chitin chitosan không những tận dụng được nguồn phế liệu thủy sản dồi dào, nâng cao giá trị của thủy sản

mà còn tìm hiểu nhiều đặc tính quý của các chế phẩm cũng như mở rộng ứng dụng của chitin, chitosan trong đời sống

Trần Thị Luyến (2005), Đại học Thủy sản đã đưa ra quy trình sản xuất olygo-chitin, olygo-chitosan, glucosamin, N-acetyl-β-D-glucosamin Chitin, chitosan được thủy phân bằng acid HCl đậm đặc Hiệu suất thu sản phẩm đạt 90%, sản phẩm có tính kháng khuẩn, chống oxy hóa nhưng có nhược điểm hoạt tính sinh học thấp, nhiều tạp chất

Trần Thị Luyến, Lê Thị Tưởng, Đặng Trung Thành, Nguyễn Ngọc Anh (2007), bước đầu nghiên cứu sản xuất COS (chitoolygosaccharide) từ chitin, chitosan bằng enzyme Hemicellulase thương mại, enzyme chitinase từ lá khoai lang, enzyme papain từ đu đủ, enzyme cellulase từ xạ khuẩn

Trang Sĩ Trung (2005), nghiên cứu ứng dụng chitosan làm chậm quá trình phân rã của thức ăn tôm trong môi trường ao nuôi

Một số nghiên cứu đã được triển khai như:Nghiên cứu thử nghiệm thu nhận

chế phẩm enzyme chitinase kỹ thuật từ Streptomyces griceus Nghiên cứu enzyme chitinase từ nấm mốc Trichoderma harzianum và ứng dụng chúng trong một số lĩnh

vực đời sống

Các nghiên cứu được thực hiện tại Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh (2005), Xây dựng các cơ sở dự liệu sinh học: chitinase, chitosanase, HrcA; Mô hình

hóa phân tử trên protein chitosanase từ Bacillus circulans MH-K1 bằng một hệ

thống tính toán song song nhằm khảo sát ảnh hưởng của pH trên cấu trúc protein

Hiện nay, nghiên cứu về chitinase thu được từ lá khoai lang chưa có tác giả nào nghiên cứu và công bố Đề tài nghiên cứu về chitinase từ thực vật là hướng đi mới Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đưa ra được giống khoai thích hợp cho chiết

rút enzyme, đã nghiên cứu xác định điều kiện chiết enzyme thích hợp, các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme và bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase để thuỷ phân chitin trong sản xuất olygo-chitin

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1.Nguồn thu nhận enzyme chitinase

Qua các tài liệu đã nghiên cứu về enzyme từ nguồn thực vật cho thấy:Có nhiều thực vật có thể sử dụng làm nguồn để chiết rút chitinase như sau: Chiết rút chitinase từ lá cây đậu, lá cây đỗ tương, lá khoai lang, khoai tây, khoai mỡ lúa mỳ, lúa mạch, lá cây thuốc lá vv Khoai lang là đối tượng được lựa chọn để nghiên cứu chiết rút enzyme chitinase vì khoai lang được trồng rất phổ biến tại Việt Nam, lá khoai chưa được tận dụng triệt để, gây lãng phí Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy trong khoai lang có tồn tại enzyme chitinase, tùy theo từng bộ phận của cây sử dụng để chiết sẽ thu được hoạt độ của enzyme khác nhau Có thể thu enzyme chitinase từ lá khoai, cuống lá, mầm chồi vv… [40], [44], [79]

2.1.2 Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo-chitin

Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo-chitin là chitin thu được từ quá trình xử lý

vỏ tôm sú như sau: Vỏ tôm sú được xử lý qua nước sạch để loại bỏ tạp chất, được

xử lý bằng acid clohydric HCl 5% để loại bỏ khoáng và xử lý kiềm NaOH 5% để loại bỏ protein Vỏ tôm sau khi đã xử lý qua acid và kiềm được rửa lại bằng nước sạch và đem đi phơi khô Chitin thu được có trạng thái mềm mại, có màu trắng ngà

Do tính chất của chitin không hòa tan trong nước, trong môi trường acid, kiềm loãng vì vậy rất khó sử dụng enzyme chitinase thủy phân chitin trực tiếp Chitin tiếp tục được xử lý để thu được chitin ở dạng huyền phù chitin [20], [23]

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để tiến hành nghiên cứu đề tài một cách khoa học, từ các nội dung của đề tài cho phép đưa ra quy trình nghiên cứu tổng quát như sau:

Chế phẩm thô (CPE)

XĐ Các yếu tố ảnh hưởng đến CPE

Các yếu tố ảnh hưởng Thủy phân chitin Chuẩn bị chitin

Thu olygo-chitin và tính hiệu suất thủy phân

2.2.1.Phương pháp thu nhận và bảo quản nguyên liệu thu chitinase:

Lá khoai lang tươi thu hái ngay tại vườn, được mang về phòng thí nghiệm, rửa sạch tạp chất và tiến hành chiết rút ngay enzyme Trong thời gian chuẩn bị thí nghiệm có thể bảo quản lá khoai lang trong ngăn lạnh của tủ lạnh trước khi tiến hành chiết rút enzyme

2.2.2 Bố trí thí nghiệm lựa chọn giống khoai lang thích hợp

Nghiên cứu ảnh hưởng của giống khoai đến hoạt độ enzyme chitinase thu được Chọn lá khoai lang từ ba giống khoai lang bao gồm: giống VX-37, giống khoai 143, giống HL4 Lá khoai lang được thu hái sau khi trồng 1 - 2 tháng Chitinase được chiết bằng nước cất với tỷ lệ nước cất/nguyên liệu là 1/1 Quá trình chiết ở điều kiện nhiệt độ 5 – 100C, thời gian chiết 15 phút Dịch chiết được lọc qua vải thu dịch lọc Dịch lọc được ly tâm lạnh 50C, tốc độ 9000 vòng/phút trong thời gian 10 phút Kết thúc ly tâm thu được dịch và loại bỏ bã Xác định hoạt độ chitinase trong DC của các mẫu So sánh và đánh giá kết quả thu được, chọn giống khoai lang thích hợp sử dụng cho đề tài nghiên cứu Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:

Giống VX-37 Giống 143 Giống HL4

Chọn giống khoai lang thích hợp

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tình trạng tổn thương của cây, vị trí chiết rút đến hoạt độ chitinase

Tiến hành xác định ảnh hưởng tình trạng tổn thương của cây như từ lá, cuống của lá bị tổn thương và lá, cuống của lá không bị tổn thương đến hoạt độ chitinase thu được trên giống khoai lang đã được chọn Xác định hoạt độ của chitinase thu được So sánh, phân tích và đánh giá kết quả thu được

Tiến hành nghiên cứu xác định ảnh hưởng các phần (các bộ phận khác nhau) của cây khoai lang bao gồm lá, cuống lá và dây khoai lang đến hoạt độ chitinase thu được Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:

Tình trạng tổn thương của cây Các bộ phận của cây

2.2.4 Bố trí thí nghiệm xác định phương pháp tách chiết enzyme chitinase

Để có thể tách chiết và thu nhận enzyme chitinase hiệu quả, bố trí thí nghiệm

để xác định dung môi thích hợp sử dụng chiết enzyme Sau khi đã lựa chọn được dung môi chiết thích hợp, tiến hành tối ưu tỉ lệ dung môi chiết/nguyên liệu và thời gian chiết

Xác định sự ảnh hưởng của dung môi chiết tới hoạt độ của enzyme, tiến hành thí nghiệm để chọn dung môi chiết enzyme thích hợp như sau: Lá khoai lang tươi được xay nhỏ, enzyme trong lá được chiết bằng các dung môi khác nhau: nước cất, dung dịch muối sinh lý và đệm acetat pH = 5 Tiến hành chiết trong điều kiện nhiệt độ 5 – 100C Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu = 1/1, thời gian chiết 15 phút Dịch chiết được lọc thô qua vải lọc để tách bã Tiến hành ly tâm lạnh dịch lọc ở nhiệt độ

50C với tốc độ 9000 vòng/ phút Loại bỏ phần bã để thu phần dịch có chứa enzyme Xác định hoạt độ enzyme DC thu được từ đó lựa chọn dung môi chiết thích hợp

Sau khi lựa chọn được dung môi thích hợp cho quá trình chiết rút enzyme, tiến hành tối ưu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chiết Đối với thông số tỷ lệ dung môi chiết/nguyên liệu, bố trí thí nghiệm với các tỷ lệ khác nhau: 0,5/1; 0,75/1; 1/1; 1,25/1; 1,5/1; 1,75; 2/1 Xác định hoạt độ enzyme DC ở các tỷ lệ khác nhau qua

đó lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết/nguyên liệu thích hợp

Thí nghiệm được bố trí để xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt

độ enzyme chitinase DC Thí nghiệm với các thời gian chiết khác nhau: 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40 phút Xác định hoạt độ enzyme DC thu được với thời gian khác nhau từ đó lựa chọn được thời gian chiết thích hợp [2], [6], [8], [15], [24]

Để nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết thích hợp và tối ưu quá trình chiết, thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:

Lá khoai lang

Xay nhỏ

Chiết enzyme

Chọn loại dung môi thích hợp

Nước cất DD muối sinh lý Đệm acetat pH=5

Tối ưu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chiết

Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu Thời gian chiết

Lọc qua vải lọc Loại bã

Ly tâm

Dịch chiết enzyme

Xác định hoạt độ enzyme DC

Lựa chọn dung môi, tỉ lệ và thời gian chiết

2.2.5 Bố trí thí nghiệm thu nhận chế phẩm enzyme (CPE)

Từ enzyme DC, sử dụng các tác nhân kết tủa enzyme để thu được chế phẩm enzyme kỹ thuật (CPE) Các tác nhân kết tủa bao gồm ethanol, aceton và amonium

Tỉ lệ (ml/g) 0,5/1; 0,75/1; 1/1; … ; 1,75/1; 2/1

Thời gian (phút) 0; 5; 10; ….; 35; 40

sunfat Mỗi loại tác nhân kết tủa có khả năng kết tủa và ảnh hưởng đến hoạt tính CPE khác nhau Để lựa chọn được tác nhân kết tủa thích hợp, tiến hành kết tủa enzyme bằng các tác nhân trên ở cùng nồng độ 70%, thời gian kết tủa trong 1 giờ ở nhiệt độ 50C Ly tâm thu kết tủa có chứa enzyme (CPE) Xác định hoạt độ của CPE

để đánh giá, lựa chọn tác nhân kết tủa thích hợp của chitinase [2], [6], [8], [15], [24]

Sau khi lựa chọn được tác nhân kết tủa thích hợp, tiến hành tối ưu hóa các điều kiện kết tủa: nồng độ tác nhân kết tủa, thời gian kết tủa qua đó đánh giá được ảnh hưởng của điều kiện kết tủa đến hoạt độ của CPE thu được Đối với nồng độ tác nhân kết tủa, bố trí thí nghiệm kết tủa enzyme với các nồng độ tác nhân kết tủa khác nhau: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% Xác định hoạt độ CPE thu được ở các nồng độ khác nhau, qua đó lựa chọn nồng độ tác nhân kết tủa thích hợp Để xác định ảnh hưởng của thời gian kết tủa ảnh hưởng đến hoạt độ của CPE, bố trí thí nghiệm với thời gian kết tủa enzyme khác nhau: 15; 30; 45; 60; 75; 90; 105; 120 phút Xác định hoạt độ CPE ở các thời gian kết tủa khác nhau từ đó lựa chọn thời gian kết tủa thích hợp Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như sau:

Dịch chiết chứa enzyme

Kết tủa enzyme bằng các tác nhân

Aceton 70% Sunfat amonium 70% Ethanol 70%

Tối ưu nồng độ và thời gian kết tủa

Xác định hoạt độ CPE chitinase

Nồng độ tác nhân kết tủa (%)

50%; 55%; 60%; … ; 75%; 80%

Thời gian kết tủa (phút)

15; 30; 45; ……; 105; 120

Chọn tác nhân và điều kiện kết tủa thích hợp

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme chitinase và xác định lượng

đường glucosamine theo phương pháp Nelson-Morgan

* Xác định hoạt tính enzyme chitinase

Nguyên tắc:Hoạt tính của enzyme chitinase được xác định dựa trên phương

pháp định lượng sản phẩm N-acetyl-β-D-glucosamine của quá trình phân giải chitin

* Xác định lượng đường glucosamine theo phương pháp Nelson-Morgan

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự hình thành các chất dẫn xuất

pyrrole khi glucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton Những pyrrole này sẽ phản ứng màu với thuốc thử Ehrlich Những lượng glucosamine tương đương sẽ cho ra cường độ màu tương đương trong cùng điều kiện Dịch thủy phân được phản ứng với thuốc thử acetyl aceton và thuốc thử Ehrlich, dung dịch sẽ chuyển sang màu đỏ Tiến hành so màu dung dịch ở bước sóng 512 nm Tiến hành xây dựng đường chuẩn glucosamine Nồng độ glucosamine trong dịch thủy phân sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn glucosamine [23]

2.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ chitinase DC và CPE, độ bền nhiệt của enzyme

* Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ chitinase DC, CPE

Nhiệt độ là thông số rất quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase DC và CPE Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chitinase bằng cách cho chitinase xúc tác phản ứng thủy phân với cơ chất là chitin ở các nhiệt độ khác nhau Theo tài liệu tham khảo và các thí nghiệm biên đã chọn được khoảng nhiệt độ thích hợp để tiến hành nghiên cứu Thí nghiệm thực hiện với các nhiệt độ: 100C, 150C,

200C, …., 650C, 700C để xác định nhiệt độ thích hợp của chitinase Sau thời gian thủy phân 2 giờ, gia nhiệt đến nhiệt độ sôi để dừng phản ứng Tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo phương pháp Elson – Morgan từ đó xác định nhiệt

độ thích hợp của enzyme chitinase

Tương tự như nhiệt độ, xác định pH thích hợp của chitinase bằng cách cho chitinase xúc tác phản ứng thủy phân với cơ chất là huyền phù chitin ở nhiệt độ xác định Theo tài liệu tham khảo và các thí nghiệm biên đã chọn được khoảng pH thích

hợp để tiến hành nghiên cứu Thí nghiệm thực hiện với pH môi trường khác nhau,

pH = 2,0; 2,5; 3,0; ….; 7,0; 7,5; 8,0 Sau thời gian thủy phân 2 giờ, gia nhiệt đến nhiệt độ sôi để dừng phản ứng Tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo phương pháp Elson – Morgan từ đó xác định pH thích hợp của enzyme chitinase Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính chitinase DC và CPE Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:

Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ enzyme

Thủy phân ở các nhiệt độ (0C) Thủy phân ở các pH

Xác định hoạt độ chitinase

Chọn nhiệt độ, pH thích hợp của enzyme DC và CPE

* Xác định độ bền nhiệt của chitinase DC và CPE

Xác định độ bền nhiệt của enzyme bằng cách giữ enzyme ở nhiệt độ 450C,

500C trong các khoảng thời gian khác nhau: 0, 10, 20, …, 60 phút Nhanh chóng làm lạnh về nhiệt độ thường Tiến hành xác định hoạt độ enzyme của các mẫu thí

nghiệm Từ đó đánh giá về tính bền nhiệt của chitinase

2.2.8 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân chitin thích hợp bằng CPE chitinase

Để có thể xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng CPE chitinase, các thông số cần khảo sát là: nhiệt độ, pH, nồng độ CPE chitinase, nồng độ chitin, các chất phòng thối vv Từ đó đánh giá được các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình thuỷ phân chitin bằng CPE chitinase

*Chuẩn bị chitin:

Nhiệt độ (0C)

10; 15; 20; 25; 30; … ; 55; 60; 65; 70

pH 2; 2,5; 3; 3,5; 4; … ; 6,5; 7; 7,5; 8

Do chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính của enzyme chitinase cần phải huyền phù hóa chitin, làm tăng khả năng tiếp xúc của enzyme chitinase với chitin trong quá trình thủy phân Huyền phù chitin thu được đem bảo quản lạnh sử dụng cho nghiên cứu Chuẩn bị huyền phù chitin được trình bày trong phụ lục 2

Huyền phù chitin có các chỉ tiêu chất lượng như sau:

đó lựa chọn được nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân

Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân, thí nghiệm được thực hiện với các nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C Sau các khoảng thời gian thủy phân: 0, 2, 4, 6 …14, 16 giờ, tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo phương pháp Elson – Morgan Đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chitinase Chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân

Yếu tố pH cũng là thông số quan trọng ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của chitinase trong quá trình thuỷ phân.Tiến hành thủy phân chitin bằng CPE với nồng

độ đã chọn, ở nhiệt độ thích hợp Quá trình thủy phân ở các pH môi trường khác nhau: pH = 4,5; 5; 5,5; 6 được điều chỉnh bằng acid acetic, NaOH Sau thời gian thủy phân, tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo phương pháp Elson – Morgan Chọn pH thích hợp cho quá trình thủy phân