15.56 19.45 20.52 21.34 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% Nồng độ CPE (%) H i ệ u s u ấ t th u ỷ p h â n ( % )
Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thủy phân chitin.
Theo kết quả nghiên cứu cho thấy: nồng độ CPE chitinase càng tăng thì tốc độ thủy phân chitin tăng, lượng olygo-chitin tạo thành tăng. Nhưng lượng olygo- chitin tăng không đều so với mức độ tăng nồng độ CPE. Khi tăng nồng độ CPE từ 0,1% tới 0,2% hiệu suất thủy phân tăng từ 15,56% lên đến 19,45% (hiệu suất thuỷ phân ở [CPE] = 0,2% tăng 1,25 lần so với thuỷ phân ở [CPE] = 0,1%). Nếu tiếp tục tăng nồng độ CPE lên tới 0,3% và 0,4% thì hiệu suất quá trình thủy phân chỉ tăng lên tương ứng là 20,52% và 21,34%. Hiệu suất thuỷ phân ở nồng độ CPE ở nồng độ 0,3% tăng gấp 1,055 so với nồng độ CPE 0,2%, hiệu suất thuỷ phân ở nồng độ CPE ở nồng độ 0,4% tăng gấp 1,039 so với nồng độ CPE 0,3%. Kết quả trên cho thấy [CPE] = 0,3 – 0,4% hiệu suất thuỷ phân tăng lên rất chậm so với [CPE] = 0,2%. Từ kết quả trên cho thấy nồng độ CPE = 0,2 % là thích hợp cho quá trình thủy phân chitin. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Trần Thị Luyến và các cộng sự (2007), Đại học Nha Trang về hiệu suất thuỷ phân chitin từ enzyme hemicellulase thương mại cho thấy: hiệu suất thuỷ phân theo tỷ lệ enzyme hemicellase/chitin =1/1 là thích hợp, khi đó hiệu suất thuỷ phân đạt 79,8%. Hiệu suất thuỷ phân từ hemicellase là rất cao so với chitinase thu từ lá khoai lang (21,34%). Nhưng giá thành của hemicellase thương mại rất cao trong khi đó nguồn thu chitinase là lá khoai lang rẻ tiền, dễ tìm và lá khoai có thể thu quanh năm vì vậy có thể chủ động được nguồn nguyên liệu cho chiết rút enzyme, tận dụng được nguồn phế liệu lá khoai.
16.96 19.70 20.89 17.63 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 20 25 30 35 Nhiệt độ (oC) H iệ u s u ấ t th ủ y p h â n (% )
Hình 3.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân chitin.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ 300C cho hiệu quả thủy phân cao nhất (đạt 20,89%). So sánh với các nghiên cứu của tác giả Trần Thị Luyến và các cộng sự về hiệu quả thủy phân chitin của một số enzyme khác như cellulase (đạt cao nhất 46,6% ở nhiệt độ 550C), Hemicellulase thương mại (hiệu suất cao nhất 76,4% ở nhiệt độ 370C), enzyme papain (đạt hiệu suất cao nhất 95% ở nhiệt độ 750C sau 6 ngày thủy phân). Kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân của chitinase thu được từ lá khoai lang là thấp (chỉ đạt 20,89%). Nhưng thời gian thủy phân chitin của chitinase ngắn chỉ từ 12 – 16 giờ trong khi đó quá trình thủy phân của các enzyme cellulase, hemicellulase, papain kéo dài từ 5 – 7 ngày.
* Hiệu suất thủy phân chitin của chitinase thu từ lá khoai lang theo pH:
16.96 18.15 19.78 15.78 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 4,5 5,0 5,5 6,0 pH H iệ u s u ấ t th ủ y p h â n ( % )
Hình 3.20: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thủy phân.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ pH = 5,5 cho hiệu quả thủy phân cao nhất (đạt 19,78%). So sánh với các nghiên cứu của GS.TS Trần Thị Luyến và các cộng sự về hiệu quả thủy phân chitin của một số enzyme khác như cellulase (đạt cao nhất 45,6% ở pH = 5,2), Hemicellulase thương mại (đạt hiệu suất cao nhất 84,7% ở pH = 5,5), enzyme papain (đạt hiệu suất cao nhất 95% ở pH = 5,5 sau 6 ngày thủy phân). Kết quả cho thấy pH thích hợp cho quá trình thuỷ phân chitin bằng chitinase từ lá khoai lang cũng gần với pH của các enzyme cellulase, hemicellulase, papain.
*Hiệu suất thủy phân chitin của chitinase từ lá khoai theo nồng độ chitin:
20.19 21.30 22.15 18.00 17.33 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0,5% 0,75% 1,0% 1,25% 1,5% Nồng độ chitin (%) H iệ u s u ấ t th ủ y p h â n
Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hiệu suất thủy phân.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ chitin trong phản ứng cũng ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu suất thu hồi của phản ứng thủy phân chitin. Phản ứng cho hiệu suất cao nhất (22,15%) khi nồng độ chitin trong môi trường là 1%. Nồng độ chitin 0,5% và 0,75% cho hiệu suất cao hơn (lần lượt 20,19% và 21,3%) so với nồng độ chitin là 1,5% và 2% (hiệu suất là 18% và 17,33%).
Đề xuất quy trình sản xuất olygo-chitin:
Từ những kết quả nghiên cứu chiết rút chitinase từ là khoai lang và thử nghiệm sử dụng chitinase thuỷ phân chitin cho phép đề xuất quy trình chiết rút chitinase và sử dụng chitinase thuỷ phân chitin thu olygo-chitin theo sơ đồ sau:
Lá khoai lang
Xay nhỏ
Chiết enzyme
Lọc qua vải lọc Loại bã
Ly tâm Loại bã Dịch chiết enzyme Kết tủa enzyme Chế phẩm thô (CPE)
Thủy phân chitin
Thu olygo-chitin + Đệm acetat pH = 5
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 1/1
+ Thời gian chiết: 10 phút
+ Kết tủa enzyme bằng ethanol
+ Nồng độ ethanol kết tủa: 65%
+ Thời gian kết tủa: 45 phút + Nồng độ CPE: 0,2% + Nhiệt độ: 300C + pH = 5,5 + Nồng độ chitin: 0,75 – 1%
Thuyết minh quy trình:
Lá khoai lang thu hái tươi, rửa bằng nước sạch để loại bỏ tạp chất. Tiến hành xay nhỏ lá khoai cùng với đệm acetat pH = 5. Tỷ lệ đệm acetat/nguyên liệu = 1/1. Thời gian chiết 10 phút, chiết ở nhiệt độ 5 – 100C.
Sau khi chiết xong, lọc qua vải lọc để thu dịch chiết.
Dịch chiết được ly tâm lạnh với tốc độ 9000 vòng/phút ở nhiệt độ 50C trong thời gian 15 phút. Thu dịch chiết chứa enzyme chitinase, loại bỏ bã ở đáy của ống ly tâm.
Kết tủa enzyme chitinase bằng ethanol nồng độ 65% trong thời gian 45 phút thu được chế phẩm enzyme chitinase.
Tiến hành thuỷ phân chitin bằng CPE chitinase với nồng độ CPE = 0,2% nhiệt độ thuỷ phân 300C, pH = 5,5 và nồng độ cơ chất chitin 0,75 – 1%. Không phải bổ sung ethanol để phòng thối.
Sau khi kết thúc quá trình thuỷ phân, dịch thuỷ phân lọc qua giấy lọc thu dịch có chứa olygo-chitin. Dịch lọc được cô quay chân không để thu sản phẩm olygo-chitin.
Nghiên cứu về enzyme chitinase từ thực vật là nội dung nghiên cứu mới. Tại Việt Nam cho đến nay chưa có công trình nào công bố về chitinase thu được từ lá khoai lang. Đề tài đã đưa ra được giống khoai thích hợp sử dụng để chiết rút enzyme chitinase, đưa ra được các điều kiện thích hợp để chiết rút enzyme và các điều kiện thích hợp cho quá trình thuỷ phân chitin thu sản phẩm olygo-chitin. Mặc dù hiệu suất thuỷ phân chitin của chitinase thấp chỉ đạt 21,34% nhưng nguồn thu enzyme là lá khoai lang rất dễ tìm, rẻ tiền và có quanh năm và cũng là một hướng tận dụng nguồn phế liệu lá khoai trong nông nghiệp.
Kết luận và đề xuất ý kiến
1. Kết luận:
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên có thể rút ra một số kết luận như sau:
* Chọn được giống khoai thích hợp cho chiết rút enzyme chitinase. Giống khoai (giống 143) có thân màu xanh sẫm, lá to hình tim, phiến lá mỏng, dây dài phân nhánh ít. Là giống có hiệu suất thu chất xanh cao, chủ yếu trồng để thu lá.
* Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết chitinase DC, thu nhận CPE.
+ Dung dịch đệm acetat pH = 5 là dung môi thích hợp cho chiết rút chitinase. + Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 1/1 là thích hợp cho chiết rút. Thời gian chiết rút 10 phút.
+ Sử dụng lá khoai lang tươi, bị tổn thương do tác động cơ học, do các loại sâu bệnh, do côn trùng ăn lá sẽ thu enzyme chitinase có hoạt độ cao hơn.
+ Sử dụng ethanol với nồng độ 65%, thời gian kết tủa 45 phút là thích hợp cho kết tủa thu nhận CPE chitinase.
+ Nhiệt độ thích hợp của enzyme chitinase là 300C, pH = 5,5 là pH thích hợp của chitinase.
+ Chitinase là enzyme có độ bền nhiệt kém. Xử lý CPE chitinase ở nhiệt độ 500C trong thời gian 60 phút hoạt độ CPE chỉ còn 11,72%.
* Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng enzyme chitinase.
+ Khoảng nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy là T0C = 25 – 300C, khoảng pH = 5,5 – 6 thích hợp cho quá trình thủy phân.
+ Nồng độ CPE = 0,2% là hợp lý cho quá trình thủy phân chitin. Cơ chất chitin sử dụng cho thuỷ phân ở dạng huyền phù chitin với nồng độ thích hợp 0,75 – 1%. + Không cần sử dụng ethanol hay các chất khác để phòng thối cho quá trình thủy phân chitin.
2. Đề xuất ý kiến
Qua quá trình nghiên cứu cho phép đề xuất một số ý kiến sau:
+ Nghiên cứu một số phương pháp tinh sạch enzyme chitinase chiết rút từ lá khoai lang, làm tăng hoạt tính chitinase thu được.
+ Cần nghiên cứu một số dẫn xuất khác của chitin (swollen-chitin, glycol-chitin) sử dụng làm cơ chất cho thủy phân, qua đó có thể so sánh hiệu quả thủy phân của chitinase đối với các dẫn xuất khác nhau.
+ Cần tiếp tục nghiên cứu về chitinase ở một số loài thực vật khác cũng như các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. Từ đó có những hiểu biết sâu hơn về chitinase và so sánh đánh giá sâu hơn về tính chất, hiệu quả ứng dụng thủy phân chitin của chitinase từ các nguồn khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước:
1. Hoàng Thị Huệ An (2003), “ Nghiên cứu chiết rút astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm”, báo cáo đề tài khoa học cấp trường.
2. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quy trình thủy phân protein cá bằng enzym protease từ B.sutilis.s5, Luận án tiến sĩ sinh hóa học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh.
3. Bezborodov A.M, Nguyễn Văn Uyển và các tác giả (1994), Công nghệ sinh
học và một số ứng dụng tại Việt Nam, tập 1, Nxb. Nông Nghiệp.
4. Bezborodov A.M, Nguyễn Văn Uyển và các tác giả (1994), Công nghệ sinh
học và một số ứng dụng tại Việt Nam, tập 2, Nxb. Nông Nghiệp.
5. Nguyễn Cảnh (1995), Quy hoạch thực nghiệm, Đại học Bách Khoa, Tp Hồ Chí Minh.
6. Nguyễn Trọng Cẩn (Chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, (1998), Công nghệ Enzym, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh.
7. Nguyễn Hữu Chấn (1983), Enzyme và xúc tác sinh học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
8. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1992), Hóa sinh học, Nhà xuất bản Trường Đại học Sư phạm.
9. Nguyễn Lân Dũng (1992), Tìm hiểu về Công nghệ Sinh học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
10.Nguyễn Xuân Dũng, Phạm Luận (1987), Dung dịch đệm, sách tra cứu pha
chế dung dịch, tập 1, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
11.Nguyễn Xuân Dũng, Phạm Luận (1987), Dung dịch dùng cho phân tích và dung dịch thông dụng dùng cho phòng thí nghiệm, sách tra cứu pha chế dung dịch, tập 2, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
12.Vũ Cao Đàm (2005), Phương pháp luận nghiên cứu khoa học, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
13.Nguyễn Thị Ngọc Giao, Đỗ Thị Hồng Cẩm, Tạ Thị Kim Thanh, Phan Thanh Thủy, Đỗ Thị Là (1994), “Nghiên cứu thủy phân một số loại protein của hệ enzyme hỗn hợp trong nhựa đu đủ, so sánh với hệ protease khác”, Báo cáo tóm tắt Hội nghị khoa học toàn quốc về Công nghệ Sinh học và Hóa học phục vụ sản xuất và đời sống, Hà Nội.
14.Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thị Kim (1996), “Nghiên cứu và ứng dụng enzyme
từ hạt nảy mầm và từ vi sinh vật vào chế biến bột dinh dưỡng” Tuyển tập
công trình khoa học, Hội nghị khoa học trường Đại học Bách Khoa Hà Nội lần thứ 18 tháng 10/1996.
15.Vũ Thị Hoan (2004), Nghiên cứu tách chiết và thử nghiệm sản xuất chế
phẩm hương vị tôm, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
16.Đặng Văn Hợp (2000), Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất protease
từ Aspergillus oryzae A4 và ứng dụng vào sản xuất nước mắm, Luận án tiến
sĩ kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
17.P.P. Kơroxtelev, Chuẩn bị dung dịch cho phân tích hóa học, Nxb Khoa học
Kỹ thuật.
18.Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp,
Hà Nội.
19.Trần Thị Luyến (1994), Nghiên cứu quy luật biến đổi nitơ, amino acid và nâng cao hiệu suất thu đạm trong sản xuất nước mắm, Luận án phó tiến sĩ khoa học Kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
20.Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2004), Sản xuất các
chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, Nxb Nông nghiệp.
21.Trần Thị Luyến (2001), Những phản ứng cơ bản và các biến đổi của thực
phẩm trong quá trình chế biến và bảo quản, Trường Đại học Thủy sản, Nha
Trang.
22.Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2005), Chế biến Rong Biển, Nxb Nông nghiệp.
23.Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Cường (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh.
24.Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự (1995), “Sử dụng enzyme trong việc tận dụng
phế liệu thủy sản có giá trị kinh tế thấp”, Các công trình nghiên cứu ứng
dụng Công nghệ Sinh học và công nghệ thực phẩm, giai đoạn 1986-1995, Viện Công nghệ Thực phẩm.
25.Lê Đức Mạnh, Ngô Tiến Hiển, Lê Đức Ngọc (1995), “Nghiên cứu thu nhận
và bảo quản enzyme protease từ các chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn
B. subtilis”, Các công trình nghiên cứu ứng dụng Công nghệ Sinh học và công nghệ thực phẩm, giai đoạn 1986-1995, Viện Công nghệ Thực phẩm.
26.Ngô Đăng Nghĩa (2000), Tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất Alginate
từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng trong một số lĩnh vực sản xuất, Luận án
tiến sĩ Khoa học Kỹ thuật.
27.Đỗ Văn Ninh (2004), Nghiên cứu quy trình thủy phân Protein bằng protease
nội tạng cá, mực và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ Protein thực
phẩm, Luận án Tiến sĩ, Đại học Thủy sản, Nha Trang.
28.Đỗ Minh Phụng, Đặng Văn Hợp (1997), Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm
thủy sản, Đại học Thủy sản, Nha Trang.
29.Đỗ Thị Thanh Thu (2001), Hóa sinh ứng dụng, Nxb Đại học Quốc gia, Tp Hồ Chí Minh.
30.Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004), Nghiên cứu chiết rút enzym từ đầu tôm bạc
nghệ và ứng dụng thủy phân thịt cá mối, Luận văn thạc sỹ, Đại học Thủy
sản, Nha Trang.
31.Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (2003), Hóa học thực phẩm, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
32.Lê Ngọc Tú (Chủ biên), La Ăn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Biên,(2000), Hóa sinh
học công nghiệp, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
33.Hà Duyên Tư (1996), Quản lý và kiểm tra chất lượng thực phẩm, Đại học Bách Khoa, Hà Nội.
34.Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tiến Thắng (1996), Những kiến thức cơ bản về công nghệ sinh học, Nxb Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh.
35.Nguyễn Thị Thu Vân (2004), Phân tích định lượng, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh.
Tài liệu nước ngoài:
36.Abeles, F.B., R.P. Bosshart, L.E. Forrence, and W.H. Habig. (1970), Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves. Plant Physiol. 47: 129_134.
37.Boller, T., A. Gehri, F. Mauch, and U. Vogeli. (1983), Chitinase in bean leaves:induction by ethylene, purification, properties, and possible function. Planta 157: 22_31.
38.Broglie, K. E., J. J. Gaynor, and R. M. Broglie. (1986), Ethylene-regulated gene expression: molecular cloning of the genes encoding an endochitinase from Phaseolus vulgaris. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 6820_6824.
39.Chang, C. T., H. F. Lo, C. J. Wu, and H. Y. Sung. (1992), Purification and properties of chitinase from cabbage. Biochem. Int. 28: 707_715.
40.Collinge, D.B., K.M. Kragh, J.D. Mikkelsen, K.K. Nielsen, U. Rasmussen, and K. Vad. (1993), Plant chitinases. Plant J. 3: 31_40.