Từ enzyme DC, sử dụng các tác nhân kết tủa enzyme để thu được chế phẩm enzyme kỹ thuật (CPE). Các tác nhân kết tủa bao gồm ethanol, aceton và amonium
Tỉ lệ (ml/g)
0,5/1; 0,75/1; 1/1; …..; 1,75/1; 2/1
Thời gian (phút) 0; 5; 10; ….; 35; 40
sunfat. Mỗi loại tác nhân kết tủa có khả năng kết tủa và ảnh hưởng đến hoạt tính CPE khác nhau. Để lựa chọn được tác nhân kết tủa thích hợp, tiến hành kết tủa enzyme bằng các tác nhân trên ở cùng nồng độ 70%, thời gian kết tủa trong 1 giờ ở nhiệt độ 50C. Ly tâm thu kết tủa có chứa enzyme (CPE). Xác định hoạt độ của CPE để đánh giá, lựa chọn tác nhân kết tủa thích hợp của chitinase [2], [6], [8], [15], [24].
Sau khi lựa chọn được tác nhân kết tủa thích hợp, tiến hành tối ưu hóa các điều kiện kết tủa: nồng độ tác nhân kết tủa, thời gian kết tủa qua đó đánh giá được ảnh hưởng của điều kiện kết tủa đến hoạt độ của CPE thu được. Đối với nồng độ tác nhân kết tủa, bố trí thí nghiệm kết tủa enzyme với các nồng độ tác nhân kết tủa khác nhau: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%. Xác định hoạt độ CPE thu được ở các nồng độ khác nhau, qua đó lựa chọn nồng độ tác nhân kết tủa thích hợp. Để xác định ảnh hưởng của thời gian kết tủa ảnh hưởng đến hoạt độ của CPE, bố trí thí nghiệm với thời gian kết tủa enzyme khác nhau: 15; 30; 45; 60; 75; 90; 105; 120 phút. Xác định hoạt độ CPE ở các thời gian kết tủa khác nhau từ đó lựa chọn thời gian kết tủa thích hợp. Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như sau:
Dịch chiết chứa enzyme
Kết tủa enzyme bằng các tác nhân
Aceton 70% Sunfat amonium 70% Ethanol 70%
Tối ưu nồng độ và thời gian kết tủa
Xác định hoạt độ CPE chitinase Nồng độ tác nhân kết tủa (%)
50%; 55%; 60%; …..; 75%; 80%
Thời gian kết tủa (phút) 15; 30; 45; ……; 105; 120
Chọn tác nhân và điều kiện kết tủa thích hợp
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme chitinase và xác định lượng đường glucosamine theo phương pháp Nelson-Morgan.
* Xác định hoạt tính enzyme chitinase.
Nguyên tắc:Hoạt tính của enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm N-acetyl-β-D-glucosamine của quá trình phân giải chitin. * Xác định lượng đường glucosamine theo phương pháp Nelson-Morgan.
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự hình thành các chất dẫn xuất pyrrole khi glucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrole này sẽ phản ứng màu với thuốc thử Ehrlich. Những lượng glucosamine tương đương sẽ cho ra cường độ màu tương đương trong cùng điều kiện. Dịch thủy phân được phản ứng với thuốc thử acetyl aceton và thuốc thử Ehrlich, dung dịch sẽ chuyển sang màu đỏ. Tiến hành so màu dung dịch ở bước sóng 512 nm. Tiến hành xây dựng đường chuẩn glucosamine. Nồng độ glucosamine trong dịch thủy phân sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn glucosamine [23].
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ chitinase DC và CPE, độ bền nhiệt của enzyme. chitinase DC và CPE, độ bền nhiệt của enzyme.
* Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ chitinase DC, CPE
Nhiệt độ là thông số rất quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase DC và CPE. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chitinase bằng cách cho chitinase xúc tác phản ứng thủy phân với cơ chất là chitin ở các nhiệt độ khác nhau. Theo tài liệu tham khảo và các thí nghiệm biên đã chọn được khoảng nhiệt độ thích hợp để tiến hành nghiên cứu. Thí nghiệm thực hiện với các nhiệt độ: 100C, 150C, 200C, …., 650C, 700C để xác định nhiệt độ thích hợp của chitinase. Sau thời gian thủy phân 2 giờ, gia nhiệt đến nhiệt độ sôi để dừng phản ứng. Tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo phương pháp Elson – Morgan từ đó xác định nhiệt độ thích hợp của enzyme chitinase.
Tương tự như nhiệt độ, xác định pH thích hợp của chitinase bằng cách cho chitinase xúc tác phản ứng thủy phân với cơ chất là huyền phù chitin ở nhiệt độ xác định. Theo tài liệu tham khảo và các thí nghiệm biên đã chọn được khoảng pH thích
hợp để tiến hành nghiên cứu. Thí nghiệm thực hiện với pH môi trường khác nhau, pH = 2,0; 2,5; 3,0; ….; 7,0; 7,5; 8,0. Sau thời gian thủy phân 2 giờ, gia nhiệt đến nhiệt độ sôi để dừng phản ứng. Tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được
theo phương pháp Elson – Morgan từ đó xác định pH thích hợp của enzyme
chitinase. Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính chitinase DC và CPE. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ enzyme
Thủy phân ở các nhiệt độ (0C) Thủy phân ở các pH
Xác định hoạt độ chitinase
Chọn nhiệt độ, pH thích hợp của enzyme DC và CPE
* Xác định độ bền nhiệt của chitinase DC và CPE.
Xác định độ bền nhiệt của enzyme bằng cách giữ enzyme ở nhiệt độ 450C,
500C trong các khoảng thời gian khác nhau: 0, 10, 20, …, 60 phút. Nhanh chóng làm lạnh về nhiệt độ thường. Tiến hành xác định hoạt độ enzyme của các mẫu thí nghiệm. Từ đó đánh giá về tính bền nhiệt của chitinase.
2.2.8. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân chitin thích hợp bằng CPE chitinase.
Để có thể xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng CPE chitinase, các thông số cần khảo sát là: nhiệt độ, pH, nồng độ CPE chitinase, nồng độ chitin, các chất phòng thối vv. Từ đó đánh giá được các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình thuỷ phân chitin bằng CPE chitinase.
*Chuẩn bị chitin:
Nhiệt độ (0C)
10; 15; 20; 25; 30; …..; 55; 60; 65; 70
pH
Do chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính của enzyme chitinase cần phải huyền phù hóa chitin, làm tăng khả năng tiếp xúc của enzyme chitinase với chitin trong quá trình thủy phân. Huyền phù chitin thu được đem bảo quản lạnh sử dụng cho nghiên cứu. Chuẩn bị huyền phù chitin được trình bày trong phụ lục 2.
Huyền phù chitin có các chỉ tiêu chất lượng như sau: Màu sắc: trắng đục
Trạng thái: dạng bột nhão, mịn Độ ẩm: 73%
* Xác định ảnh hưởng một số yếu tố đến quá trình thủy phân chitin bằng enzyme chitinase
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân chitin như nồng độ CPE, nhiệt độ, pH môi trường thuỷ phân, nồng độ cơ chất, các chất phòng thối vv…Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của chúng đến khả năng xúc tác của enzyme trong phản ứng thuỷ phân, bố trí thí nghiệm như sau: Đối với nồng độ CPE chitinase, tiến hành thủy phân chitin với nồng độ CPE trong dịch thủy phân khác nhau: 0,0%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%. Quá trình thủy phân tiến hành ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6,…14,16 giờ, lấy mẫu ra xác định lượng olygo-chitin thu được, từ đó lựa chọn được nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân, thí nghiệm được thực hiện với các nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C. Sau các khoảng thời gian thủy phân: 0, 2, 4, 6 …14, 16 giờ, tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo
phương pháp Elson – Morgan. Đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt
tính của chitinase. Chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Yếu tố pH cũng là thông số quan trọng ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của chitinase trong quá trình thuỷ phân.Tiến hành thủy phân chitin bằng CPE với nồng độ đã chọn, ở nhiệt độ thích hợp. Quá trình thủy phân ở các pH môi trường khác nhau: pH = 4,5; 5; 5,5; 6 được điều chỉnh bằng acid acetic, NaOH. Sau thời gian thủy phân, tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo phương pháp Elson – Morgan. Chọn pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
Để xác định mức độ ảnh hưởng của chitin đến hoạt tính chitinase, tiến hành thí nghiệm với nồng độ chitin trong dịch thuỷ phân khác nhau: 0,5%; 0,75%; 1%; 1,25%; 1,5%. Sau quá trình thủy phân, xác định lượng olygo-chitin tạo thành từ đó chọn nồng độ chitin thích hợp.
Để xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng xúc tác của chitinase cũng như hiệu suất của quá trình thuỷ phân. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
2.2.9. Các phương pháp phân tích.
- Xây dựng đường chuẩn glucosamine qua đó định lượng glucosamine theo phương pháp của Elson – Morgan (phụ lục 2).
- Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu (phụ lục 2). - Xác định độ ẩm: Phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi (phụ lục 4).
Nồng độ chitin (%) 0,5%; 0,75%; 1%; 1,25%; 1,5% Nồng độ CPE (%) 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% pH môi trường 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 Nồng độ Ethanol (%) 0; 2; 4; 6; 8% Nhiệt độ (C0) 20; 25; 30; 35 Thuỷ phân chitin bằng
chitinase
Xác định lượng olygo-chitin
Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất thuỷ phân
- Xác định độ tan: Phương pháp xác định hàm lượng các chất không tan (phụ lục 4).
2.2.10. Các thiết bị thí nghiệm đã sử dụng.
- Cân điện tử Satorious (Đức) loại 120g độ chính xác 10-4(g). - Máy ly tâm lạnh : Rotina (Đức), vmax= 15.000 (vòng/phút). - Máy so màu.
- Tủ sấy. - Máy đo pH. - Máy ổn nhiệt - Tủ lạnh.
- Các loại hóa chất với độ tinh sạch sử dụng trong phân tích.
2.2.11. Phương pháp xử lý số liệu.
- Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thông số thí nghiệm được thực hiện 3 lần, mỗi lần 3 mẫu. Kết quả thí nghiệm được xác định là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1.XÁC ĐỊNH LOẠI KHOAI LANG SỬ DỤNG CHIẾT CHITINASE. 3.1.1. Kết quả chọn giống khoai lang sử dụng chiết rút chitinase.
Để lựa chọn được giống khoai lang thích hợp cho nghiên cứu chiết rút chitinase, tiến hành nghiên cứu ba giống khoai lang được trồng phổ biến tại miền Trung của Việt Nam: giống khoai VX-73, giống 143 và giống HL4. Các giống khoai lang và bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của giống đến hoạt độ chitinase được thể hiện trong phần tổng quan và phương pháp nghiên cứu. Từ kết quả thu được có thể lựa chọn được giống khoai thích hợp phục vụ cho nghiên cứu của đề tài.Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.1.
100.00 80.92 71.71 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00
Giống 143 Giống VX-73 Giống HL4
Giống khoai H o ạ t đ ộ t ư ơ n g đ ố i (% s o v ớ i c ự c đ ạ i)
Hình 3.1. Ảnh hưởng của giống khoai lang khác nhau đến hoạt độ chitinase. (Hoạt độ chitinase DC cực đại là: 152 Units/ml, thể hiện ở bảng 1.1- phụ lục 1)
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính chitinase DC thu được từ các giống khoai lang khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Hoạt tính chitinase DC thu được từ giống khoai 143 có hoạt độ cao nhất, đạt cực đại 152 Units/ml. Hoạt tính enzyme DC của giống 143 cao hơn 1,24 và 1,39 lần so với hai giống còn lại là VX-73 (123 Units/ml) và HL4 (109 Units/ml). Có thể giải thích sự khác nhau về hoạt tính chitinase thu từ các giống khoai như sau: Theo các kết quả nghiên cứu của Bol et al., (1990); Bowles, (1990); collinge et al., (1993); Dixon và Harrison, (1990); Linthorst, (1991); Broglie et al., (1991); Punja và Zhang, (1993) cho rằng chitinase
tồn tại trong thực vật đóng vai trò là chất kháng thể. Mà mỗi giống khoai lang đều có khả năng kháng bệnh khác nhau nên có sự khác nhau về hoạt tính enzyme chitinase giữa các giống khoai. Các tác giả cũng cho rằng, phần lớn protein tồn tại trong cây khoai là chitinase. Xét về các giống sử dụng cho nghiên cứu, giống khoai 143 là giống có thân, lá phát triển sớm, cuống lá dài, lá to bản, năng suất chất xanh cao có thể từ đó mà hàm lượng protein trong lá cao hơn so với giống VX-73 và giống HL4 có kích thước lá nhỏ, cuống lá ngắn nên chitinase thu được có hoạt tính cao hơn.
Từ kết quả nghiên cứu được cho thấy để chọn giống khoai lang có hoạt tính chitinase cao nên chọn những giống có năng suất chất xanh cao, những giống trồng chủ yếu để thu lá. Vì vậy giống khoai lang 143 được chọn làm đối tượng sử dụng chiết rút chitinase và nghiên cứu về các tính chất của enzyme chitinase trong đề tài.
3.1.2. Kết quả nghiên cứu hoạt độ chitinase từ các phần của cây khoai lang
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng các phần khác nhau của cây đến hoạt độ chitinase thu được. Từ giống khoai đã chọn, tiến hành chiết rút chitinase từ các phần khác nhau của cây: lá khoai, cuống lá và dây khoai. Xác định hoạt độ chitinase thu được. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2.
100.00 39.63 9.76 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00
Lá khoai lang Cuống lá Dây khoai lang
Các phần của cây H o ạ t đ ộ t ư ơ n g đ ố i (% s o v ớ i c ự c đ ạ i)
Hình 3.2. Ảnh hưởng các phần khác nhau của cây đến hoạt độ chitinase. (Hoạt độ chitinase DC cực đại là: 164 Units/ml, được thể hiện ở bảng 1.2- phụ lục 1)
Kết quả nghiên cứu cho thấy: hoạt độ chitinase DC từ các phần của cây rất khác nhau. Hoạt độ chitinase DC thu được từ lá cao nhất (164 Units/ml) và cao hơn
2,52 lần so với chitinase DC từ cuống lá, cao hơn 10,25 lần so với chitinase trong dây khoai. Kết quả nghiên cứu trên cũng tương tự như kết quả nghiên cứu về chitinase từ khoai lang của Wen-Chi Hou, Ying-Chou Chen và Yaw-Huei Lin. Theo kết quả đã công bố, hoạt độ chitinase thu được từ lá cao nhất đạt 240 (Units/ml) cao hơn 1,5 lần so với hoạt độ chitinase thu được từ lá khoai nghiên cứu trong đề tài (164 Units /ml). Kết quả thu được thấp hơn có thể do đặc điểm về giống khoai, điều kiện khí hậu, địa hình, đất trồng khác nhau cũng ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase thu được.
Hoạt tính chitinase giảm dần theo thứ tự từ lá khoai đến cuống lá và dây khoai. Có thể do protein tồn tại trong lá nhiều hơn, mà phần lớn protein tồn tại trong cây khoai là chitinase. Đồng thời chitinase có vai trò là chất kháng thể, lá khoai là nơi rất dễ bị tác động bởi các đối tượng gây hại như sâu bệnh, các loại côn trùng ăn lá do vậy lượng chitinase ở vị trí này cao hơn so với cuống lá và dây khoai. Từ đó có sự khác nhau về hoạt tính chitinase thu được từ các phần khác nhau của cây. Kết quả nghiên cứu trên đã xác định lá khoai là phần thích hợp sử dụng để chiết rút enzyme chitinase phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trong đề tài.
3.1.3. Kết quả nghiên cứu tình trạng tổn thương của cây ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase.
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng tình trạng tổn thương của cây đến hoạt tính chitinase thu được. Cây khoai bị tổn thương có thể do nhiều nguyên nhân: do bị sâu bệnh trên lá, tổn thương do tác động cơ học bên ngoài, do bị côn trùng cắn vv... Chiết rút enzyme từ lá khoai, cuống của lá không bị tổn thương và lá khoai, cuống của lá đã bị tổn thương. Kết quả thu được có thể đánh giá tình trạng tổn thương của cây ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase và vai trò kháng bệnh của chitinase trong cây. Kết quả thí nghiệm thể hiện trên hình 3.3.
46 77.08 26.56 100.00 42.71 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 Lá không tổn thương Cuống của lá không tổn thương Lá bị tổn thương Cuống của lá bị tổn thương Tình trạng tổn thương của cây