Nghiên cứu ảnh hưởng của giống khoai đến hoạt độ enzyme chitinase thu được. Chọn lá khoai lang từ ba giống khoai lang bao gồm: giống VX-37, giống khoai 143, giống HL4. Lá khoai lang được thu hái sau khi trồng 1 - 2 tháng. Chitinase được chiết bằng nước cất với tỷ lệ nước cất/nguyên liệu là 1/1. Quá trình chiết ở điều kiện nhiệt độ 5 – 100C, thời gian chiết 15 phút. Dịch chiết được lọc qua vải thu dịch lọc. Dịch lọc được ly tâm lạnh 50C, tốc độ 9000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Kết thúc ly tâm thu được dịch và loại bỏ bã. Xác định hoạt độ chitinase trong DC của các mẫu. So sánh và đánh giá kết quả thu được, chọn giống khoai lang thích hợp sử dụng cho đề tài nghiên cứu. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Giống VX-37 Giống 143 Giống HL4
Xay nhỏ
Chiết enzyme bằng nước cất
Lọc qua vải lọc
Ly tâm
Dịch chiết
Chọn giống khoai lang thích hợp
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tình trạng tổn thương của cây, vị trí chiết rút đến hoạt độ chitinase.
Tiến hành xác định ảnh hưởng tình trạng tổn thương của cây như từ lá, cuống của lá bị tổn thương và lá, cuống của lá không bị tổn thương đến hoạt độ chitinase thu được trên giống khoai lang đã được chọn. Xác định hoạt độ của chitinase thu được. So sánh, phân tích và đánh giá kết quả thu được.
Tiến hành nghiên cứu xác định ảnh hưởng các phần (các bộ phận khác nhau) của cây khoai lang bao gồm lá, cuống lá và dây khoai lang đến hoạt độ chitinase thu được. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Tình trạng tổn thương của cây Các bộ phận của cây
Xay nhỏ
Chiết enzyme bằng nước cất
Lọc qua vải lọc
Ly tâm
Dịch chiết
Xác định hoạt độ chitinase DC
Xác định ảnh hưởng tình trạng cây và các phần của cây ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase thu được
Lá bị tổn thương
Cuống của lá bị tổn thương
Lá không bị tổn thương
Cuống của lá không bị tổn thương
Lá khoai
Cuống lá
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định phương pháp tách chiết enzyme chitinase
Để có thể tách chiết và thu nhận enzyme chitinase hiệu quả, bố trí thí nghiệm để xác định dung môi thích hợp sử dụng chiết enzyme. Sau khi đã lựa chọn được dung môi chiết thích hợp, tiến hành tối ưu tỉ lệ dung môi chiết/nguyên liệu và thời gian chiết.
Xác định sự ảnh hưởng của dung môi chiết tới hoạt độ của enzyme, tiến hành thí nghiệm để chọn dung môi chiết enzyme thích hợp như sau: Lá khoai lang tươi được xay nhỏ, enzyme trong lá được chiết bằng các dung môi khác nhau: nước cất, dung dịch muối sinh lý và đệm acetat pH = 5. Tiến hành chiết trong điều kiện nhiệt độ 5 – 100C. Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu = 1/1, thời gian chiết 15 phút. Dịch chiết được lọc thô qua vải lọc để tách bã. Tiến hành ly tâm lạnh dịch lọc ở nhiệt độ 50C với tốc độ 9000 vòng/ phút. Loại bỏ phần bã để thu phần dịch có chứa enzyme. Xác định hoạt độ enzyme DC thu được từ đó lựa chọn dung môi chiết thích hợp.
Sau khi lựa chọn được dung môi thích hợp cho quá trình chiết rút enzyme, tiến hành tối ưu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chiết. Đối với thông số tỷ lệ dung môi chiết/nguyên liệu, bố trí thí nghiệm với các tỷ lệ khác nhau: 0,5/1; 0,75/1; 1/1; 1,25/1; 1,5/1; 1,75; 2/1. Xác định hoạt độ enzyme DC ở các tỷ lệ khác nhau qua đó lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết/nguyên liệu thích hợp.
Thí nghiệm được bố trí để xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ enzyme chitinase DC. Thí nghiệm với các thời gian chiết khác nhau: 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40 phút. Xác định hoạt độ enzyme DC thu được với thời gian khác nhau từ đó lựa chọn được thời gian chiết thích hợp [2], [6], [8], [15], [24].
Để nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết thích hợp và tối ưu quá trình chiết, thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:
Lá khoai lang
Xay nhỏ
Chiết enzyme
Chọn loại dung môi thích hợp
Nước cất DD muối sinh lý Đệm acetat pH=5
Tối ưu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chiết
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu Thời gian chiết
Lọc qua vải lọc Loại bã
Ly tâm
Dịch chiết enzyme
Xác định hoạt độ enzyme DC
Lựa chọn dung môi, tỉ lệ và thời gian chiết
2.2.5. Bố trí thí nghiệm thu nhận chế phẩm enzyme (CPE)
Từ enzyme DC, sử dụng các tác nhân kết tủa enzyme để thu được chế phẩm enzyme kỹ thuật (CPE). Các tác nhân kết tủa bao gồm ethanol, aceton và amonium
Tỉ lệ (ml/g)
0,5/1; 0,75/1; 1/1; …..; 1,75/1; 2/1
Thời gian (phút) 0; 5; 10; ….; 35; 40
sunfat. Mỗi loại tác nhân kết tủa có khả năng kết tủa và ảnh hưởng đến hoạt tính CPE khác nhau. Để lựa chọn được tác nhân kết tủa thích hợp, tiến hành kết tủa enzyme bằng các tác nhân trên ở cùng nồng độ 70%, thời gian kết tủa trong 1 giờ ở nhiệt độ 50C. Ly tâm thu kết tủa có chứa enzyme (CPE). Xác định hoạt độ của CPE để đánh giá, lựa chọn tác nhân kết tủa thích hợp của chitinase [2], [6], [8], [15], [24].
Sau khi lựa chọn được tác nhân kết tủa thích hợp, tiến hành tối ưu hóa các điều kiện kết tủa: nồng độ tác nhân kết tủa, thời gian kết tủa qua đó đánh giá được ảnh hưởng của điều kiện kết tủa đến hoạt độ của CPE thu được. Đối với nồng độ tác nhân kết tủa, bố trí thí nghiệm kết tủa enzyme với các nồng độ tác nhân kết tủa khác nhau: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%. Xác định hoạt độ CPE thu được ở các nồng độ khác nhau, qua đó lựa chọn nồng độ tác nhân kết tủa thích hợp. Để xác định ảnh hưởng của thời gian kết tủa ảnh hưởng đến hoạt độ của CPE, bố trí thí nghiệm với thời gian kết tủa enzyme khác nhau: 15; 30; 45; 60; 75; 90; 105; 120 phút. Xác định hoạt độ CPE ở các thời gian kết tủa khác nhau từ đó lựa chọn thời gian kết tủa thích hợp. Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như sau:
Dịch chiết chứa enzyme
Kết tủa enzyme bằng các tác nhân
Aceton 70% Sunfat amonium 70% Ethanol 70%
Tối ưu nồng độ và thời gian kết tủa
Xác định hoạt độ CPE chitinase Nồng độ tác nhân kết tủa (%)
50%; 55%; 60%; …..; 75%; 80%
Thời gian kết tủa (phút) 15; 30; 45; ……; 105; 120
Chọn tác nhân và điều kiện kết tủa thích hợp
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme chitinase và xác định lượng đường glucosamine theo phương pháp Nelson-Morgan.
* Xác định hoạt tính enzyme chitinase.
Nguyên tắc:Hoạt tính của enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm N-acetyl-β-D-glucosamine của quá trình phân giải chitin. * Xác định lượng đường glucosamine theo phương pháp Nelson-Morgan.
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự hình thành các chất dẫn xuất pyrrole khi glucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrole này sẽ phản ứng màu với thuốc thử Ehrlich. Những lượng glucosamine tương đương sẽ cho ra cường độ màu tương đương trong cùng điều kiện. Dịch thủy phân được phản ứng với thuốc thử acetyl aceton và thuốc thử Ehrlich, dung dịch sẽ chuyển sang màu đỏ. Tiến hành so màu dung dịch ở bước sóng 512 nm. Tiến hành xây dựng đường chuẩn glucosamine. Nồng độ glucosamine trong dịch thủy phân sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn glucosamine [23].
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ chitinase DC và CPE, độ bền nhiệt của enzyme. chitinase DC và CPE, độ bền nhiệt của enzyme.
* Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ chitinase DC, CPE
Nhiệt độ là thông số rất quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase DC và CPE. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chitinase bằng cách cho chitinase xúc tác phản ứng thủy phân với cơ chất là chitin ở các nhiệt độ khác nhau. Theo tài liệu tham khảo và các thí nghiệm biên đã chọn được khoảng nhiệt độ thích hợp để tiến hành nghiên cứu. Thí nghiệm thực hiện với các nhiệt độ: 100C, 150C, 200C, …., 650C, 700C để xác định nhiệt độ thích hợp của chitinase. Sau thời gian thủy phân 2 giờ, gia nhiệt đến nhiệt độ sôi để dừng phản ứng. Tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo phương pháp Elson – Morgan từ đó xác định nhiệt độ thích hợp của enzyme chitinase.
Tương tự như nhiệt độ, xác định pH thích hợp của chitinase bằng cách cho chitinase xúc tác phản ứng thủy phân với cơ chất là huyền phù chitin ở nhiệt độ xác định. Theo tài liệu tham khảo và các thí nghiệm biên đã chọn được khoảng pH thích
hợp để tiến hành nghiên cứu. Thí nghiệm thực hiện với pH môi trường khác nhau, pH = 2,0; 2,5; 3,0; ….; 7,0; 7,5; 8,0. Sau thời gian thủy phân 2 giờ, gia nhiệt đến nhiệt độ sôi để dừng phản ứng. Tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được
theo phương pháp Elson – Morgan từ đó xác định pH thích hợp của enzyme
chitinase. Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính chitinase DC và CPE. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ enzyme
Thủy phân ở các nhiệt độ (0C) Thủy phân ở các pH
Xác định hoạt độ chitinase
Chọn nhiệt độ, pH thích hợp của enzyme DC và CPE
* Xác định độ bền nhiệt của chitinase DC và CPE.
Xác định độ bền nhiệt của enzyme bằng cách giữ enzyme ở nhiệt độ 450C,
500C trong các khoảng thời gian khác nhau: 0, 10, 20, …, 60 phút. Nhanh chóng làm lạnh về nhiệt độ thường. Tiến hành xác định hoạt độ enzyme của các mẫu thí nghiệm. Từ đó đánh giá về tính bền nhiệt của chitinase.
2.2.8. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân chitin thích hợp bằng CPE chitinase.
Để có thể xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng CPE chitinase, các thông số cần khảo sát là: nhiệt độ, pH, nồng độ CPE chitinase, nồng độ chitin, các chất phòng thối vv. Từ đó đánh giá được các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình thuỷ phân chitin bằng CPE chitinase.
*Chuẩn bị chitin:
Nhiệt độ (0C)
10; 15; 20; 25; 30; …..; 55; 60; 65; 70
pH
Do chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính của enzyme chitinase cần phải huyền phù hóa chitin, làm tăng khả năng tiếp xúc của enzyme chitinase với chitin trong quá trình thủy phân. Huyền phù chitin thu được đem bảo quản lạnh sử dụng cho nghiên cứu. Chuẩn bị huyền phù chitin được trình bày trong phụ lục 2.
Huyền phù chitin có các chỉ tiêu chất lượng như sau: Màu sắc: trắng đục
Trạng thái: dạng bột nhão, mịn Độ ẩm: 73%
* Xác định ảnh hưởng một số yếu tố đến quá trình thủy phân chitin bằng enzyme chitinase
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân chitin như nồng độ CPE, nhiệt độ, pH môi trường thuỷ phân, nồng độ cơ chất, các chất phòng thối vv…Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của chúng đến khả năng xúc tác của enzyme trong phản ứng thuỷ phân, bố trí thí nghiệm như sau: Đối với nồng độ CPE chitinase, tiến hành thủy phân chitin với nồng độ CPE trong dịch thủy phân khác nhau: 0,0%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%. Quá trình thủy phân tiến hành ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6,…14,16 giờ, lấy mẫu ra xác định lượng olygo-chitin thu được, từ đó lựa chọn được nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân, thí nghiệm được thực hiện với các nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C. Sau các khoảng thời gian thủy phân: 0, 2, 4, 6 …14, 16 giờ, tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo
phương pháp Elson – Morgan. Đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt
tính của chitinase. Chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Yếu tố pH cũng là thông số quan trọng ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của chitinase trong quá trình thuỷ phân.Tiến hành thủy phân chitin bằng CPE với nồng độ đã chọn, ở nhiệt độ thích hợp. Quá trình thủy phân ở các pH môi trường khác nhau: pH = 4,5; 5; 5,5; 6 được điều chỉnh bằng acid acetic, NaOH. Sau thời gian thủy phân, tiến hành xác định lượng olygo-chitin thu được theo phương pháp Elson – Morgan. Chọn pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
Để xác định mức độ ảnh hưởng của chitin đến hoạt tính chitinase, tiến hành thí nghiệm với nồng độ chitin trong dịch thuỷ phân khác nhau: 0,5%; 0,75%; 1%; 1,25%; 1,5%. Sau quá trình thủy phân, xác định lượng olygo-chitin tạo thành từ đó chọn nồng độ chitin thích hợp.
Để xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng xúc tác của chitinase cũng như hiệu suất của quá trình thuỷ phân. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
2.2.9. Các phương pháp phân tích.
- Xây dựng đường chuẩn glucosamine qua đó định lượng glucosamine theo phương pháp của Elson – Morgan (phụ lục 2).
- Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu (phụ lục 2). - Xác định độ ẩm: Phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi (phụ lục 4).
Nồng độ chitin (%) 0,5%; 0,75%; 1%; 1,25%; 1,5% Nồng độ CPE (%) 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% pH môi trường 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 Nồng độ Ethanol (%) 0; 2; 4; 6; 8% Nhiệt độ (C0) 20; 25; 30; 35 Thuỷ phân chitin bằng
chitinase
Xác định lượng olygo-chitin
Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất thuỷ phân
- Xác định độ tan: Phương pháp xác định hàm lượng các chất không tan (phụ lục 4).
2.2.10. Các thiết bị thí nghiệm đã sử dụng.
- Cân điện tử Satorious (Đức) loại 120g độ chính xác 10-4(g). - Máy ly tâm lạnh : Rotina (Đức), vmax= 15.000 (vòng/phút). - Máy so màu.
- Tủ sấy. - Máy đo pH. - Máy ổn nhiệt - Tủ lạnh.
- Các loại hóa chất với độ tinh sạch sử dụng trong phân tích.
2.2.11. Phương pháp xử lý số liệu.
- Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thông số thí nghiệm được thực hiện 3 lần, mỗi lần 3 mẫu. Kết quả thí nghiệm được xác định là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1.XÁC ĐỊNH LOẠI KHOAI LANG SỬ DỤNG CHIẾT CHITINASE. 3.1.1. Kết quả chọn giống khoai lang sử dụng chiết rút chitinase.
Để lựa chọn được giống khoai lang thích hợp cho nghiên cứu chiết rút chitinase, tiến hành nghiên cứu ba giống khoai lang được trồng phổ biến tại miền Trung của Việt Nam: giống khoai VX-73, giống 143 và giống HL4. Các giống khoai lang và bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của giống đến hoạt độ chitinase được thể hiện trong phần tổng quan và phương pháp nghiên cứu. Từ kết quả thu được có thể lựa chọn được giống khoai thích hợp phục vụ cho nghiên cứu của đề tài.Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.1.
100.00 80.92 71.71 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00
Giống 143 Giống VX-73 Giống HL4
Giống khoai H o ạ t đ ộ t ư ơ n g đ ố i (% s o v ớ i c ự c đ ạ i)
Hình 3.1. Ảnh hưởng của giống khoai lang khác nhau đến hoạt độ chitinase. (Hoạt độ chitinase DC cực đại là: 152 Units/ml, thể hiện ở bảng 1.1- phụ lục 1)
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính chitinase DC thu được từ các giống khoai lang khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Hoạt tính chitinase DC thu được từ giống khoai 143 có hoạt độ cao nhất, đạt cực đại 152 Units/ml. Hoạt tính enzyme DC của giống 143 cao hơn 1,24 và 1,39 lần so với hai giống còn lại là VX-73 (123