Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang

Rượu là một môi trường rất phức tạp bao gồm vô số các hợp chất có thể có lợi hay có hại cho sự tăng trưởng và tồn tại của vi sinh vật. Vai trò của vi sinh vật trong sản xuất rượu vang không giới hạn ở việc chuyển đổi nước nho thành rượu, mà còn bao gồm việc chuyển đổi axit Lmalic thành axit Llactic của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men malolactic (MLF malolactic fermentation). Trong lịch sử, MLF được mô tả như một hiện tượng xảy ra thất thường và chưa hoàn toàn hiểu rõ, nhưng góp phần quan trọng để thu được sản phẩm cuối cùng. Nghiên cứu gần đây về MLF đã cho chúng ta những hiểu biết nhiều về sự phức tạp của vi khuẩn. Tuy nhiên MLF là một hiện tượng sinh học và do đó, tùy thuộc vào các môi trường, thể chất và thành phần hóa học có sẵn ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chúng. Hiện nay con người vẫn đang tiếp tục tìm tòi và khám phá những giải pháp mới về mặt công nghệ để hoàn thiện và nâng cao hiệu quả quá trình lên men malolactic bao gồm: Việc nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic cố định để chuyển hóa acid malic thành acid lactic trong các môi trường nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy liên tục kể cả việc so sánh năng lực chuyển hóa acid malic của các chủng nuôi cấy khác nhau. Vấn đề chuyển hóa axit malic bởi enzyme malolactic cố định cũng được đề cập đến rất nhiều nhưng kết quả nghiên cứu khi sử dụng enzyme cố định trên gel hầu như không thành công. Bên cạnh quá trình lên men chính được thực hiện bởi nấm men để tạo nên chất lượng cho sản phẩm thì quá trình lên men malolactic đóng một vai trò không thể thiếu trong việc làm biến đổi các thành phần hóa học, góp phần cải thiện chất lượng về mặt giá trị cảm quan của sản phẩm, mang lại cho rượu vang những hương vị đặc trưng. Việc tìm kiếm những giải pháp kỹ thuật ứng dụng cho quá trình này đã được con nguời nghiên cứu từ rất lâu mà vẫn đang được tiếp tục. nhưng đến nay, những kết quả đạt được cũng chỉ mang ý nghĩa về mặt học thuật và chưa được áp dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất. Vì vậy, việc nghiên cứu “lên men malolactic trong sản xuất rượu vang” đóng một vai trò quan trọng trong công nghệ sản xuất rượu vang.

LỜI MỞ ĐẦU

Rượu là một môi trường rất phức tạp bao gồm vô số các hợp chất có thể có lợihay có hại cho sự tăng trưởng và tồn tại của vi sinh vật Vai trò của vi sinh vậttrong sản xuất rượu vang không giới hạn ở việc chuyển đổi nước nho thành rượu,

mà còn bao gồm việc chuyển đổi axit L-malic thành axit L-lactic của vi khuẩn lactictrong quá trình lên men malolactic (MLF- malolactic fermentation) Trong lịch sử,MLF được mô tả như một hiện tượng xảy ra thất thường và chưa hoàn toàn hiểu rõ,nhưng góp phần quan trọng để thu được sản phẩm cuối cùng Nghiên cứu gần đây

về MLF đã cho chúng ta những hiểu biết nhiều về sự phức tạp của vi khuẩn Tuynhiên MLF là một hiện tượng sinh học và do đó, tùy thuộc vào các môi trường, thểchất và thành phần hóa học có sẵn ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chúng

Hiện nay con người vẫn đang tiếp tục tìm tòi và khám phá những giải phápmới về mặt công nghệ để hoàn thiện và nâng cao hiệu quả quá trình lên menmalolactic bao gồm:

- Việc nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic cố định để chuyển hóa acidmalic thành acid lactic trong các môi trường nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy liên tục kể cảviệc so sánh năng lực chuyển hóa acid malic của các chủng nuôi cấy khác nhau

- Vấn đề chuyển hóa axit malic bởi enzyme malolactic cố định cũng được đềcập đến rất nhiều nhưng kết quả nghiên cứu khi sử dụng enzyme cố định trên gelhầu như không thành công

Bên cạnh quá trình lên men chính được thực hiện bởi nấm men để tạo nên chấtlượng cho sản phẩm thì quá trình lên men malolactic đóng một vai trò không thểthiếu trong việc làm biến đổi các thành phần hóa học, góp phần cải thiện chất lượng

về mặt giá trị cảm quan của sản phẩm, mang lại cho rượu vang những hương vị đặctrưng Việc tìm kiếm những giải pháp kỹ thuật ứng dụng cho quá trình này đã đượccon nguời nghiên cứu từ rất lâu mà vẫn đang được tiếp tục nhưng đến nay, nhữngkết quả đạt được cũng chỉ mang ý nghĩa về mặt học thuật và chưa được áp dụng

rộng rãi trong thực tế sản xuất Vì vậy, việc nghiên cứu “lên men malolactic trong sản xuất rượu vang” đóng một vai trò quan trọng trong công nghệ sản xuất rượu

vang

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU1.1 Định nghĩa

Lên men malolactic là một quá trình chuyển hóa axit L-malic (chứa 2 nhómcarboxyl trong phân tử) thành axit L- hoặc D-lactic (chỉ chứa 1 nhóm carboxyl) và

carbon dioxide được thực hiện bởi các giống vi khuẩn lactic bao gồm Lactobacillus, Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus Quá trình này xảy ra bên trong tế bào được

xúc tác bởi enzyme malate carboxylase theo phản ứng sau: [10]

1.2 Vị trí của lên men malolactic trong quy trình sản xuất rượu vang

Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiếnhành sau khi lên men chính, dịch lên men thu được gọi là “vang non” được tiếnhành lắng gạn cặn và được chuyển sang bồn hay nồi lên men tiếp theo Quá trìnhnày diễn ra rất chậm nhằm để phân giải những gam đường cuối cùng, song song vớiquá trình này là vi khuẩn lactic sẽ phân giải axit malic thành axit lactic làm chovang được chuyển từ vị chua gắt sang vị chua dễ chịu, CO2 còn được tiếp tục giảiphóng nhưng có xu hướng giảm dần, hương vị rượu vang cũng được hoàn thiện.Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác nấm men lắng xuống đáy bồn hay nồilên men Tiếp theo, dịch vang được tiến hành lắng gạn tiếp vài lần, mỗi lần từ 20-30ngày để ổn định thành phần của rượu vang rồi tiếp tục đến quá trình ủ chín.[15]

1.3 Mục đích

1.3.1 Lên men malolactic giúp giảm độ chua của rượu

+ Trong phân tử axit malic có hai nhóm carboxyl, qua quá trình lên menmalolactic chuyển thành axit lactic chỉ có một nhóm carboxyl gây nên sự mất cânbằng hóa học và sự giảm axit tương ứng Mức giảm axit thu được trong rượu từMLF có thể thay đổi từ 0,1-0,3%, và độ pH có thể tăng từ 0,1-0,3.[10]

+ Một số loại axit như axit acetic là loại axít dễ bay hơi, một lượng nhỏ chúngcũng có thể làm bay hết hương vị của rượu Nếu quá nhiều, rượu sẽ chua giống vớichất aceton thậm chí là chua như dấm Nho trồng ở các vùng có khí hậu mát mẻ như

phía Bắc nước Pháp, nước Anh hay New Zealand chứa hàm lượng axit tự nhiên rấtcao lên đến 8g/l axit malic, và quá trình MLF rất có lợi để giảm độ axit Mặt khác,các loại rượu vang được sản xuất từ các loại nho trồng ở các vùng nóng ấm như ở

Úc có tính axit thấp hơn (5,0-6,5g/l), chúng sẽ giảm hơn nữa trong MLF và có thểtác động tiêu cực đến chất lượng của rượu, gây ra một hương vị không mong muốn.[15]

Như vậy, MLF được mong muốn trong sản xuất các loại rượu vang để tăng mức

độ ổn định sinh học, điều chỉnh độ pH của rượu để đạt được hương vị yêu cầu Khităng độ pH trong MLF cũng có thể ành hưởng đến màu của rượu vang

1.3.2 Lên men malolactic giúp cải thiện hương vị của rượu vang

+ Trong lên men malolactic các hợp chất 1-hexanol, ethyl acetate, ethyl lactate,diethyl succinat, butyrolactone, glycoaldehye, glyoxal, 2,3-butanediol, caprylicacid, và acid 2 – 5 hydroxycinnamic được hình thành tạo hương vị đặc trưng chorượu vang

+ Trong quá trình lên men chính các mùi không mong muốn của thực vật, mùicủa cỏ, lá cây có thể tăng lên, lên men malolactic có thể làm giảm các mùi đó vàtăng cường hương thơm của rượu vang

+ Các chủng vi khuẩn khác nhau khi lên men malolactic có thể làm tăng hoặcgiảm cường độ mùi ở một mức độ nhất định cũng như các thuộc tính hương vị củarượu vang Hương vị tạo ra bởi lên men malolactic có thể được mô tả như mùi bơ,mùi quả hạch, mùi của men

+ Cơ chế lên men malolactic của vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến hương vị củarượu vang, quá trình này có thể loại bỏ các hợp chất hương vị hiện có trong rượuvang qua quá trình trao đổi chất và hấp thụ vào thành tế bào vi khuẩn Ngoài ra cáchợp chất hương mới được hình thành từ sự trao đổi chất của đường, axit amin vànhiều chất khác điều chỉnh các ion dương của nho và các chất chuyển hóa thứ cấp

có nguồn gốc từ nấm men ít nhiều tác động đến tính chất cảm quan của sản phẩmcuối cùng

+ Tác động của lên men malolactic đến tính chất cảm quan của rượu phụ thuộcvào các đặc tính các chủng VSV, cường độ hương thơm của rượu vang

+ Nho cũng như nấm men trong quá trình lên men sơ cấp, tạo ra nhiều hương vị

và hợp chất thơm Các hợp chất này có các phân tử đường bao quanh, làm chochúng không có mùi và không đóng góp cho hương vị đặc trưng của rượu vang.Nhờ quá trình lên men malolactic, vi khuẩn lactic sinh ra hệ enzym glycosidasesxúc tác phản ứng thủy phân giải phóng các phân tử đường ra khỏi các hợp chấtthơm làm tăng hương vị của rượu vang.[2]

1.3.3 Làm ổn định về mặt vi sinh cho rượu thành phẩm

Về mặt bảo quản, quá trình lên men malolactic góp phần tạo nên tính ổn định

về chất lượng cảm quan và vi sinh Điều này có nghĩa là sự hiện diện của quá trìnhlên men malolactic có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác Sự

ức chế này được giải thích bởi các nguyên nhân sau:

+ Một số vi khuẩn không mong muốn có khả năng sử dụng axit malic làmnguồn chất dinh dưỡng Vì thế, việc giảm hàm lượng axit malic trong dịch lên men

sẽ mang lại kết quả tốt để giảm thiểu rủi ro về mặt vi sinh

+ Vi khuẩn tham gia lên men malolactic sinh trưởng trước trong môi trường

ph thấp và chúng sử dụng các chất dinh dưỡng (axit amin, bazơ nitơ, vitamin) làmcho môi trường ngày càng nghèo những chất này Từ đó giới hạn được sự sinhtrưởng và phát triển của những vi khuẩn khác

+ Một số vi khuẩn lên men malolactic có thể sản sinh ra độc tố (bacteriocin)

có thể ức chế sinh trưởng của những vi khuẩn có hại khác mà không ảnh hưởng gì

về mặt cảm quan và sức khỏe người sử dụng.[2]

CHƯƠNG 2:HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN

MALOLACTIC

2.1 Phân loại

Sản xuất rượu vang là một quá trình phức tạp liên quan đến nấm men và vikhuẩn Chúng có tự nhiên trên vỏ quả nho nhưng cũng được tìm thấy trong cácthùng, bồn chứa và thiết bị được sử dụng trong quá trình sản xuất rượu Nghiên cứu

đã tập trung vào hình thái của vi khuẩn lactic (LAB- Lactic acid bacterial) trongrượu vang; sự tham gia và phân bố của chúng trong sản xuất rượu vang, và trongquá trình lên men Các LAB từ nho hoặc rượu thuộc về hai chủng đại diện cho ba

chi Lactobacillaceae được đại diện bởi các chi Lactobacillus, và Strepto-coccaceae được đại diện bởi Oenococcus và Pediococcus.[13]

Bảng 2.1 Phân loại vi khuẩn tham gia lên men malolactic

(tế bào tròn) Đồng hình Pediococcus damnosus Pediococcus

pentosaceus

Dị hình Leuconostoc oenos

(Oenococcus oeni)

Hình 2.1 Chu kỳ sinh trưởng của vi khuẩn acid lactic trong rượu vang trong quá

trình sản xuất rượu và lưu trữ

2.2 Đặc điểm sinh lý

2.2.1 Lactobacilli

- Vi khuẩn Gram dương

- Thuộc loại vi khuẩn hiếu khí

- Tế bào không di động

- Có dạng hình que dài hoặc que ngắn

- Xuất hiện như các tế bào độc lập trong từng cặp hoặc trong từng chuỗi của cáckích thước khác nhau

- Vi khuẩn thuộc chi này là vi khuẩn kị khí tùy tiện và yêu cầu môi trường lênmen giàu đường

Chúng được chia thành hai nhóm liên quan đến quá trình chuyển hóa hexose củachúng:

+ Dị hình nghiêm ngặt: Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii.

+ Dị hình tùy ý: Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum. [1,10]

Hình 2.2 Vi khuẩn Lactobacilli

2.2.2 Pediococcus.

- Là những cầu khuẩn gram dương

- Tế bào không di động

- Có dạng hình cầu.

- Vi khuẩn yếm khí tùy tiện và yêu cầu môi trường dinh dưỡng giàu các yếu tốtăng trưởng và lên men đường cho sự phát triển của chúng

- Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng là 25-300C với giá trị pH=6

- Chúng lên men đồng hình, có nghĩa là tất cả glucose sẽ chuyển hóa thành axitlactic và chúng không lên men pentose. [1, 10]

Hình 2.3 Vi khuẩn Pediococcus 2.2.3 Oenococcus

- Vi khuẩn gram dương

- Không di động

- Oenococcus là loài yếm khí tùy tiện, ưa chua

- Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng là giữa 18 và 300C với giá trịpH=4,8

- Đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung cà chua, nước trái cây hoặcnước ép nho, và sự tăng trưởng của nó không bị ức chế khi có mặt ethanol ở nồng

độ 10%

Lên men malolactic bởi Oenococcuc Oeni là quá trình decarboxyl hóa L-malat

thành L-lactat và CO2, làm giảm độ axit của vang Quá trình lên men malolactic làquá trình xảy ra sau giai đoạn lên men rượu, góp phần biến đổi và cải thiện các tính

chất cảm quan của rượu vang Trong giai đoạn này, Oenococcuc Oeni tạo ra các

hợp chất thơm như diacetyl, acetoin, acetone, các este góp phần tạo hương cho sản

phẩm Tác động của vi khuẩn Oenococcuc Oeni đến các hợp chất phenol còn cải

thiện màu sắc và vị của rượu vang Sự có mặt của quá trình lên men malolactic còn

hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm bởi các chất kháng khuẩn của Oenococcuc Oeni

[1, 9]

Hình 2.4 Vi khuẩn Oenococcus

Hình 2.5 Kiểm soát quá trình lên men malolactic

2.3 Sự phát triển của vi khuẩn lactic trong sản xuất rượu vang

Thu hoạch Lên men

chính

Lên men malolactic

Dự trữ

Sự phát triển của vi sinh vật trong rượu vang theo một thứ tự cụ thể.

+ Trong thời gian thu hoạch, vi khuẩn và nấm men xâm chiếm nho LAB có mặt

trên bề mặt quả nho và phải ở mức rất thấp, chúng được đại diện bởi L plantarum,

L casei, L mesenteroides và Oenococcus oeni.

+ Trong những ngày đầu tiên của quá trình lên men chúng nhân lên nhưng sốlượng hạn chế, trong khoảng 104 tế bào/mL Theo tiến trình lên men rượu, các giátrị này giảm xuống 102 tế bào/mL: khả năg ức chế của ethanol và độ pH thấp có thểgiải thích sự sụt giảm số lượng tế bào Trong giai đoạn MLF xảy ra chậm, các tếbào còn sống sót bắt đầu nhân lên và có thể đạt được 106-108 tế bào/mL Điều này

hoàn thành khi vi khuẩn đạt đến một giai đoạn tĩnh Oenococcus oeni là loài chính

có mặt trong rượu sau khi lên men chính và trong MLF Sự phát triển của nó xuấthiện tự nhiên nhưng nó có thể được tăng lên bằng cách tăng nhiệt độ rượu vang 20-

25 ◦C và trong điều kiện SO2 thấp (ít hơn 15-20 mg / L) Sau khi kết thúc MLF, các

vi khuẩn khác chẳng hạn như Lactobacillus và Pediococcus có thể tiếp quản Các

giai đoạn này chồng chéo lên nhau, tạo ra sự tương tác giữa loại khác nhau của các

vi khuẩn, cũng như giữa các vi khuẩn và nấm men Trong điều kiện tiêu chuẩn,LAB vẫn còn tồn tại trong rượu vang trong quá trình lưu trữ, không có xu hướngphát triển thêm và suy giảm chậm trong một thời gian dài Carre (1982) quan sátthấy sự sụt giảm nhỏ 107 đến 105 tế bào/ml sau 6 tháng lưu trữ Ngay cả khi những

tế bào này không nhân lên, chúng có thể chuyển hóa một số chất và sản xuất cáchợp chất không mong muốn mà có thể làm giảm chất lượng rượu vang, đặc biệt là

do tác động của các chủng Pediococcus và Lactobacillus.

Rượu vang là môi trường nghèo chất dinh dưỡng và những điều kiện bất lợi cóthể làm MLF gặp khó khăn Nhiệt độ, độ pH, rượu, SO2 và các chất dinh dưỡng sẵn

có tất cả các ảnh hưởng đến phát triển và hoạt động vi khuẩn Nhiệt độ cao hay thấp

sẽ ức chế các vi khuẩn malolactic Chậm MLF có thể là do những điều kiện bất lợitrong rượu vang, hoặc bởi các vi khuẩn malolactic không thể nhân rộng và đạt được

số lượng tối thiểu cần thiết cho quá trình này Trong một số trường hợp, vài tuầnhoặc vài tháng là cần thiết để có được số lượng tế bào thích hợp có khả năng làmsuy thoái axit malic có mặt trong rượu vang đỏ.[4,10]

2.4 Sự tương tác giữa vi khuẩn và nấm men

Các mối quan hệ giữa LAB và nấm men đóng một vai trò quan trọng trongquá trình lên men và sản phẩm cuối cùng Trong hệ sinh thái phức tạp, các vi sinhvật có thể cạnh tranh với các chất tương tự hoặc thúc đẩy tăng trưởng và rượu vang

là sản phẩm của những tương tác phức tạp giữa nấm men và vi khuẩn Tuy nhiên,kết quả đang gây tranh cãi Một số tác giả cho rằng những tương tác này là ức chế,trong khi những người khác xét chúng là kích thích

Patynowski và cộng sự (2002) cho thấy nấm men tạo một yếu tố ức chếkhông rõ (có thể là một chất chuyển hóa độc hại) Những kết quả này có thể giảithích sự đối kháng giữa nấm men và vi khuẩn malolactic, nấm men được biết để sảnxuất các hợp chất trong quá trình lên men rượu như ethanol, SO2, axit béo chuỗitrung bình và kháng khuẩn protein / peptide Bản chất và số lượng các chuỗi axitamin và các phân tử khác phát hành bởi nấm men là khác nhau tùy thuộc vào kỹthuật sản xuất rượu vang và chủng nấm men.[12]

Ngược lại với sự ức chế, trong các nghiên cứu khác các mối quan hệ đã đượchiển thị là dương tính với vi khuẩn vì nấm men có thể thúc đẩy sự phát triển củachúng và kích thích MLF Challinor và Rose (1954) quan sát 13 mối tương quan

giữa nấm men và Lactobacillus spp Và trong số đó nấm men xuất hiện để các vi

sinh vật hoạt động, tổng hợp các chất còn thiếu như vitamin, axit amin hoặc purine,

quan trọng cho sự tăng trưởng của Lactobacillus này Kennes và cộng sự (1991) cho thấy, khi Lactobacillus plantarum và Saccharomyces cerevisiae được phát triển trong tế bào phối hợp trong một môi trường glucose-citrate trong điều kiện acid, S cerevisiae làm giảm axit lactic tạo bởi lactobacillus và do đó ổn định pH, khuyến khích sự lên men của citrate bởi Lactobacillus.[6,16]

CHƯƠNG 3: QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC3.1 Thành phần hóa học của dịch lên men sau quá trình lên men chính

Quá trình lên men phụ hay lên men malolactic thường được thực hiện ở giaiđoạn tàng trữ trong sản xuất vang đỏ

Bảng 3.1 Thành phần của dịch nho và rượu vang thông thường [2]

Hợp chất % trong dịch nho % trong rượu

(ethanol, glycerols và rượu bậc cao)

Acid hữu cơ

(tartaric, malic và một ít lactic,

(các flavonoid như là các chất màu

cùng với các nonflavonoid như là

cinnamic acid và vanillin)

Các hợp chất chứa nitơ (protein,

amino acid, humin,

0,10,90,50,3

0,2-100,0

86,00,311,20,60,50,50,3

0,1-

100,0Thành phần của dịch nho sau lên men chính bao gồm: một số hợp chất chiết cónguồn gốc từ nho nguyên liệu như các loại đường pentose và hexose chưa lên menhoàn toàn, các axit hữu cơ (axit tartaric, malic) và các hợp chất polyphenol(anthocyanin và các axit phenolic) và các sản phẩm trao đổi chất của nấm men Đây

là các hợp chất do nấm men tạo ra trong quá trình trao đổi chất và được chúng tiếtvào môi trường lên men Nhiều sản phẩm trao đổi chất của nấm men góp phần tạo

ra hương và vị cho vang thành phẩm

Trong lên men ethanol, có hai sản phẩm được nấm men tạo ra với hàm lượngcao nhất là ethylic và CO2 Ngoài ra còn có các sản phẩm phụ và các sản phẩmtrung gian từ quá trình dị hóa gluxit, trao đổi protein và lipid Các sản phẩm thườnggặp là các axit hữu cơ (axit cuccinic, axit pyruvic), các ancohol (ethanol, polyol vàrượ bậc cao), các hợp chất carbonyl (aldehyde, diacetyl, acetoin), các ester(ethylacetate, isoamylacetatate ), các axit béo mạch trung bình (hexenoic,decanoic, dodecanoic ) [9]

3.1.1 Các axit hữu cơ

3.1.1.1 Các axit hữu cơ không bay hơi

* Axit tartaric

Có hai loại axit chính thường có mặt trong dịch nho là axit tartaric và axitmalic Hàm lượng của chúng có thể lên đến 90% hàm lượng các axit có mặt trongdịch nho và chúng tạo nên vị chua đặc trưng cho dịch nho Tỉ lệ hàm lượng của hailoại axit này còn phụ thuộc vào giống nho, điều kiện trồng trọt, khí hậu và thời điểmthu hoach nho Axit tartaric đóng vai trò quan trọng trong việc tạo môi trường pHthấp cho dịch nho và vang Hàm lượng của chúng hầu nhưu không thay đổi trongsuốt quá trình lên men do nấm men không sử dụng được axit tartaric Do vậy, axitnày rất cần thiết cho vang để đảm bảo độ bền vi sinh và ổn định độ chua cho sảnphẩm [2]

* Axit malic

Cùng với axit tartaric, axit malic cũng góp phần làm giảm pH môi trườngnước nho và tạo nên vị chua gắt cho vang Hàm lượng axit malic trong dịch nhokhoảng 3-4,5 g/L Hầu như nấm men đều có thể sử dụng axit malic làm cơ chất

mức độ chuyển hóa axit malic còn tùy thuộc vào từng loài Ví dụ, Saccharomyces cerevisiae có thể phân giải được 3-45% lượng axit malic có trong dịch nho trong khi Shizosaccharomyces pombe và Shizosaccharomyces malidevorans có thể

chuyển hóa gần như hoàn toàn thành ethanol và CO2 Axit malic có vị chua gắt rấtkhó chịu, do đó, để nâng cao giá trị cảm quan của rượu vang, người ta tiến hành loạiaxit malic trong dịch lên men [2]

*Axit lactic

Axit lactic thường xuyên có mặt trong quá trình lên men rượu vang Hàmlượng của chúng có thể lên đến 2,5 g/l đối với vang trắng và 4,5 g/l đối với vang đỏ.Axit lactic tồn tại trong rượu vang ở 2 dạng L(+) và D(-).[2]

Rất ítRất ít

0,17-0,40g/L2.60-5,7g/L0,006-3,13g/L0,48-1,22g/L0,07-4,89g/l0,30-1,44g/L

3.1.1.2 Các axit hữu cơ bay hơi

Các axit bay hơi thường gặp ở vang là các axit hữu cơ mạch ngắn như: axitacetic, propionic, isobutyric, butyric isovaleric, capronic, caprilic, valeric Hàmlượng các axit này khoảng 500-1000 mg/L (chiếm 10-15% hàm lượng axit tổngtrong vang) Trong đó chủ yếu là axit acetic, chiếm 90% hàm lượng các axit bayhơi Một số nấm men có thể sử dụng axit acetic làm cơ chất dinh dưỡng và như vậytrong quá trình lên men, hàm lượng axit bay hơi này sẽ giảm dần [2]

Vang đỏ có hàm lượng glycerol cao hơn vang trắng Sự khác nhau về hàm lượngchất này trong vang còn phụ thuộc vào điều kiện công nghệ cụ thể ( nhiệt độ lênmen, mức độ sulfite hóa ) và đặc biệt là phụ thuộc vào từng chủng nấm men sửdụng.

Ảnh hưởng quan trọng nhất của glycerol đối với sản xuất rượu vang là chất nàylàm tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của nấm men trong điều kiện lên men cónồng độ đường cao Ngoài ra ở hàm lượng cao, glycerol có thể làm tăng vị ngọt và

Các loại rượu bậc cao thường có mặt trong vang là propanol, isobutanol, butanol, 2-methyl butanol, 3-methyl butanol, n-hexanol, rượu B-phenylethylic hàm lượng các rượu này có trong vang phụ thuộc vào điều kiện lênmen dịch nho Cụ thể:

n-+ Trong điều kiện lên men có O2 sẽ tạo ra các rượu bậc cao có hàm lượng lớnhơn ở điều kiện lên men kỵ khí hoặc lên men dưới áp lực CO2

+ Lên men dưới áp suất CO2 sẽ giảm được hàm lượng rượu bậc cao, đặc biệt

là 2 loại rượu isobutyric và amylic, nâng cao được hàm lượng của B-phenylethylic.Điều này có tác dụng cải thiện chất lượng rượu vang, vì rượu isobutyric và amylicảnh hưởng xấu đến mùi vị của vang và cả 2 loại rượu này lại chiếm tới 90% khốilượng tất cả rượu bậc cao có trong vang

Việc bố sung các muối amoni vào môi trường nghèo nitơ có thể giảm hàm lượngcác rượu bậc cao đi 1,4-1,7 lần Khi thêm α-alanine, acid α-amylobutyric, leucine,isoleucine và valine vào môi trường thì sẽ thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các rượubậc cao có cấu trúc tương ứng với các axit amin đó, ngoài ra còn tạo ra hàng loạtcác rượu bậc cao khác.[2]

3.1.3 Các hợp chất carbonyl

3.1.3.1 Các andehyde

Các andehyde hay gặp ở vang là aldehyde acetic, propionic, butyric, valeric, ởnồng độ cao các andehyde có mùi rất gắt khi pha loãng, trừ andehyde acetic, cácandehyde còn lại có mùi dễ chịu của các mùi hương trái cây tự nhiên

Acetaldehyde là thành phần cacbonyl được tạo thành tương đối phổ biến đượctìm thấy trong rượu vang với hàm lượng khoảng 10-75 mg/L Ngưỡng cảm nhậncủa nó là 100 mg/L Sự có mặt của acetaldehyde là yếu tố hoàn toàn không mongmuốn trong sản xuất rượu vang vì chất này tạo thành từ phản ứng oxi hóa ethanol,

do vậy chúng có thể làm tiêu hao một lượng ethanol sinh ra bởi nấm men trong điềukiện thích hợp (khi có mặt của oxi không khí) Sự hiện diện của aldehyde còn giúpnhà sản xuất đánh giá được mức độ oxi hóa của dịch lên men và đưa ra giải phápkhắc phục khi cần thiết

Mặt khác, do trong cấu trúc phân tử có nhóm C=O nên acetaldehyde có thể làmgiảm hàm lượng SO2 tự do trong dịch lên men bằng cách tạo liên kết với chất này,

từ đó làm giảm tác dụng ức chế của chất này lên vi sinh vật Bên cạnh đó,acetaldehyde còn có khả năng chống lại tác động của SO2 lên các chất màu nên tạođiều kiện thuận lợi cho các phản ứng ngưng tụ polyphenol trong vang như tanin,catechin, anthocyanin tạo thành các phức chất màu bền vững.[2]

3.1.3.2 Acetoin và diacetyl

Các nghiên cứu cho thấy hai chất này điếu có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượngrượu vang mặc dù số lượng chúng tạo ra trong vang không lớn lắm: acetoin từ 2-84mg/L và diacetyl từ 0,1-1,8 mg/L Hàm lượng acetoin và diacetyl tạo thành còn phụthuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ đường ban đầu và chủng nấm men sử dụng.nếu nồng độ đường càng cao (2,5-10,0 /100 ml) thì diacetyl sẽ tích tụ càng nhiều

Hình 3.1 Đường chuyển hóa acid citric thành diacetyl, acetoin và

2,3-buthanediol

Sự có mặt của chúng trong vang có hai khả năng: ảnh hưởng lớn đến hương vịvang và những biến đổi hóa sinh Diacetyl ở nông độ thấp làm cho vang có mùi đặctrưng, nhưng ở hàm lượng lớn hơn 1mg/l sẽ làm cho vang có mùi vị chua oxi hóa

Sự tạo thành diacetyl và acetoin trong lên men còn có mối quan hệ tương tác vớihàm lượng sulfite hóa trong dịch quả Nếu dịch quả không được sunfite hóa thì cóthể dẫn đến sự tạo thành acetoin có hàm lượng tối đa vượt quá 2 lần so với dịch quảđược sunfite hóa.[2]

3.1.4 Các ester

Các ester được tạo thành trong quá trình lên men rượu vang với một lượng đáng

kể và được xem như là những hợp chất quan trọng trong việc hình thành hương vịđặc trưng cho vang

Trong số các ester được tạo thành từ nấm men, ethylcetate là chất có hàm lượngcao và vượt trội hơn những ester còn lại cũng như những hợp chất hương khác.Hàm lượng của ethylacetate có trong vang khoảng 22,5-63,5 mg/L Nó góp phầntạo nên hương vị trái cây tự nhiên cho vang Hàm lượng của chúng còn tùy thuộc

trường có thế oxi hóa càng cao thì lượng acetic tạo thành càng nhiều acid acetic sẽphản ứng với ethanol do nấm men tạo ra ethylacetate Tuy nhiên mức độ oxi hóacủa môi trường quá cao thì cũng có thể làm giảm hiệu suất sinh tổng hợp ethanolcủa nấm men Vì vậy, ta cần đảm bảo điều kiện lên men được kiểm soát ở mức oxihóa vừa phải.

Trong lên men vang tích tụ cả các ester có độ sôi thấp lẫn ester có độ sôi cao(ester ethyl của các acid caprotanic, caprilatic, caprinic, isoamulcaproic và các acidbéo linolevic, linolenovic ) số lượng các ester này phụ thuộc vào điều kiện lênmen hiếu khí hay kị khí và lên men dưới áp lực CO2 Vang non được lên men dưới

áp lực CO2 sẽ làm cho hàm lượng các ester có độ sôi cao nhiều hơn.[Lương ĐứcPhẩm, 2005]

Bảng 3.3 Thành phần các hợp chất mùi có trong vang nho

3.1.5 Lipid

Lipid trong vang do có hai nguồn gốc: từ quả và từ sự trao đổi chất của nấmmen Loại quả có chứa chất béo thì sau lên men chính, các chất béo này ít bị biếnđổi sẽ được chuyển vào trong vang non Trên bề mặt quả nho thường có phủ mộtlớp sáp này có thể rơi vào dịch quả Thành phần chính của chất sáp này là ester giữaaxit linolevic và các rượu Trong vang, người ta tìm thấy hàm lượng acid béo cónhiều hơn trong dịch quả do kết quả của quá trình sinh tổng hợp chất béo của nấmmen Thật vậy, trong dịch nước nho chưa lên men hàm lượng lipid tổng là 50mg/Lcòn trong dịch lên men chính hàm lượng lipid tới 73-113 mg/L.[2]

3.1.6 Các hợp chất chứa lưu huỳnh

3.1.6.1 Sulfuahydryl

Các hợp chất có mang nhóm –SH (sulfuahydryl) sinh ra trong quá trình trao đổichất của nấm men và được nấm men tiết vào môi trường trong quá trình lên men.Các hợp chất này bao gồm các chất như glutation và cysteine được tiết vào môitrường sẽ làm giảm thế oxi hóa – khử (chỉ số này rất quan trọng trong quá trình lênmen và tàng trữ rượu vang) Sự thay đổi thế oxi hóa – khử (Eh) trong quá trình lênmen phụ thuộc vào tốc độ sinh sản của nấm men và mức độ tăng sinh khối Eh bắtđầu giảm ở thời điểm nấm men sinh sản, khi nhu cầu oxi là tối đa Người ta nhậnthấy rằng, trong dịch lên men được sulfite hóa thế oxi hóa – khử giảm khá mạnh.Các hợp chất –SH thuộc loại các chất có tính khử cao Sự có mặt của những chấtnày góp phần vào việc bảo vệ, trước hết là các cấu tử hương khỏi bị tác dụng củacác tác nhân oxi hóa Hàm lượng các chất khử này không giống nhau ở các loại quảnguyên liệu và ở các loại vang lên men trong điều kiện thường cũng như vang lênmen trong điều kiện dưới áp lực CO2 vang non thu nhận bằng phương pháp lênmen dưới áp lực CO2 thì hàm lượng các hợp chất sulfuahydryl tăng lên khoảng 245mg/L, trong đó hàn lượng glutation khử là 98 mg/L nhưng trong lên men bìnhthường các hàm lượng của các hợp chất trên tương ứng chỉ đạt 113 và 6 mg/L.[2]

3.1.6.2 Sulfuahydro (H 2 S)

Hợp chất này có khả năng tạo mùi khó chịu cho vang Nếu hàm lượng của nóvượt quá 0,005 mg/L thì có thể làm giảm chất lượng cảm quan của vang Sự sinh

men trong lên men ethanol tùy thuộc vào từng chủng nấm men sử dụng và nhiệt độmôi trường.

Nấm men có thể chuyển hóa S và SO2 thành H2S Cysteine, acid aspartic,glutamic, glycerin, histidine, omithine, serine, threonine kích thích tạo thành H2S.các chất methionine, acid pantothenic, vitamin B6 lại kìm hãm sự tích tụ H2S Sựtạo thành H2S của mỗi chủng nấm men phụ thuộc vào đặc tính di truyền có thểdùng hỗn hợp các chủng nấm men có khả năng và không có khả năng khử sulfatetrong lên men sẽ làm giảm nồng độ H2S được tạo thành trong môi trường.[2]

3.1.6.3 Sulfur dioxide (SO 2 )

Trong quá trình lên men sẽ sử dụng một lượng nhỏ sulfate trong môi trường vàkhử chất này thành sulfite Một số nấm men có khả năng sinh tổng hợp sulfurdioxide từ α-cysteine hoặc glutation Các chủng nấm men thuộc loài saccharomycesbayanus có thể tạo ra sulfur dioxide nhiều hơn các chủng thuộc loài saccharomyces

cerevisiae Hàm lượng sulfate trong dịch lên men càng cao thì sulfur dioxide tạothành càng nhiều.[2]