rượu vang, nho và nấm men dùng trong sản xuất rượu vang

luận văn về rượu vang, nho và nấm men dùng trong sản xuất rượu vang

Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin cảm ơn các thầy cô trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM đã tận tình dạy bảo, xây dựng những kiến thức cơ bản cần thiết cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt và thầy Lê Văn Việt Mẫn vì sự giúp đỡ và hướng dẫn tận tình mà thầy cô đã dành cho em trong suốt quá trình làm luận văn. Mặc dù gặp nhiều khó khăn trong thời gian vừa qua, nhưng sự động viên, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình đã giúp em hoàn thành tốt nhiệm vụ được giao. Em xin chân thành cảm ơn tất cả những người đã giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này. Tp Hồ Chí Minh, tháng 1/2008 Nguyễn Đức Ninh Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC Chương 1: GIỚI THIỆU 1 Thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp 1 Tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu vang sau quá trình lên men .1 Khả năng tái sử dụng nấm men rất thấp .1 Khó tự động hóa quá trình lên men .1 Tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men .1 Ổn đònh hoạt tính của nấm men. Các chất mang cố đònh có tác dụng như là một tác nhân bảo vệ tế bào chống lại những ảnh hưởng bất lợi của pH, nhiệt độ, dung môi và ngay cả các kim loại nặng .1 Dễ dàng tách nấm men ra khỏi sản phẩm sau quá trình lên men, do đó làm giảm chi phí về thiết bò và năng lượng .1 Có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần .1 Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tối ưu hóa và tự động hóa quá trình lên men 1 Động học quá trình sinh trưởng của nấm men 2 Động học quá trình sử dụng cơ chất: đường khử, nitơ amin và nitơ vô vơ. .2 Động học quá trình hình thành sản phẩm: do thời gian hạn hẹp và chưa có điều kiện về kinh phí nên trong phạm vi bài luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày sản phẩm quan trọng nhất của quá trình lên men là cồn mà chưa trình bày các hợp chất hương. Và chúng tôi cũng khảo sát thêm sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong suốt quá trình lên men chính .2 Chương 2: TỔNG QUAN .3 2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG 3 2.1.1 Rượu vang .3 Nhóm rượu vang không có gas 3 Nhóm rượu vang có gas .3 2.1.2 Nho 4 Hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, cần thiết cho sự phát triển của nấm men vang .4 Hàm lượng acid khá cao, đủ để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn trong và sau quá trình lên men 4 Hàm lượng đường đủ để tạo ra hàm lượng cồn cao, nhờ đó ức chế được các vi sinh vật gây hư hỏng trong rượu vang .4 Các hợp chất hương với thành phần và lượng thích hợp, vì thế rượu vang tạo thành có tính chất cảm quan tốt 4 Đường 5 Nitơ 5 Acid hữu cơ .5 SO2 7 Tannin .7 Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acid ellagic. 7 i Luận văn tốt nghiệp Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin và gallocatechin) và flavan-3,4-diol 7 2.1.3 Nấm men .8 Thứ nhất gọi là non-Saccharomyces (NS – là những loài nấm men không thuộc giống Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng với nhiều loại vi sinh vật khác. Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khi nồng độ cồn cao hơn 6%v/v (ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể phát triển trong môi trường có nồng độ cồn lên đến 12%). Trước đây, nấm men NS được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một số loài nấm men NS có lợi cho chất lượng rượu vang, giúp tăng cường hương vò của rượu vang [23, 41, 42, 45, 149, 166, 207]. 8 Nhóm khác góp phần vào hương vò rượu vang, cũng là nhân tố chính của quá trình lên men cồn là các loài thuộc giống Saccharomyces. Saccharomyces có khả năng chòu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và acid hữu cơ tăng và sự cạn kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000). Như vậy, mặc dù có nhiều giống và loài nấm men trong dòch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu là loài Saccharomyces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá trình chuyển hóa sinh học quan trọng trong lên men vang. Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được gọi là “nấm men vang” [58, 85, 92, 149, 166, 199]. .9 Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chòu đựng đối với SO2, các loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp .10 Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi và ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang .10 Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giống các chủng nấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chòu đựng đối với SO2 và làm tăng chất lượng rượu vang [178]. 10 Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces bayanus var. uvarum để kết hợp ưu điểm của 2 loài này, làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH cao) [175] .10 2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN .11 2.2.1 Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố đònh tế bào .11 2. Sử dụng màng membrane vi xốp 13 3. Sử dụng màng vi bao .13 4. Đơn giản, dễ thực hiện [113, 185, 189] 13 5. Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối [185, 138] 13 6. Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố đònh và chất mang lớn hơn so với các kỹ thuật khác [138] .13 7. Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vò thể tích chất mang cao hơn so với canh trường vi sinh vật tự do [138] .13 8. Chất mang có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại thực khuẩn hoặc tế bào ngoại lại cũng như những điều kiện gây stress [138] 13 9. Đơn giản, dễ thực hiện 13 10. Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối .13 ii Luận văn tốt nghiệp Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ bò tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch [113, 40] .13 11. Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel [39] 13 12. Tế bào trên bề mặt dễ thoát ra khỏi mạng gel và phát triển trong môi trường như là các tế bào tự do [113, 39] 13 13. Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ bò tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch .13 14. Các vật liệu cellulose: DEAE-cellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa đã tách lignine, … [113, 138] 14 15. Các vật liệu vô cơ: polygorskite, montmorilonite, hydromica, sứ xốp, thủy tinh xốp, vòng Raschig, silicate, hợp chất titanium, … [113, 138] 14 16. Polymer tự nhiên [113]: 14 17. Polysaccharide: alginates, κ-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid 14 18. Polymer khác: gelatin, collagen và polyvinyl alcohol .14 19. Polymer tổng hợp: polyacrylamide, polyurethane và polyvinyl chloride [138] 14 2.2.2 Các chất mang cố đònh nấm men trong sản xuất rượu vang 14 2.2.3 Cố đònh nấm men trong gel alginate 20 Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối lượng chất khô 20 Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất .20 Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau .20 Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau 20 Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau 20 Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài .21 Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong 22 Ưu điểm .22 Quá trình cố đònh dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209] .22 Điều kiện cố đònh ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất. Do đó, các tế bào cố đònh không bò mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211] .22 Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học [176] .22 Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169, 176, 192].22 Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm [8, 27] 23 Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205] 23 Nhược điểm và cách khắc phục 23 Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]: .23 Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dòch) như phosphate, citrate và lactate và các chất không tạo gel (non-gelling) như là các ion sodium và magnesium. Sự có mặt của các ion này trong dung dòch sẽ làm cho các hạt bò phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn đònh và phá vỡ cấu trúc hạt gel. Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên men các chất ổn đònh gel như là CaCl2, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp để ổn đònh độ bền gel. Hoặc cũng iii Luận văn tốt nghiệp có thể làm cứng gel bằng cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) và các loại vật liệu composite (colloidal silica) [10, 102, 103, 144, 193, 194] .23 Không bền hóa học trong dung dòch điện phân và dung dòch có pH cao. Để khắc phục điều này, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và có nhiều phương pháp được đưa ra: tạo liên kết của hạt gel với glutaraldehyde (Takata và cộng sự, 1977), với polycations (Birnbaum và cộng sự, 1981) và sấy khô hạt gel (Klein và Wagner, 1978; Burns và cộng sự, 1985). Những phương pháp này đều có thể cải thiện độ bền trong dung dòch điện phân, nhưng rõ ràng là chúng rất phức tạp và tốn nhiều thời gian. Một số tác giả đã đưa ra phương pháp khác là dùng các ion Ba2+ và Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyền thống. Các ion này có ái lực mạnh hơn đối với alginate, vì thế hạt gel barium và strontium alginate bền hơn trong dung dòch điện phân so với hạt gel calcium alginate. Tuy nhiên, các ion này vẫn không được ứng dụng rộng rãi vì độc tính của nó đối với nấm men và với môi trường [144, 183, 192, 193, 194]. 23 nh hưởng của khối lượng phân tử 24 nh hưởng của tỷ lệ G/M .24 Tốc độ lên men có xu hướng tăng, nhưng không đáng kể [101] 24 Độ bền gel giảm, vì các ion hóa trò 2 như là calcium, barium, strontium được ưu tiên liên kết vào block G hơn là block M và block MG. Do đó alginate có hàm lượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững trong một thời gian dài. Trong suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại alginate này sẽ không bò phồng nở hay co rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt hơn. Thêm vào đó, alginate có hàm lượng G cao sẽ cản trở sự sinh trưởng của tế bào nấm men sau khi cố đònh. Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xốp hơn và dễ bò rã ra hơn so với các gel giàu G [101, 116, 144, 173, 181, 192, 193]. Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và kết luận rằng gel alginate giàu G thích hợp để cố đònh nấm men hơn vì gel này ít gây cản trở đến khả năng khuếch tán của glucose và có độ bền cơ học cao hơn [210] 24 nh hưởng của nồng độ alginate 25 nh hưởng của pH tạo gel 25 nh hưởng của nhiệt độ tạo gel .25 nh hưởng của mật độ tế bào trong hạt .25 nh hưởng của tỷ lệ S/V 25 2.2.4 Một số tính chất của nấm men cố đònh 26 Banyopadhyay và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men cố đònh trên thủy tinh xốp (Controled pore glass) bằng phương pháp hấp phụ. Khả năng sinh trưởng của nấm men tự do và cố đònh được đánh giá gián tiếp thông qua tốc độ hấp thu O2 và tốc độ sinh CO2. Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm men cố đònh có hiện tượng giảm khả năng hấp thu O2 và sinh CO2 so với nấm men tự do [16] 26 Doran và cộng sự (1985) cũng tiến hành khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae cố đònh trên gelatin. Kết quả thực nghiệm thu được tương tự như kết quả của Bandyopadhyay và cộng sự (1982). Ngoài ra tác giả còn nhận thấy rằng tốc độ sinh trưởng và tỷ lệ nảy chồi của nấm men cố đònh trên gelatin đều thấp hơn so với nấm men tự do [56] 26 iv Luận văn tốt nghiệp Hệ lên men sử dụng nấm men cố đònh là một hệ phản ứng dò thể, trong đó, các chất dinh dưỡng có xu hướng tập trung trên bề mặt chất mang, vì vậy nấm men hấp phụ trên bề mặt chất mang có điều kiện tiếp xúc với nồng độ chất dinh dưỡng cao hơn so với trong môi trường đồng thể. Chính sự thay đổi áp lực thẩm thấu một cách đột ngột gây mất cân bằng trao đổi chất qua màng tế bào, làm ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tế bào [16]. 26 Chồi có thể được hình thành ở bất kỳ vò trí nào trên bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, tuy nhiên phổ biến nhất là chồi sẽ mọc ở các cực ellipsoide của tế bào nấm men lưỡng bội. Vì vậy khi 1 cực của tế bào nấm men gắn vào chất mang sẽ vô tình làm mất đi sự hình thành của một chồi mới [56] .26 Wada và cộng sự (1980) nhận thấy rằng nấm men cố đònh sinh trưởng và giữ ổn đònh ở khoảng 5,4.109 tế bào/mL gel [201] .26 Melzoch và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sự phát triển và hình thái của nấm men cố đònh trong gel Ca-alginate. Các tế bào nấm men cố đònh sau khi được hoạt hóa, nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, số lượng tế bào sẽ tăng lên rất nhanh (khoảng 1010 tế bào/mL gel) và sau đó hầu như giữ nguyên không đổi [142] .26 Banyopadhyay và cộng sự (1982) giả thuyết rằng chính sự mất cân bằng về trao đổi chất làm cho các chồi của nấm men sau khi mọc thành nhanh chóng bò tách ra khỏi tế bào mẹ, làm cho hình thái tế bào nấm men bò thay đổi [16] 27 Melzoch và cộng sự (1994) khảo sát sự thay đổi hình thái của tế bào nấm men cố đònh trong gel được tiến hành bằng cách quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Kết quả khảo sát cho thấy tế bào nấm men cố đònh có hình dạng và kích thước không đồng đều. Điều đó cho thấy sự phát triển của các tế bào bò nhốt trong hạt gel phụ thuộc vào độ xốp và cấu trúc của mạng gel cũng như khả năng chiếm chỗ trống trong hạt gel của tế bào nấm men. Trong chất mang, các tế bào nấm men có xu hướng kết tụ lại với nhau [142] 27 Thay đổi thành phần lipid của màng membrane [96, 138] .27 Thay đổi hàm lượng các chất trao đổi trung gian như là fructose-1,6-diphosphate, glucsoe-6-phosphate và 3-phosphoglycerate [73] .28 Hàm lượng polysaccharide tạo cấu trúc (glycogen, mannan, glucan, trehalose), chất dự trữ glycogen, DNA, và RNA cao hơn so với tế bào tự do [38, 71, 73, 96, 113, 138, 150, 193]. .28 Desimone và cộng sự (2002) đã cho nấm men tiếp xúc với ethanol nồng độ 80% (v/v) trong nhiều khoảng thời gian khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sống sót của nấm men cố đònh cao hơn rất nhiều so với nấm men tự do. Sau 5 phút tiếp xúc với ethanol, nấm men tự do bò tiêu diệt hoàn toàn, trong khi số lượng nấm men cố đònh vẫn tương đương với thời điểm ban đầu [53]. 28 Nghiên cứu của Krisch và Szajáni (1997) cho thấy rằng hàm lượng glucose trên 16% (v/v) thì có ảnh hưởng độc đối với các tế bào nấm men tự do. Khi nồng độ cồn đạt 20% thì nấm men tự do không còn tồn tại. Các tế bào nấm men được nhốt trong gel alginate và hấp phụ trên cellulose thì có khả năng sống sót cao hơn nhiều so với nấm men tự do, lần lượt là 72 và 62% [117] 28 v Luận văn tốt nghiệp Holcberg và Margalith (1981) cho rằng hàm lượng glucose 40 và 50%w/w sẽ ức chế tế bào tự do, làm cho quá trình lên men hầu như không xảy ra, trong khi đó tế bào cố đònh vẫn có thể lên men mặc dù tốc độ chậm [91] .28 Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của hàm lượng cồn cao và ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu cao do đường gây ra [12, 113, 117, 133, 150, 206] 29 Nấm men cố đònh tạo thành glycerol nhiều hơn. Glycerol có tác dụng làm cân bằng thế oxy hóa khử nội bào của nấm men hoặc sự cân bằng NAD+/NADH và hoạt động như là một chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đối với áp lực thẩm thấu cao của đường trong suốt quá trình lên men. Nhiều tác giả cũng cho rằng khi hàm lượng đường càng tăng thì lượng glycerol tạo thành cũng tăng [15, 43, 52, 60] 29 Nấm men cố đònh chứa lượng acid béo no cao hơn so với nấm men tự do, nên làm tăng khả năng chòu nồng độ cồn cao. Mức độ no của acid béo càng tăng sẽ làm tăng khả năng chòu đựng đối với ethanol. Agudo (1992) cũng nhận thấy rằng các giống Saccharomyces chòu cồn có chỉ số không no thấp hơn so với các chủng ít chòu cồn [53, 117, 150] 29 Nấm men cố đònh có sự thay đổi về khả năng vận chuyển các chất qua màng, do đó làm tăng khả năng giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường. Nagodawithana và Steinkraus (1976) cho rằng khả năng chòu cồn tùy thuộc vào khả năng tế bào giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường [150, 163, 206] 29 Có hoạt tính enzyme ADH (là enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa acetaldehyde thành ethanol) cao hơn [59] .29 Tạo thành nhiều ester hơn. Do việc cố đònh các tế bào nấm men có thể làm thay đổi hoạt động của các enzyme acetyl-transferase theo hướng tích cực hơn, do đó làm tăng quá trình tổng hợp ester [20, 56, 113, 131, 133, 135, 193, 208] 30 Tạo thành ít diacetyl hơn [113] 30 Tạo thành ít acetaldehyde hơn [193, 196, 208] .30 Tạo thành ít methanol hơn [196, 208] 30 Tạo thành ít acid dễ bay hơi hơn [18, 196] 30 Tạo thành rượu bậc cao ít hơn khi lên men ở nhiệt độ thấp [20, 193] 30 2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯU VANG .32 2.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường 32 2.3.2 Ảnh hưởng của pH 36 2.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng SO2 38 Chống hóa nâu: khi dòch nho tiếp xúc với O2 trong không khí trong suốt quá trình chà và ép, dòch nho sẽ phản ứng với O2 trong không khí và bò oxy hóa. Quá trình oxy hóa làm cho dòch nho bò sậm màu, và dòch nho sẽ dần chuyển sang màu nâu. Quá trình hóa nâu có thể được tăng tốc do sự có mặt của enzyme polyphenoloxidase trong dòch nho. Loại enzyme này rất nhạy với SO2 tự do và enzyme này sẽ bò bất hoạt khi thêm SO2 vào dòch nho vì SO2 làm mất ổn đònh của các cầu disulfide trong enzyme. Ngoài ra, SO2 còn có khả năng liên kết với acetaldehyde, chất làm cầu liên kết cho các hợp chất phenolic, nhờ đó cũng làm kìm hãm quá trình hoá nâu [59, 30]. .38 Ức chế vi khuẩn và nấm men dại: nấm men vang có khả năng chòu đựng tốt đối với SO2 nhưng hoạt động của nấm men dại và vi khuẩn sẽ bò giảm đi đáng kể khi thêm vào một vi Luận văn tốt nghiệp lượng nhỏ SO2. Độ nhạy đối với sulfite thì khác nhau đối với các giống nấm men khác nhau. Kloeckera apiculata nhạy với hàm lượng SO2 tự do nhỏ hơn 5mg/L. Nhưng Candida guilliermondii và Zygosacccharomyces spp. thì nhạy với hàm lượng SO2 gấp ít nhất khoảng 10 lần [59, 90, 171]. .38 2.3.4 Ảnh hưởng của tannin .40 2.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ .41 Làm giảm mật độ tế bào nấm men .41 Kéo dài pha lag, vì thế các giống non-Saccharomyces dễ chiếm ưu thế hơn so với Saccharomyces .41 Thu hẹp màng lipid, do đó làm giảm khả năng vận chuyển của các hợp chất 41 Kéo dài thời gian lên men, làm tăng mối nguy xảy ra hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc qúa trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao 41 Khi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến động học quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men cố đònh trên DCM, Bardi và Koutinas (1994) nhận thấy rằng khi nhiệt độ lên men giảm từ 30 xuống 15oC, thời gian lên men của rượu vang sử dụng nấm men cố đònh tăng 158%, trong khi đó nấm men tự do tăng tới 331%. Kết quả được minh họa như trong Hình 2 .22 [17] .42 Bakoyianis và cộng sự (1997) đã tiến hành cố nấm men lần lượt trên 3 chất mang là kissiris, γ-alumina và calcium alginate và tiến hành lên men ở các nhiệt độ khác nhau là 7, 13 và 27oC. Trong tất cả các trường hợp, tốc độ lên men của các tế bào cố đònh cao gấp 2 – 3 lần so với tế bào tự do, và sự khác biệt về tốc độ lên men càng tăng khi nhiệt độ càng giảm [14]. 43 Bardi và cộng sự (1996) đã nghiên cứu quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men cố đònh trên gluten tại nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp. Kết quả cho thấy rằng tốc độ lên men của nấm men cố đònh cao hơn nhiều so với nấm men tự do. Khi nhiệt độ giảm từ 30 xuống 15oC, thời gian lên men của nấm men cố đònh tăng 22%, trong khi đó, nấm men tự do tăng 76% [18] 43 2.4 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG .44 2.4.1 Dùng kỹ thuật cố đònh để khắc phục một số vấn đề trong sản xuất rượu vang 44 Cung cấp thêm chất dinh dưỡng (ammonium phosphate, chất chiết nấm men) [163] .47 Cấy lại bằng nấm men mới [163] 47 Hấp phụ các acid béo lên than hoạt tính [163] .47 2.4.2 Dùng kỹ thuật cố đònh trong một số phương pháp lên men .47 M. Iconomopoulou và cộng sự (2002) đã nghiên cứu khả năng ứng dụng của nấm men cố đònh sấy thăng hoa (FGB) trong công nghiệp và nhận thấy rằng tuy ở chu kỳ 1, thời gian lên men và năng suất lên men không có sự khác biệt so với nấm men tự do (ffdc) nhưng ở chu kỳ 2, nấm men cố đònh cho năng suất lên men cao hơn hẳn và tốc độ lên men tăng lên đáng kể (Hình 2 .24) [93] .47 Bardi và cộng sự (1997) đã lần lượt cố đònh nấm men trên 2 loại chất mang là DCM và gluten để sử dụng cho quá trình lên men tónh nhiều chu kỳ tại các nhiệt độ khác nhau. Kết quả cho thấy nấm men cố đònh trên DCM có thể sử dụng trong 43 chu kỳ, trong khi đó, nấm men cố đònh trên gluten có thể sử dụng trong 29 chu kỳ. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng khi sử dụng nấm men cố đònh để tiến hành lên men thì hàm lượng ethyl acetate vii Luận văn tốt nghiệp tạo thành cao gấp 2 – 4 lần so với nấm men tự do, còn khi sử dụng nấm men cố đònh trên DCM để lên men ở nhiệt độ thấp thì hàm lượng amyl alcohol thấp hơn nhiều so với nấm men tự do, nhờ vậy mà giảm được độc tính cho sản phẩm rượu vang. Như vậy, sử dụng nấm men cố đònh sẽ cải thiện hương vò tốt hơn so với nấm men tự do [20]. .47 Kourkoutas và cộng sự (2003) đã sử dụng nấm men cố đònh trên miếng mộc qua để lên men rượu vang theo phương pháp lên men tónh nhiều chu kỳ. Và kết quả cho thấy rằng quá trình lên men vẫn có thể tiếp tục trong khoảng 8 tháng mà không làm mất đi đáng kể hoạt tính của nấm men. Khi thực hiện lên men ở nhiệt độ rất thấp (< 10oC) thì quá trình lên men rượu vang hoàn thành chỉ trong vòng 4 ngày, ngắn hơn rất nhiều so với phương pháp lên men truyền thống. Còn nếu lên men ở 0oC thì thời gian cần thiết khoảng là 50 ngày. Năng suất sinh tổng hợp ethanol thì cao hơn ít nhất là 4 hoặc 5 lần so với quá trình lên men truyền thống. Bên cạnh đó, hương vò của sản phẩm cũng được cải thiện nhiều, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp [27]. Như vậy, quả mộc qua đã chứng tỏ là chất mang thích hợp cho quá trình sản xuất rượu vang, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp. Kết quả nghiên cứu của Kourkoutas và cộng sự (2001) khi cố đònh trên miếng táo cũng cho kết quả tương tự, với thời gian sử dụng khoảng 7 tháng mà không làm mất đi hoạt tính [110] .48 Tsakiris và cộng sự (2004) đã tiến hành lên men rượu vang trắng sử dụng nấm men cố đònh trên nho khô theo phương pháp lên men tónh nhiều chu kỳ và kết quả cho thấy rượu vang tạo thành có hàm lượng acid dễ bay hơi, methanol và acetaldehyde thấp, và nấm men cố đònh có độ bền sinh học trong khoảng 4 tháng [196]. Một nghiên cứu khác của Tsakiris và cộng sự (2004) cũng cho thấy hệ thống lên men sử dụng nấm men cố đònh trên nho khô có độ bền vận hành rất cao, có thể tiến hành quá trình lên men tónh nhiều chu kỳ trong khoảng 1 năm mới phải thay nấm men cố đònh [197]. 48 Bakoyianis và cộng sự (1997) đã tiến hành lên men liên tục rượu vang tại nhiệt độ thấp và nhiệt độ phòng sử dụng lần lượt 3 chất mang là kissiris, γ-alumina và calcium alginate. Kết quả cho thấy rằng, mặc dù cùng sử dụng nấm men cố đònh nhưng năng suất sinh tổng hợp cồn khi lên men theo phương pháp liên tục cao hơn so với phương pháp lên men tónh (bảng 2.11) [14] 49 Kourkoutas và cộng sự (2002) đã thực hiện quá trình lên men rượu vang liên tục sử dụng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ưa lạnh cố đònh trên miếng táo. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng năng suất lên men theo phương pháp này cao hơn nhiều so với phương pháp lên men tónh truyền thống. Năng suất lên men cồn ở 5oC thì bằng với năng suất lên men cồn ở 22 – 25oC theo phương pháp truyền thống. Bình lên men có thể vận hành liên tục trong vòng 95 ngày mà không làm giảm năng suất tạo cồn. Đồng thời, hàm lượng rượu bậc cao và acetaldehyde trong rượu vang này thì thấp hơn so với rượu vang lên men theo phương pháp lên men tónh truyền thống (bảng 2.12). Điều đó chứng tỏ rằng chất lượng rượu vang đã được cải thiện [112]. Một nghiên cứu khác của Kourkoutas và cộng sự (2005) khi sử dụng chất mang là miếng táo, mộc qua và lê cũng cho kết quả tương tự [107] .49 Ogbonna và cộng sự (1989) đã tiến hành quá trình lên men rượu vang theo phương pháp liên tục trong thiết bò phản ứng sinh học nhiều cấp (multistage bioreactor) sử dụng các đóa sinh học (bioplate) làm tác nhân lên men. Các đóa sinh học này chính là nấm men cố đònh trên các đóa thủy tinh đã được gia công tạo mặt lưới. Kết quả nghiên cứu cho thấy quá viii Luận văn tốt nghiệp trình lên men liên tục sử dụng nấm men cố đònh trên đóa thủy tinh không những có tính ổn đònh cao, bền trong thời gian dài sử dụng mà còn có khả năng tạo sản phẩm có chất lượng không thua kém sản phẩm tạo ra theo phương pháp lên men truyền thống [152] .50 2.4.3 Dùng kỹ thuật cố đònh trong sản xuất một số loại rượu vang 50 Làm lạnh để giảm tốc độ lên men .50 Tách dòch lên men ra khỏi nấm men (bằng cách xử lý với bentonite rồi lọc) .50 Thêm SO2 sau khi lọc xong .50 Sử dụng nấm men cố đònh không gây ra bất cứ sự thay đổi đáng kể nào trong quá trình lên men .51 Tế bào giải phóng ra không ảnh hưởng đến độ trong của rượu vang .51 Các thành phần chính như ethanol, acid hữu cơ, nitơ tổng và rượu bậc cao không có sự khác biệt đáng kể khi so sánh rượu vang tạo ra bởi nấm men cố đònh và rượu vang tạo ra bởi nấm men tự do .52 Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .53 3.1 NGUYÊN LIỆU 53 3.1.1 Nho 53 3.1.2 Nấm men .54 3.1.3 Alginate .54 Chế phẩm dạng rắn, độ ẩm 20,05% 54 Độ nhớt của dung dòch alginate 2% ở 25oC là 423,6cP 54 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54 3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu 54 3.2.2 Phương pháp cố đònh nấm men trong gel alginate .56 Nhân giống 56 Nấm men trước khi sử dụng cần được nhân giống hai cấp: 56 Ly tâm 56 Sau khi nhân giống, nấm men được đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút, ở nhiệt độ 40C, thời gian 30 phút, để tách sinh khối. 56 Pha loãng 56 Dùng nước vô khuẩn pha loãng sinh khối nấm men đã ly tâm ở trên để đạt dung dòch huyền phù nấm men mật độ 50.106 tế bào/mL 56 Tạo dung dòch alginate .56 Dùng nước cất hòa tan alginate để thu dung dòch có nồng độ alginate là 4%. .56 Hấp tiệt trùng 57 Vô khuẩn dung dòch alginate ở 1210C, trong 20 phút .57 Làm nguội .57 Làm nguội dung dòch alginate sau khi hấp tiệt trùng đến nhiệt độ thường. 57 Trộn .57 Trộn dòch huyền phù tế bào nấm men 50.106 tế bào/mL với dung dòch alginate 4% theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để tạo hỗn hợp đồng nhất. 57 Tạo hạt 57 Nhỏ từng giọt hỗn hợp alginate natri-nấm men vào dung dòch CaCl2 2%. Đường kính ống nhỏ giọt 3mm, lỗ ra đặt cách mặt trên của dung dòch CaCl2 2cm, hạt được tạo thành ix [...]... QUAN 2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG 2.1.1 Rượu vang Rượu vang nho là sản phẩm thu được bằng con đường lên men cồn từ dòch nho Rượu vang nho có thể được sản xuất từ một giống nho riêng biệt, hoặc từ hỗn hợp hai hay ba giống nho khác nhau Vì vậy sản phẩm vang nho có số lượng và chủng loại rất phong phú, đa dạng Về mặt công nghệ, sản phẩm vang nho được chia ra thành... cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate 96 Hình 4.60: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 98 Hình 4.61: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men. .. trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate 81 Hình 4.42: Sự thay đổi pH trong trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) .83 Hình 4.43: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và. .. tiên) trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate .90 Bảng 4.32: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate 91 Bảng 4.33: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men. .. lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate 75 Bảng 4.23: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng cồn đạt được trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate 78 Bảng 4.24: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và. .. đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 69 Hình 4.29: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 69 Hình 4.30: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate... hàm lượng cồn trong trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 78 xxv Luận văn tốt nghiệp Hình 4.38: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn trong trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200... lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) .71 Hình 4.31: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) .71 Hình 4.32: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate (hàm lượng... và nấm men cố đònh trong gel alginate 79 Bảng 4.25: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate 80 Bảng 4.26: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men. .. và nấm men cố đònh trong gel alginate 70 Bảng 4.17: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate .71 Bảng 4.18: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate