tình hình nhiễm human papilloma virus (hpv) trên bệnh nhân đến khám bệnh lây truyền qua đường tình dục tại bệnh viện da liễu hà nội

Các nghiên cứu dịch tễ học, huyết thanh học, mô bệnh học và đặc biệt về sinh học phân tử đã khẳng định HPV là virus gây ung thư ở người.. Tại Việt Nam, phần lớn ung thư cổ tử cung được p

- H < I -

Cao Thị Kim Chúc

Tình hình nhiễm human papilloma virus (HPV)

trên bệnh nhân đến khám bệnh lây truyền qua đường tình dục

tại bệnh viện da liễu hμ nội (1/2008 - 10/2008)

Chuyên ngành : Vi sinh y học M∙ số : 60.72.68

Luận văn thạc sĩ y học

Người hướng dẫn khoa học:

T.S Nguyễn Thị Lan Anh

Hμ nội - 2009

Tôi xin trân trọng cảm ơn

Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học – Trường ĐH Y Hà Nội

cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới

- Các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu

- TS Nguyễn Thị Lan Anh - Người thầy đã trực tiếphướng dẫn, truyền đạt cho tôi ý tưởng, tận tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

- Ban giám đốc Bệnh viện Da liễu Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

- Các đồng nghiệp trong khoa Xét nghiệm Bệnh viện Da liễu Hà Nội

đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

- Xin bày tỏ những tình cảm ấm áp và chân thành nhất tới Gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 1 năm 2009

Cao Thị Kim Chúc

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Lịch sử phát hiện HPV 4

1.2 Đặc điểm sinh vật học của HPV 4

1.2.1 Phân type HPV 4

1.2.2 Hình thái, cấu trúc của HPV 5

1.2.3 Hệ gien của HPV 6

1.3 Vài nét về dịch tễ học của nhiễm HPV 7

1.3.1 Đường lây truyền và xâm nhập của HPV 7

1.3.2 Tình hình nhiễm HPV trên thế giới 8

1.3.3 Tình hình nhiễm HPV ở Việt Nam 9

1.4 Bệnh lý nhiễm HPV 9

1.4.1 Các bệnh cảnh lâm sàng do HPV gây nên 9

1.4.2 Cơ chế bệnh sinh nhiễm HPV 10

1.4.3 Nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung 11

1.5 Chẩn đoán nhiễm HPV 13

1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 13

1.5.2 Chẩn đoán cận lâm sàng 14

1.6 Điều trị nhiễm HPV 15

1.6.1 Mục đích điều trị 15

1.6.2 Điều trị với các tổn thương ngoài da do HPV gây nên 16

1.6.3 Điều trị sớm ung thư cổ tử cung 16

1.7 Đáp ứng miễn dịch tự nhiên đối với HPV 16

1.8 Phòng nhiễm HPV 17

1.8.1 Phòng không đặc hiệu 17

1.8.2 Phòng đặc hiệu 17

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 19

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 19

2.2 Phương tiện và vật liệu nghiên cứu 19

2.2.1 Phương tiện và vật liệu cho kỹ thuật PCR 19

2.2.2 Phương tiện và vật liệu sử dụng cho kỹ thuật tế bào học 21

2.2.3 Phương tiện và vật liệu cho kỹ thuật xét nghiệm vi sinh 21

2.3 Phương pháp và cỡ mẫu nghiên cứu 22

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 22

2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 22

2.4 Kỹ thuật nghiên cứu 24

2.4.1 Chuẩn bị bệnh nhân 24

2.4.2 Kỹ thuật xác định HPV bằng PCR 24

2.4.3 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh 31

2.4.4 Kỹ thuật xét nghiệm tế bào học cổ tử cung 33

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 35

2.6 Các yêu cầu về đạo đức trong nghiên cứu 35

2.7 Địa điểm nghiên cứu 35

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu 36

3.1.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 36

3.1.2 Phân bố bệnh nhân theo trình độ học vấn 37

3.1.3 Phân bố bệnh nhân theo nghề nghiệp 38

3.1.4 Phân bố bệnh nhân theo tuổi bắt đầu có QHTD 39

3.1.5 Phân bố bệnh nhân theo tiền sử QHTD 40

3.1.6 Phân bố bệnh nhân theo tiền sử mang thai 40

3.1.7 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng lâm sàng 41

3.2 Tình trạng nhiễm HPV phát hiện bằng PCR 42

3.2.1 Tỷ lệ nhiễm HPV chung trong nghiên cứu 42

3.2.2 Tỷ lệ nhiễm HPV type nguy cơ cao HPV 16 và HPV 18 43

3.2.3 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HPV theo nhóm tuổi 45

3.2.4 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HPV theo trình độ học vấn 45

3.2.5 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HPV theo nghề nghiệp 46

3.2.6 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HPV theo nhóm có tiền sử QHTD 47

3.2.7 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HPV theo nhóm tuổi bắt đầu có QHTD 47

3.2.8 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HPV theo tiền sử mang thai 48

3.2.9 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HPV theo triệu chứng lâm sàng 48

3.3 Kết quả xét nghiệm tế bào học 49

3.4 Kết quả xét nghiệm vi sinh vật 50

3.5 Nhiễm HPV xác định bằng PCR và tế bào học cổ tử cung 51

3.6 Nhiễm HPV với loạn sản tế bào cổ tử cung 51

3.7 Nhiễm HPV với tình trạng viêm xác định bằng xét nghiệm vi sinh 53

Chương 4: BÀN LUẬN 54

4.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 54

4.1.1 Tuổi 54

4.1.2 Nghề nghiệp, trình độ học vấn 54

4.1.3 Một số đặc điểm liên quan đến QHTD 55

4.2.Tỷ lệ nhiễm HPV 55

4.2.1 Tỷ lệ nhiễm HPV chung 55

4.2.2 Tỷ lệ nhiễm HPV type 16, 18 57

4.3 Nhiễm HPV và một số các yếu tố nguy cơ 58

4.3.1 Nhiễm HPV với tuổi 58

4.3.2 Nhiễm HPV với trình độ học vấn, nghề nghiệp 59

4.3.3 Nhiễm HPV với tiền sử quan hệ tình dục 59

4.3.4 Nhiễm HPV với tuổi lần đầu quan hệ tình dục 60

4.3.5 Nhiễm HPV với tiền sử thai nghén 62

4.3.6 Nhiễm HPV với các biểu hiện lâm sàng 62

4.3.7 Nhiễm HPV với tình trạng viêm 62

4.4 Chẩn đoán nhiễm HPV bằng PCR và xét nghiệm tế bào học

cổ tử cung 63

4.5 Nhiễm HPV với loạn sản tế bào CTC 64

KẾT LUẬN 65

KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CDC Centers for Disease Control and Prevention

Trung tâm phòng chống bệnh Hoa Kỳ CIN Cervical Intraepithelial neopalasia

Loạn sản thượng bì cổ tử cung

CTC Cổ tử cung

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

HIV Human Immunodeficiency Virus

HSIL High Squamous Intraepithelial Lesion

Tổn thương nội biểu mô vảy độ cao

LASER Light Amplification of Stimulates Emission of Radiation

Sự khuyếch đại ánh sáng bằng phát xạ cưỡng bức LSIL Low Squamous Intraepithelial Lesion

Tổn thương nội biểu mô vảy độ thấp

Phản ứng khuyếch đại chuỗi

PV Papilloma Virus

QHTD Quan hệ tình dục

STI Sexually Transmitted Ìnfection

Nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục TBH Tế bào học

UTCTC Ung thư cổ tử cung

ĐẶT VẤN ĐỀ

Human Papilloma virus (HPV) là một loại virus gây nên nhiều bệnh

cảnh lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm ở da; sùi mào gà ở sinh hậu môn [68,69] Trong các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục, nhiễm HPV là nguyên nhân thường gặp trên cả nam và nữ Nhiều nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã xác định sự lây nhiễm HPV từ mẹ sang con,

dục-có mối liên quan giữa người mẹ nhiễm HPV với bệnh u nhú thanh quản ở con [9] Hiện nay, HPV đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm vì tính chất gây bệnh nghiêm trọng Các nghiên cứu dịch tễ học, huyết thanh học, mô bệnh học và đặc biệt về sinh học phân tử đã khẳng định HPV là virus gây ung thư ở người HPV gây nên hàng chục loại u, ung thư trong đó đặc biệt nghiêm trọng là các u, ung thư ở cơ quan sinh dục như ung thư cổ tử cung và một bộ phận các ung thư vòm họng, thực quản, đường hô hấp trên Một số type HPV

là nguyên nhân chính gây nên ung thư cổ tử cung ở phụ nữ Một nghiên cứu trên 932 bệnh nhân ung thư cổ tử cung ở 22 quốc gia cho thấy: ADN của HPV hiện diện trong 99,7% trên các mẫu bệnh phẩm [75]

Theo nghiên cứu tình hình bệnh nhân nhiễm HPV tại Viện Da liễu Quốc gia giai đoạn 2000 – 2006 cho thấy: số bệnh nhân đến khám và điều trị tại Viện

Da liễu Quốc gia do nhiễm HPV có biến chứng ung thư tế bào vảy dẫn đến tử vong đang ngày càng gia tăng [16]

Nghiên cứu hệ gien đã xác định có hơn 140 type HPV, trong đó 30 – 40 type gây bệnh ở hậu môn, sinh dục, 15 - 20 type có khả năng gây ung thư cổ

tử cung Có hai type đặc biệt nguy hiểm đã được khẳng định đó là HPV 16 và HPV 18 Đây là hai type thường gây ung thư cổ tử cung ở hầu hết các nơi trên thế giới

Tại Việt Nam, phần lớn ung thư cổ tử cung được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn tiến từ nhiễm virus đến ung thư thường lâu dài, trung bình sự tiến triển từ loạn sản nhẹ, vừa, nặng đến ung thư tại chỗ (giai đoạn tổn thương có thể phục hồi) đến ung thư xâm nhập kéo dài từ 10-20 năm [18] Đây chính là một điều kiện rất thuận lợi cho việc sàng lọc ung thư cổ tử cung Sàng lọc sẽ phát hiện những nhóm người có nhiều nguy cơ mắc ung thư

cổ tử cung nhằm giúp cho việc điều trị hiệu quả ung thư giai đoạn sớm và các tổn thương tiền ung thư [19]

Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (PAP Smear) ngày càng được cải tiến

và ngày nay vẫn là một phương pháp sàng lọc ung thư cổ tử cung có hiệu quả Tại các nước phát triển, xét nghiệm được coi là phương pháp sàng lọc cơ bản Xét nghiệm được thực hiện 1-2 lần/năm hoặc ít nhất cứ 3 năm 1lần đối với phụ nữ đã có quan hệ tình dục cho tới 65 tuổi

HPV là loại virus không thể phát triển trong thực nghiệm và không phát hiện được bằng các xét nghiệm huyết thanh học Sự nhận diện và định type HPV căn cứ vào các phân tích Acid Nucleic Trong những năm gần đây, việc

áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện HPV, đặc biệt là định ra được các type nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung đã trở nên phổ biến Kỹ thuật PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới [14,30] Sự phối hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện nhiễm HPV và xét nghiệm tế bào học trong sàng lọc phát hiện sớm đã góp phần đáng kể làm giảm tỷ lệ ung thư cổ tử cung

Với mong muốn góp phần đánh giá tình hình nhiễm HPV và xác định được type HPVcó nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung trên bệnh nhân nhiễm HPV tại Hà Nội, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

Tình hình nhiễm Human Papilloma Virus (HPV) trên bệnh nhân đến khám bệnh lây truyền qua đường tình dục tại Bệnh viện Da liễu Hà Nội (1/2008 – 10/2008)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát hiện HPV

Từ thời Hy lạp cổ, tổn thương u sùi (sùi mào gà) ở bộ phận sinh dục đã được mô tả giống như một quả dâu

Cuối thế kỷ 19, một số tác giả đã mô tả biểu hiện tế bào học của tổn thương hạt cơm ở da và các sùi mào gà là giống nhau [63] Sau đó người ta đã gây bệnh thực nghiệm ở trên da bằng cách cấy bệnh phẩm lấy từ tổn thương sùi mào gà ở qui đầu [63]

Năm 1949, Straus và CS đã sử dụng kính hiển vi điện tử phát hiện được nguyên nhân gây bệnh hạt cơm ở da là do virus Năm 1954, Beutner và CS đã chứng minh bệnh sùi mào gà là bệnh lây truyền qua đường tình dục Năm

1969, Dunn và CS phát hiện phân tử virus tương tự ở tổn thương sùi mào gà Cấu trúc của sùi mào gà là những tế bào da chồng lên nhau và có rất nhiều virus Cuối thập niên 1970, bộ gien virus đầu tiên được nhân bản thành công

ở vi khuẩn Trong suốt thập niên 80, nghiên cứu về virus gây các u sùi được khuyến khích và phân tích Ngày nay, đã có nhiều nghiên cứu về liên quan của virus gây u sùi với các ung thư, đặc biệt là ung thư cổ tử cung [39]

1.2 Đặc điểm sinh vật học của HPV

1.2.1 Phân type HPV

Papillomavirus (PV) là thành viên trong họ Papovavidae PV được tìm

thấy trong rất nhiều loài động vật có vú, trong đó có con người Tính đặc hiệu

theo loài gây bệnh của PV rất cao, khó có thể tìm thấy type PV của loài này

lại gây bệnh cho loài khác PV gây bệnh cho người được gọi là Human

papillomavirus (HPV) HPV chỉ thích ứng biểu mô vảy và niêm mạc, gây

PV được chia làm 5 siêu nhóm chính (super-groups), siêu nhóm A (còn gọi là alpha), siêu nhóm B (còn gọi là beta, bao gồm 2 phân nhóm B1 và B2), siêu nhóm G (còn gọi là siêu nhóm gamma), siêu nhóm E bao gồm 2 phân

nhóm là Mu và Nu Trong đó siêu nhóm A là nguyên nhân chính gây nên ung

thư cổ tử cung chứa khoảng 60 thành viên Các type HPV của các nhóm beta, gamma, Mu và Nu chủ yếu gây nhiễm trên da

HPV được coi là cùng type, nếu như chuỗi gien L1 trong hệ gien không khác nhau trên 10% Tuy nhiên cũng có nhiều trường hợp, phân type HPV không dựa vào chênh lệch phần trăm nucleotid trong chuỗi gien L1, mà còn phải xem xét thêm các đặc tính gây bệnh của các type đó [40,41]

1.2.2 Hình thái, cấu trúc của HPV

HPV có kích thước nhỏ, khoảng 55 nm, không có vỏ ngoài (envelope) Dưới kính hiển vi điện tử, HPV trông giống như quả bóng gôn, nằm cạnh nhau theo một tập hợp (Hình 1.A) Vỏ capsid được cấu tạo bởi 72 capsomer Mỗi đơn vị capsomer chứa 2 loại protein capsid là L1(layer 1), và L2 (layer 2) Pentamer của L1 là thành phần protein chủ yếu của vỏ capsid, được gọi là lớp vỏ lớn, có cấu trúc khối từ các đơn vị 5 góc cạnh (Hình 1.B) Kề cận L1 là

protein cấu trúc của L2 , còn gọi là lớp vỏ bé, gồm nhiều đơn vị xếp lớp theo

nhau (12 đơn vị / virus) [43]

A B

Hình 1.1: Hình thái, cấu trúc của HPV A) Tập hợp HPV quan sát dưới kính hiển vi

điện tử B) Mô hình không gian ba chiều của HPV

1.2.3 Hệ gien của HPV

Genome của HPV là một phân tử ADN kép, khép vòng, dài khoảng

8000 cặp nucleotid (bp), liên kết với nhiều phân tử protein kiềm Các khung đọc mở (ORF-Open Reading Flame) mã hóa cho toàn bộ protein của HPV nằm trên một mạch ADN Genome của HPV mã hóa cho 8-10 protein

Theo chức năng, genome được phân chia làm 3 phân vùng quan trọng:

- Phân vùng thứ nhất: Vùng điều hòa ngược, không có chức năng mã hóa,

có độ dài 400-1000 cặp bazơ- bp, có chức năng điều hoà sao chép và sự nhân lên của virus, là vùng điều hoà lớn, vùng này có chứa promoter p97 là tiểu phần khởi động, các tiểu phần kích hoạt và một số vùng gien câm [33] Phân vùng này có hệ số biến đổi nucleotid cao hơn rất nhiều so với các vùng khác trong hệ gien của HPV

- Phân vùng thứ hai: Vùng gien sớm, chứa các khung đọc mở có các gien ký

hiệu là E (early region), gồm các gien: E1, E2, E4, E5, E6 và E7, sản phẩm

protein của chúng trợ giúp cho sự nhân lên ADN của virus, tham gia cơ chế hình thành ung thư cổ tử cung

- Phân vùng thứ ba: Vùng gien muộn (late region), gồm các gien mã hóa

cho các protein cấu trúc L1 và L2, là những protein cấu trúc vỏ capsid của

virus tạo nên 72 capsomer

Dựa trên trình tự của các gien E6, E7 và L1 để phân loại HPV thành các type khác nhau [43]

Hình 1.2: Giản đồ genome của HPV

1.3 Vài nét về dịch tễ học của nhiễm HPV

1.3.1 Đường lây truyền và xâm nhập của HPV

Đường lây truyền của HPV chủ yếu qua da và niêm mạc thông qua các tổn thương rất nhỏ khó nhận thấy HPV là một trong những căn nguyên thường gặp gây nên nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục có thể là đồng giới hoặc khác giới Không những HPV gây nhiễm ở hậu môn, cơ quan sinh dục ngoài mà tại các nơi có liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp như âm đạo, cổ

tử cung, hậu môn, niệu đạo đều có thể bị nhiễm HPV QHTD đường miệng

có thể gây lây nhiễm HPV thông qua niêm mạc miệng và từ đó HPV lan tới vùng mũi, họng, hạ hầu, vùng hô hấp trên, thanh quản, thực quản HPV gây

Sự lây nhiễm HPV thường xuất hiện ở phụ nữ trẻ hoặc phụ nữ có nhiều bạn tình, mắc các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục, nạo hút thai nhiều lần, sinh nhiều con, suy giảm miễn dịch Điều này được giải thích do cơ thể của thiếu nữ chưa trưởng thành, sự bảo vệ của niêm mạc âm đạo chưa tốt, các tổn thương niêm mạc do viêm nhiễm là điều kiện thuận lợi để virus xâm nhập

Người ta cho rằng, thể tiềm ẩn của HPV nhiều hơn các thể nhìn thấy hàng trăm lần Có thể nhiễm HPV ngay từ khi mới sinh ra hay từ khi còn nhỏ Trong đa số người nhiễm HPV sinh dục, chỉ có một số ít phát triển thành bệnh

có thể nhìn thấy [17,19]

Ước tính chung, ít nhất có khoảng 50% nam và nữ ở tuổi hoạt động tình dục đã từng bị nhiễm HPV Vào độ tuổi 50, ít nhất 80% phụ nữ bị nhiễm HPV đường sinh dục Hầu hết nhiễm HPV không có triệu chứng và tự khỏi Chính vì vậy, những người nhiễm HPV không nhận biết được tình trạng nhiễm HPV của họ và tiếp tục làm lây truyền HPV sang bạn tình [39]

1.3.2 Tình hình nhiễm HPV trên thế giới

Theo điều tra của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), tỷ lệ nhiễm HPV của phụ nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9-13%, (nghĩa là cứ

10 phụ nữ thì một bị nhiễm HPV) Có vào khoảng 630 triệu phụ nữ trên thế giới nhiễm HPV, tỷ lệ cao nhất thấy ở các nước Châu phi như Zimbabwe lên tới 41,6% Một số nước Châu Á có tỷ lệ nhiễm HPV tương ứng như Trung Quốc 18 %, Ấn Độ 16,9 %, Hàn Quốc 10,4% [11]

Độ tuổi nhiễm HPV thay đổi tùy địa phương Ở Phần Lan, nhiễm HPV thường xảy ra trong độ tuổi từ 20-29 Nghiên cứu 10.758 phụ nữ tuổi từ 20-29

1.3.3 Tình hình nhiễm HPV ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong khu vực các nước đang phát triển, những xét nghiệm sàng lọc HPV mới được thực hiện nên những báo cáo về các trường hợp bệnh mới mắc thường ít hơn thực tế Chưa có một tài liệu về chương trình sàng lọc mang tính quốc gia về tình hình nhiễm HPV trên phụ nữ Việt Nam được công bố Tuy nhiên, qua số liệu ghi nhận từ một số đề tài nghiên cứu thí điểm tại Hà Nội và TP Hồ Chí Minh cho thấy, số phụ nữ nhiễm HPV

ở huyện Sóc Sơn, Hà Nội là 1,8% và phụ nữ quận 10, TP Hồ Chí Minh là 9,9% [27,64]

1.4 Bệnh lý nhiễm HPV

1.4.1 Các bệnh cảnh lâm sàng do HPV gây nên

Hiện nay, có hơn 140 type HPV đã được xác định và được xếp thành các nhóm theo bệnh cảnh lâm sàng như sau:

Bảng 1.1: Các type HPV và các bệnh cảnh lâm sàng có liên quan

Loạn sản thượng bì dạng hạt cơm 5,8,9,12,14,15,17,19,20-25,36,47,50.

Nguy cơ cao 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 59, 66.

a Màu nhạt thể hiện ít xuất hiện hơn so với các màu đậm“

1.4.2 Cơ chế bệnh sinh nhiễm HPV

Ngay sau khi đi vào trong tế bào chủ, HPV nhân lên theo quá trình biệt hóa của tế bào nền và phát triển tiến đến bề mặt của biểu bì Trong lớp nền, sự nhân lên của virus không có hiệu quả, virus tồn tại ở dạng thể bổ sung (episome) Sự nhân lên của HPV phụ thuộc vào cơ chế phiên mã của tế bào biểu mô da hoặc niêm mạc Những hạt thể virus trưởng thành chỉ thấy ở lớp tế bào bề mặt [46]

Các tế bào đang sinh sản

Nhân lên lần 2

Duy trì

Các tế bào đang biệt hoá

Nhân lên lần 1

Hình 1.3: Sơ đồ nhân lên của HPV Quá trình nhân lên của HPV theo các giai đoạn biệt

hoá của tế bào chủ từ khi là các tế bào nền cho đến khi chúng sinh sản tiến lên các lớp trên Đối với HPV nhóm nguy cơ thấp gây nhiễm tế bào da và niêm mạc (mụn cóc hay hạt cơm), ADN của virus không gắn vào genome của tế bào mà

Đối với HPV nhóm “nguy cơ cao” gây nên các khối u và ung thư, ADN của HPV có khả năng tích hợp vào bộ gien của tế bào Ngoài dạng tích hợp, còn tồn tại ở dạng plasmid nhưng dạng tích hợp nhiều hơn dạng plasmid Sự tích hợp này gây ra bất hoạt của các gien E1 và E2, do vậy sự sao mã là giới hạn trong các gien E6 và E7 Sau khi tích hợp, vùng gien E6, E7 điều khiển tổng hợp các protein theo chiều hướng bất thường làm kích hoạt những chất sinh ung thư, bất hoạt những gien ức chế sự tạo khối u p53 (gien E6) và Rb

(gien E7), do đó sẽ gây ra sự phát triển hỗn loạn của nhóm tế bào bị nhiễm

1.4.3 Nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung

Hình 1.4: Quá trình tiến triển từ nhiễm HPV đến UTCTC

Vào năm 1976, Harold zur Hausen, một nhà nghiên cứu virus học người Đức đã chỉ ra mối liên quan giữa nhiễm HPV và UTCTC Đây là ung thư phổ biến ở phụ nữ chỉ đứng sau ung thư vú Trong nhiều năm gần đây, HPV được báo cáo là tác nhân chính, là nguyên nhân cần có của UTCTC

Không phải tất cả các trường hợp nhiễm HPV đều tiến triển thành UTCTC Nhiễm HPV dù bất kỳ nhóm nào đều có khả năng tự lui bệnh và không để lại

di chứng cho người bị nhiễm Hơn phân nửa các trường hợp loạn sản nhẹ có khả năng tự thoái lui, 10% các trường hợp loạn sản vừa và nặng có khả năng tiến triển nặng hơn trong khoảng 2-4 năm, khoảng 50% loạn sản nặng sẽ trở

Hình 1.5: Cơ chế bệnh sinh nhiễm HPV

Cùng với tình trạng nhiễm HPV, UTCTC do HPV gây nên đang ngày càng gia tăng Mỗi năm trên thế giới có 2.274.000 ca UTCTC, trong đó có 510.000 ca mắc mới [11]

Tại Việt Nam, theo Nguyễn Bá Đức, năm 2002 có 6.224 ca mắc mới và 3.334 ca tử vong Năm 2005, có 4.471 ca mắc mới UTCTC gặp ở những phụ

nữ đang và sau tuổi sinh đẻ (35-55) tuổi

Tỷ lệ mắc và tử vong do UTCTC có xu hướng giảm dần ở các nước phát triển nhờ các thành tựu đạt được trong phòng bệnh, phát hiện bệnh sớm, cải thiện chất lượng chẩn đoán và điều trị, trong khi đó tỷ lệ lại có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam Do hầu hết phụ nữ ở các nước đang phát triển không được tiếp cận với các chương trình y tế khám sàng lọc và điều trị, tỷ lệ tử vong vẫn còn rất cao, trung bình là 50% trong vòng 5 năm [19]

1.5 Chẩn đoán nhiễm HPV

1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng

1.5.1.1 Có triệu chứng

HPV gây nên các bệnh cảnh lâm sàng khác nhau với các triệu chứng rất

phong phú Ở da và niêm mạc, HPV có thể gây nên một số các triệu chứng sau:

• Tổn thương sùi: sẩn nổi cao, trên có các nhú mềm màu hồng tươi giống như các tinh thể nhô lên, xoè rộng ra giống mào gà, hay giống súp lơ, thương tổn có khi có cuống, không có hiện tượng thâm nhiễm

• Tổn thương dạng mụn cơm: là các sẩn nổi cao hoặc phẳng, màu hồng hoặc màu xám, bề mặt thô, có các nhú rất nhỏ

• Tổn thương có thể là một vùng thô mất bóng chỉ có thể nhìn thấy rõ khi làm thử nghiệm Acid axetic 3-5%

1.5.1.2 Không có triệu chứng

Sau khi xâm nhập, HPV không gây nên bất kỳ triệu chứng lâm sàng nào cho người bị nhiễm, vì vậy phải dựa vào cận lâm sàng để phát hiện

1.5.2 Chẩn đoán cận lâm sàng

1.5.2.1 Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung ( PAP Smear )

Những biểu hiện nhiễm HPV là sự có mặt của tế bào “rỗng” Koilocyte hay còn gọi là “tế bào bóng” Tế bào có hình ảnh đặc trưng với màng tế bào dày lên do sự cô đặc của bào tương, protein của tế bào đặc lại ở sát màng tế bào tạo nên hình ảnh tế bào rỗng Tế bào Koilocyte điển hình có vùng sáng trong bào tương, quầng sáng quanh nhân, nhân thường nằm lệch

1.5.2.2 Test Acid axetic

Các biểu hiện lâm sàng không nhìn thấy rõ có thể dùng thử nghiệm này Sau khi bôi Acid axetic 3-5% khoảng 5 phút, xuất hiện mảng giới hạn rõ màu trắng, hơi nổi cao, bề mặt thô, nếu dùng kính lúp có thể thấy bề mặt thô rõ hơn, trên có các nhú là thử nghiệm dương tính

1.5.2.3 Phân lập HPV

Phân lập virus được coi là tiêu chẩn vàng để xác định nhiễm virus Việc phân lập HPV còn gặp nhiều khó khăn do sự nhân lên của virus cần có sự biệt

hóa của tế bào keratin và cấu trúc tầng của các tế bào biểu mô

Cho tới nay đã có rất nhiều các cố gắng để thiết lập hệ thống phân lập HPV như: mô hình dị ghép hoặc hệ thống nuôi cấy từ các tổn thương ở trên

da người hoặc mô tử cung đã được nhân lên bằng cách ghép các mô bệnh vào chuột bị gây thiếu hụt miễn dịch [47]

Tuy nhiên hệ thống phân lập này vẫn chưa trở thành thường quy phân lập virus HPV phục vụ mục đích chẩn đoán Do đó chẩn đoán tế bào học và mô

1.5.2.4 Xác định ADN của HPV bằng kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Nhờ enzym ADN polymerase xúc tác, từ mạch khuôn ADN các mạch đơn mới

được tổng hợp

PCR sử dụng bộ mồi chung cho tất cả các type HPV là sử dụng các mồi

để khuếch đại một phổ rộng các type HPV Những mồi này nằm ở vùng bảo toàn trong genome của HPV như gien mã hóa protein vỏ capsid L1 Cặp mồi MY09 và MY11 khuếch đại sản phẩm có đích 450bp bên trong khung đọc mở L1 (HPV L1 ORF) Các mồi GP5+ và GP6+ khuếch đại sản phẩm có đích 150bp nằm bên trong vùng đích của cặp mồi MY09 và MY11 với độ nhạy phân tích từ 10-200 bản copy mỗi mẫu

Khi sử dụng cặp mồi chung để khuếch đại một đoạn gien có mặt trong genome của mọi type HPV, có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định đoạn gien này là của type HPV nào Ta có thể giải trình tự (sequecing) đoạn gien này rồi so sánh đối chiếu với trình tự gien của các type HPV, hoặc lai sản phẩm PCR với các đầu dò ADN đặc hiệu với các type HPV

1.6 Điều trị nhiễm HPV

1.6.1 Mục đích điều trị

Xóa sạch các tổn thương do HPV gây ra

Giảm tối đa ổ bệnh để hệ thống miễn dịch hỗ trợ loại bỏ virus

Giảm lây lan virus tại chỗ, giảm lây lan cho người khác, nhất là bạn tình

Giảm nguy cơ ác tính

Phục hồi lại giải phẫu và chức năng cho cơ quan bị bệnh

1.6.2 Điều trị với các tổn thương ngoài da do HPV gây nên

Phương pháp điều trị được áp dụng: dùng hóa chất gây ức chế sự phân bào như podophyllin 10-20%; hóa chất gây đông hóa như Acid trichloracetic; thuốc miễn dịch; phẫu thuật

Hiện nay, phương pháp điều trị phẫu thuật được áp dụng phổ biến và mang lại hiệu quả cao: phẫu thuật cắt bỏ, Lazer CO2 , Lazer YAG

1.6.3 Điều trị sớm ung thư cổ tử cung

Theo cách phân type FIGO (Hiệp hội sản phụ khoa quốc tế), UTCTC được chia làm bốn giai đoạn Trong đó, giai đoạn một là giai đoạn UTCTC chưa xâm nhập, chỉ khu trú ở CTC và giai đoạn bốn là giai đoạn ung thư đã xâm nhập, lan tràn đến các nơi khác trong cơ thể [27]

Ở giai đoạn ung thư chưa xâm nhập, phương pháp điều trị có thể bằng đốt điện, đốt lạnh, khoét chóp CTC bằng dao điện hình vòng hoặc cắt toàn bộ

tử cung Các biện pháp điều trị trên được phối hợp với việc xạ trị tùy theo từng bệnh nhân cụ thể

Ở giai đoạn sớm, tỷ lệ sống thêm sau 5 năm là trên 95%, trong khi nếu phát hiện ở giai đoạn muộn, tỷ lệ sống thêm sau 5 năm chỉ còn khoảng 5% Điều này một lần nữa khẳng định tầm quan trọng của việc sàng lọc UTCTC

một cách thường xuyên sẽ mang lại hiệu quả cao cho điều trị [18]

1.7 Đáp ứng miễn dịch tự nhiên đối với HPV

Những tổn thương ban đầu do HPV gây nên chỉ xảy ra tại biểu mô vảy vốn không có tiếp xúc mạch máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ, không có virus trong máu, không có sự phá vỡ tế bào sừng nên không có sự phóng thích những cytokin Không có hoạt động của tế bào trình diện kháng nguyên nên không có sự

1.8 Phòng nhiễm HPV

1.8.1 Phòng không đặc hiệu

Quan hệ một vợ một chồng

Hạn chế quan hệ tình dục sớm

Sử dụng các biện pháp tránh thai: sử dụng bao cao su

Phòng tránh các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục

Tuy nhiên, vấn đề sử dụng bao cao su trong QHTD không an toàn có thể giúp cho việc phòng chống các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục mà không tránh được sự lây nhiễm của HPV Chỉ cần tiếp xúc với HPV nằm bên ngoài sự che phủ của bao cao su cũng đủ để nhiễm bệnh [27]

1.8.2 Phòng đặc hiệu

Hiện nay, đã có Gardasil được xem là biện pháp đột phá trong phòng ngừa ung thư CTC và các bệnh lý liên quan đến HPV Gardasil là vaccine tứ giá phòng được HPV 6, HPV 11, HPV 16 và HPV 18 HPV 6 và HPV 11 gây nên 90% các trường hợp SMG sinh dục - hậu môn, U nhú thanh quản, U Buschke Lowenstein; HPV 16 và HPV 18 được coi là thủ phạm của 70% các trường hợp UTCTC

Vaccine đã được nghiên cứu thành công và được phép sử dụng tại nhiều quốc gia trong đó có Việt Nam Các vaccine được cấu tạo bởi HPV có thành phần bao gồm vỏ capsid virus rỗng chứa các kháng nguyên vỏ của HPV, hoàn toàn không chứa ADN của virus Được sản xuất trên môi trường nấm men (Saccharomyces Cerevisiae)

Hình 1.6: Mô hình mô tả các vaccine được cấu tạo bởi HPV có thành phần bao gồm

vỏ capsid virus rỗng chứa các kháng nguyên vỏ của HPV, hoàn toàn không chứa

ADN của virus

Tuy nhiên, vaccin không phòng được các trường hợp lây nhiễm HPV thuộc các type khác, giá thành còn cao Vì vậy, vấn đề phòng bệnh không đặc hiệu đi cùng với sàng lọc phát hiện sớm nhiễm HPV và UTCTC nên được xem là quan trọng hàng đầu

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Phụ nữ đã có quan hệ tình dục, đến khám phụ khoa tại bệnh viện Da liễu Hà Nội trong thời gian từ tháng 1/2008 đến tháng 10/2008

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân đã được khẳng định hoặc nghi ngờ nhiễm HIV

- Bệnh nhân đang có thai

2.2 Phương tiện và vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Phương tiện và vật liệu cho kỹ thuật PCR

Tách chiết ADN

• Kit QIAamp viral ADN mini kit (Qiagien)

• Ethanol 100%, AAPER Alcohol

• Ultrapure distilled water, Nuclease Free (Gibco-Invitrogien)

• Temperature-regulated centrifuge; Eppendorf 5415 R

Phản ứng PCR

• Taq polymelase 5units/1μl

• Cân điện 10-2 (Mettler Toledo)

• Cân phân tích 10-4 (Mettler Toledo)

• Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)

• Máy đo pH

• Máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5415R)

• Máy lắc ổn nhiệt 370C

• Máy PCR (My cyclerTM Bio-rad và Eppendorf)

• Bộ điện di ADN (Advance Tech, Japan)

• Máy soi chụp ảnh gel (Bio-rad)

• Nồi khử trùng (Japan)

• Tủ lạnh sâu (-200C đến -750C) (Sanyo, Japan)

• Máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI)

• PipetteMan các loại (Gilson), tube eppendorf 1,5; 1; 0,2 ml

2.2.2 Phương tiện và vật liệu sử dụng cho kỹ thuật tế bào học

• Quệt bẹt Ayre cải tiến vô trùng, mỗi bệnh nhân 1 chiếc

Hóa chất nhuộm PAP:

• Dung dịch cố định: Cồn tuyệt đối – Ete thể tích 1-1

2.2.3 Phương tiện và vật liệu cho kỹ thuật xét nghiệm vi sinh

• Kính hiển vi quang học với vật kính dầu 1000X, que cấy vô trùng, lam kính vô trùng

• Nước muối sinh lý 0,9%

• Dung dich thuốc nhuộm Gram (nhuộm kép): Tím gientian 2%, Lugol 1%, Acetone-cồn 1/5, Fuchsine basic 1%

2.3 Phương pháp và cỡ mẫu nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

2

2 2 / 1

) (

) 1

( ε

α

p

p p

tỷ lệ nhiễm HPV trên thế giới dao động từ 9 % đến 13%

Chúng tôi chọn cỡ mẫu với p = 7 6 %

3

% 11

% 9 9

% 8

1 + + =

: chọn là 0,4 —> n = 300

ε

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

2.4 Kỹ thuật nghiên cứu

Bệnh nhân được nằm trên bàn khám phụ khoa ở tư thế thuận lợi nhất cho

việc thăm khám và lấy bệnh phẩm

Bật bồn nước nóng, để ở nhiệt độ 56ºC, lấy các ống eppendoff 1,5ml,

số lượng ống tương ứng với số lượng mẫu cần tách Đánh số thứ tự các ống theo tiêu chuẩn qui định

Bệnh phẩm đã được bảo quản trong dung dịch đệm A, làm tan bằng

cách để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

Các bước tiến hành:

Bước 1: Lấy 180µl bệnh phẩm được bảo quản trong dung dịch A cho vào mỗi

ống eppendoff 1,5ml

Bước 2: Hòa tan protein có trong bệnh phẩm bằng cách cho 20µl QIAGIEN

proteinase (protein K), trộn đều nhờ vortex trong 15 giây

Bước 3: Ủ trong bồn nước nóng 56ºC trong 10 phút

Sau khi ủ, ly tâm nhanh (spindown) nhằm đưa các phần dính trên nắp

ống xuống phía dưới ống

Bước 4: Thêm 200 μl đệm AL vào ống, trộn nhờ máy vortex trong vòng 15

giây

Bước 5: Ủ ở 700C trong 10 phút Sau khi ủ ly tâm nhanh ống để loại bỏ dịch bám trên nắp

Bước 6: Thêm 200 μl ethanol 100º vào ống và trộn đều nhờ máy vortex trong

vòng 15 giây Sau khi trộn ly tâm nhanh ống để loại bỏ dịch bám trên nắp ống

Bước 7: Chuyển toàn bộ hỗn hợp sang ống eppendoff có cột (column spin) Bước 8: Đóng nắp kín, ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/1 phút, trong 1 phút

Bước 9: Chuyển cột sang tube 2ml mới

Bước 10: Cho thêm vào 500µl đệm AW1, ly tâm ở tốc độ 8000 vòng /1 trong

1 phút

Bước 11: Chuyển cột sang tube 2ml mới

Bước 12: Cho thêm vào 500µl đệm AW2, ly tâm ở tốc độ 8000 vòng trong 1

phút

Bước 13: Chuyển cột sang tube 1,5ml mới

Bước 14: Thu hồi ADN bằng 200µl đệm AE, để ở nhiệt độ phòng trong 1

phút sau đó ly tâm ở 8000 vòng trong 1 phút

Bước 15: Bảo quản mÉu ADN t¸ch triÕt ®−îc ở -20ºC cho tíi khi ph©n tÝch

2.4.2.2 Phản ứng PCR kiểm tra chất lượng mẫu ADN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện HPV Đây là kỹ thuật mang lại kết quả có độ tin cậy cao Kỹ thuật đòi hỏi người thực hiện phải tuân thủ một qui trình xét nghiệm chặt chẽ ngay từ khâu lấy bệnh phẩm

Bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản trong môi trường bảo quản tế bào (SDS 2%; Tris-HCL; 100 mM EDTA 10 mM) Chúng tôi sử dụng sinh phẩm QIAamp ADN Mini Kit để tách chiết ADN Để đánh giá hiệu quả tách chiết ADN, toàn bộ các mẫu ADN được kiểm tra bằng phản ứng PCR khuếch đại gien beta-globin với cặp mồi PCO3/PCO5 Cặp mồi PCO3/PCO5 có trình tự như sau:

PCO3: 5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’

PCO5: 5’-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3’

Các mẫu ADN có gien beta-globin được khuếch đại sẽ được phân tích

để xác định sự có mặt của HPV ADN, các mẫu không cho sản phẩm gien beta-globin sẽ phải tách triết lại

2.4.2.3 Phản ứng PCR phát hiện HPV

Một phản ứng PCR tối ưu giúp phát hiện và định type HPV cần phải áp dụng được với nhiều loại bệnh phẩm, cặp mồi phải được lựa chọn sao cho phản ứng PCR khuyếch đại được vùng gien đích có mặt trong genome của tất

cả các type HPV và vùng nằm giữa 2 mồi phải có dao động đủ lớn để thiết kế đầu dò đặc hiệu với từng type HPV phục vụ việc xác định type Hai gien L1

và E1 là ổn định nhất trong các type HPV, vì vậy các phương pháp phát hiện

và định type HPV dựa trên phản ứng PCR thường tập trung vào 2 gien này Toàn bộ 300 mẫu quệt cổ tử cung đã được kiểm tra phát hiện HPV bằng phản ứng PCR với cặp mồi GP5+/GP6+ khuếch đại một đoạn trình tự dài 150

, gien này không bị loại bỏ khi genome của

genome của tế bào vật chủ Trong phản ứng PCR này chúng tôi đã sử dụng thêm cặp mồi PCO3/PCO5 khuếch đại trình tự dài 209 bp của gien Beta globin, để kiểm tra hiệu quả việc tách triết ADN Kết quả phản ứng PCR chỉ được công nhận khi có sản phẩm đặc hiệu dài 209 bp, mẫu bệnh phẩm dương

tính với HPV sẽ cho sản phẩm PCR dài 150 bp, được phát hiện bằng điện di

và nhuộm với Ethidium Bromide, mẫu âm tính không có sản phẩm này

Các mồi GP5+/GP6+ có trình tự như sau:

Thành phần phản ứng Chu trình gia nhiệt

ADN 5μl

dNTP 1.6μl

PC03/05 1μl cho mỗi mồi

HPV type 16 và HPV type 18 là hai type nguy cơ cao gây nên ung thư

cổ tử cung gặp ở khắp nơi trên toàn cầu Vì vậy, việc phát hiện nhiễm HPV type 16 và HPV type 18 là rất quan trọng Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu E6F/R thiết kế nhằm khuếch đại gien đích có kích thước 321bp để phát hiện HPV type 16 và cặp mồi HPV 18F/R thiết kế nhằm khuếch đại gien đích(L1) có kích thước 561bp để phát hiện HPV type 18 Sau khi chạy PCR,

điện di sản phẩm trên gel agarose 1.5%, nhuộm EtBr và chụp UV

Hai type HPV có nguy cơ cao với UTCTC là HPV 16 và HPV 18 được

xác định bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ sinh học

• Phát hiện HPV 16

- Mồi E6F/E6R, khuếch đại gien E7, cho sản phẩm PCR dài 321 bp

- Điều kiện PCR

tử của đoạn ADN khuếch đại (tỷ lệ thuận so với số lượng nucleotide) và nồng

độ gel chạy

Các bước tiến hành:

Bước 1: Làm gel Agarose 1.5%

• Chuẩn bị thành phần để làm gel gồm: 160 ml dung dịch đệm TAE1X hoà với 2.4 g bột gel agarose

• Đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn (khoảng 12 phút), sau đó để nguội xuống khoảng 500C

• Đổ thạch vào khay điện di đã cài sẵn răng lược Sau khi gel đã đông khoảng 30 phút, gỡ lược ra, nếu sử dụng ngay thì đặt vào bể điện di còn

nếu chưa sử dụng ngay thì bao kín bằng giấy bóng và cho vào tủ lạnh bảo quản ở ngăn 40C

Bước 2: Đổ dung dịch đệm TAE1X vào bồn điện di cho tới khi ngập bản gel

độ khoảng 1-2 mm Khi pha gel bằng đệm TAE1X thì khi chạy điện di cũng nên chạy ở đệm TAE 1X để đảm bảo thu được kết quả tốt

Bước 3: Chuẩn bị bồn chứa EtBr bằng cách đổ 300 ml TAE1X vào hộp nhựa

màu tối sau đó cho thêm 15µl EtBr 10 mg/ml, đảo đều nhờ lắc nhẹ

Bước 4: Nhỏ mẫu ADN vào các giếng của bản gel

Lấy 7 µl sản phẩm PCR trộn với 1 µl đệm màu 6X (hợp chất này vừa có tác dụng tạo màu để quan sát quãng đường lớn nhất ADN đã đi vừa có tác dụng làm nặng ADN khiến ADN lắng xuống đáy giếng, không bị trôi lên mặt

và nhiễm sang các giếng khác) Dùng pipet man trộn đều và đưa vào các giếng nhỏ trong gel Chọn một giếng thích hợp để cho ADN thang Chạy điện

di ở hiệu diện thế 100V trong vòng 30 phút Chú ý chiều đặt thạch là hàng giếng phải đặt quay về phía cực âm Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol để biết khi nào nên dừng điện di

Lấy bản gel ra cho vào bồn chứa EtBr đã chuẩn bị, ngâm trong đó 10 phút, EtBr sẽ bám vào giữa hai mạch ADN

Lấy bản gel ra cho vào bồn chứa nước sạch độ 2 phút rồi chụp ảnh dưới ánh sáng của tia UV của máy chụp gel Tia UV kích thích EtBr phát ra ánh sáng ghi lại được

2.4.3 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh

Chuẩn bị: 2 lam kính có đánh số, 1 lam kính để soi tươi và 1 lam kính để

nhuộm gram soi trực tiếp

2.4.3.1 Soi trực tiếp

Lấy bệnh phẩm

Dùng que cấy vô trùng lấy bệnh phẩm ở 4 vị trí: được dàn mỏng, tròn, đều thành 4 điểm trên mỗi lam kính: tại niệu đạo, tuyến skene và tuyến bartholin, cổ tử cung, cùng đồ âm đạo Sau khi đã lấy bệnh phẩm ở niệu đạo, tuyến skene và tuyến bartholin dùng mỏ vịt bộc lộ CTC, dùng kẹp bông lau sạch khí hư và chất nhầy phủ trên bề mặt CTC rồi đưa nhẹ que cấy vào sâu CTC khoảng 2 cm để lấy dịch của CTC, vị trí lấy cuối cùng là cùng đồ âm đạo

Cố định tiêu bản

Bệnh phẩm sau khi lấy xong được cố định bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn với sức nóng vừa phải để giết chết vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyên được hình thể của chúng