2.3.1. Thiết kế nghiờn cứu
Thiết kế nghiờn cứu mụ tả cắt ngang.
2.3.2. Cỡ mẫu nghiờn cứu 2 2 2 2 / 1 ) . ( ) 1 ( ε α p p p Z − − Cỡ mẫu được tớnh theo cụng thức: n = Z : Hệ số tin cậy : Mα ức ý nghĩa thống kờ (với = 0,05 thỡ Z = 1,96 ). α p : Tỷ lệ nhiễm HPV ước tớnh là 0,076;
Dựa vào tỷ lệ phụ nữ nhiễm HPV thu được từ một số đề tài nghiờn cứu thớ
điểm tại huyện Súc Sơn - Hà Nội là 1,8%; tại quận 10 - TP HCM: 9,9%; và tỷ lệ nhiễm HPV trờn thế giới dao động từ 9 % đến 13%. Chỳng tụi chọn cỡ mẫu với p = 7.6% 3 % 11 % 9 . 9 % 8 . 1 + + = : chọn là 0,4 —> n = 300 ε
2.4. Kỹ thuật nghiờn cứu
• Kỹ thuật xỏc định HPV bằng PCR
• Kỹ thuật xột nghiệm vi sinh: Soi tươi, nhuộm Gram xỏc định cỏc bệnh lõy truyền qua đường tỡnh dục
• Kỹ thuật tế bào học, tỡm tế bào Koilocyte là tế bào nhiễm HPV và phỏt hiện cỏc loạn sản tế bào CTC
2.4.1. Chuẩn bị bệnh nhõn
Tất cả cỏc bệnh nhõn đến xột nghiệm đều được lập hồ sơ theo dừi,
được hỏi kỹ về họ tờn, tuổi, địa chỉ, nghề nghiệp, tiền sử bệnh phụ khoa để
trỏnh nhầm lẫn trong trả kết quả, trong việc quản lý số liệu.
Bệnh nhõn được nằm trờn bàn khỏm phụ khoa ở tư thế thuận lợi nhất cho việc thăm khỏm và lấy bệnh phẩm.
2.4.2. Kỹ thuật xỏc định HPV bằng PCR
2.4.2.1. Tỏch chiết ADN
Sinh phẩm, Húa chất:
QIAamp ADN mini kit (QIAGEN) Cồn 100º
Dụng cụ:
Ống eppendoff 1,5ml và 2 ml vụ trựng Bồn nước núng điều chỉnh được nhiệt độ
Mỏy ly tõm Mỏy vortex
Chuẩn bị:
Bật bồn nước núng, để ở nhiệt độ 56ºC, lấy cỏc ống eppendoff 1,5ml, số lượng ống tương ứng với số lượng mẫu cần tỏch. Đỏnh số thứ tự
Bệnh phẩm đó được bảo quản trong dung dịch đệm A, làm tan bằng cỏch đểở nhiệt độ phũng trong 30 phỳt.
Cỏc bước tiến hành:
Bước 1: Lấy 180àl bệnh phẩm được bảo quản trong dung dịch A cho vào mỗi
ống eppendoff 1,5ml.
Bước 2: Hũa tan protein cú trong bệnh phẩm bằng cỏch cho 20àl QIAGIEN proteinase (protein K), trộn đều nhờ vortex trong 15 giõy.
Bước 3: Ủ trong bồn nước núng 56ºC trong 10 phỳt.
Sau khi ủ, ly tõm nhanh (spindown) nhằm đưa cỏc phần dớnh trờn nắp
ống xuống phớa dưới ống.
Bước 4: Thờm 200 μl đệm AL vào ống, trộn nhờ mỏy vortex trong vũng 15 giõy.
Bước 5: Ủ ở 700C trong 10 phỳt. Sau khi ủ ly tõm nhanh ống để loại bỏ dịch bỏm trờn nắp.
Bước 6: Thờm 200 μl ethanol 100º vào ống và trộn đều nhờ mỏy vortex trong vũng 15 giõy. Sau khi trộn ly tõm nhanh ống để loại bỏ dịch bỏm trờn nắp ống.
Bước 7: Chuyển toàn bộ hỗn hợp sang ống eppendoff cú cột (column spin).
Bước 8: Đúng nắp kớn, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng/1 phỳt, trong 1 phỳt
Bước 9: Chuyển cột sang tube 2ml mới.
Bước 10: Cho thờm vào 500àl đệm AW1, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng /1 trong 1 phỳt.
Bước 11: Chuyển cột sang tube 2ml mới.
Bước 12: Cho thờm vào 500àl đệm AW2, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng trong 1 phỳt.
Bước 13: Chuyển cột sang tube 1,5ml mới.
Bước 14: Thu hồi ADN bằng 200àl đệm AE, để ở nhiệt độ phũng trong 1 phỳt sau đú ly tõm ở 8000 vũng trong 1 phỳt.
Bước 15: Bảo quản mẫu ADN tách triết đ−ợcở -20ºC cho tới khi phân tích.
2.4.2.2. Phản ứng PCR kiểm tra chất lượng mẫu ADN
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng kỹ thuật PCR để phỏt hiện HPV.
Đõy là kỹ thuật mang lại kết quả cú độ tin cậy cao. Kỹ thuật đũi hỏi người thực hiện phải tuõn thủ một qui trỡnh xột nghiệm chặt chẽ ngay từ khõu lấy bệnh phẩm.
Bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản trong mụi trường bảo quản tế bào (SDS 2%; Tris-HCL; 100 mM EDTA 10 mM). Chỳng tụi sử dụng sinh phẩm QIAamp ADN Mini Kit để tỏch chiết ADN. Để đỏnh giỏ hiệu quả tỏch chiết ADN, toàn bộ cỏc mẫu ADN được kiểm tra bằng phản ứng PCR khuếch đại gien beta-globin với cặp mồi PCO3/PCO5. Cặp mồi PCO3/PCO5 cú trỡnh tự
như sau:
PCO3: 5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’ PCO5: 5’-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3’
Cỏc mẫu ADN cú gien beta-globin được khuếch đại sẽ được phõn tớch
để xỏc định sự cú mặt của HPV ADN, cỏc mẫu khụng cho sản phẩm gien beta-globin sẽ phải tỏch triết lại.
2.4.2.3. Phản ứng PCR phỏt hiện HPV
Một phản ứng PCR tối ưu giỳp phỏt hiện và định type HPV cần phải ỏp dụng được với nhiều loại bệnh phẩm, cặp mồi phải được lựa chọn sao cho phản ứng PCR khuyếch đại được vựng gien đớch cú mặt trong genome của tất cả cỏc type HPV và vựng nằm giữa 2 mồi phải cú dao động đủ lớn để thiết kế đầu dũ đặc hiệu với từng type HPV phục vụ việc xỏc định type. Hai gien L1 và E1 là ổn định nhất trong cỏc type HPV, vỡ vậy cỏc phương phỏp phỏt hiện và định type HPV dựa trờn phản ứng PCR thường tập trung vào 2 gien này. Toàn bộ 300 mẫu quệt cổ tử cung đó được kiểm tra phỏt hiện HPV bằng phản ứng PCR với cặp mồi GP5+/GP6+ khuếch đại một đoạn trỡnh tự dài 150
, gien này khụng bị loại bỏ khi genome của
bp trờn gien L1 HPV gắn vào
genome của tế bào vật chủ. Trong phản ứng PCR này chỳng tụi đó sử dụng thờm cặp mồi PCO3/PCO5 khuếch đại trỡnh tự dài 209 bp của gien Beta globin, để kiểm tra hiệu quả việc tỏch triết ADN. Kết quả phản ứng PCR chỉ được cụng nhận khi cú sản phẩm đặc hiệu dài 209 bp, mẫu bệnh phẩm dương tớnh với HPV sẽ cho sản phẩm PCR dài 150 bp, được phỏt hiện bằng điện di và nhuộm với Ethidium Bromide, mẫu õm tớnh khụng cú sản phẩm này.
Cỏc mồi GP5+/GP6+ cú trỡnh tự như sau:
GP5 + 5’-TTTGTTACTGTGGTAGTACTAC -3’
GP6+5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3'
Cặp mồi này cho sản phẩm PCR cú độ dài 150 bp,
E6 E7 E1 E2 E5 L2 L1 E 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 GP5+/6+ 150bp 321 bp MY09/11 450bp HP18F/18R 561bp E6F/E6R Hỡnh 2.1: Sơđồ genome của HPV và vị trớ cỏc mồi sử dụng cho phản ứng PCR phỏt hiện HPV. Cặp mồi GP5+/GP6+ giỳp phỏt hiện cỏc type HPV, cặp mồi E6F/E6R và
Thành phần phản ứng Chu trỡnh gia nhiệt ADN 5μl 10XPCR Buffer 2μl dNTP 1.6μl PC03/05 1μl cho mỗi mồi GP5+/6+ 1μl cho mỗi mồi H2O 10μl Taq polymelase 0.4μl MgCl2 2μl Tổng thể tớch phản ứng 25μl 940C 5 phỳt Tổng hợp Beta-Globin 940C 1 phỳt 58 0C 30 giõy x 25 chu kỳ 720C 1 phỳt Tổng hợp giene L1 940C 1 phỳt 450C 30 giõy x 35 chu kỳ 720C 1 phỳt 40C giữ nhiệt 2.4.2.4. Phản ứng PCR xỏc định HPV 16 và HPV 18 bằng cặp mồi đặc hiệu
HPV type 16 và HPV type 18 là hai type nguy cơ cao gõy nờn ung thư
cổ tử cung gặp ở khắp nơi trờn toàn cầu. Vỡ vậy, việc phỏt hiện nhiễm HPV type 16 và HPV type 18 là rất quan trọng. Chỳng tụi đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu E6F/R thiết kế nhằm khuếch đại gien đớch cú kớch thước 321bp để phỏt hiện HPV type 16 và cặp mồi HPV 18F/R thiết kế nhằm khuếch đại gien
đớch(L1) cú kớch thước 561bp để phỏt hiện HPV type 18. Sau khi chạy PCR,
điện di sản phẩm trờn gel agarose 1.5%, nhuộm EtBr và chụp UV.
Hai type HPV cú nguy cơ cao với UTCTC là HPV 16 và HPV 18 được xỏc định bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi nhúm nghiờn cứu của Viện Cụng nghệ sinh học.
• Phỏt hiện HPV 16
- Mồi E6F/E6R, khuếch đại gien E7, cho sản phẩm PCR dài 321 bp - Điều kiện PCR
Thành phần phản ứng ADN 5 àl 10XPCR Buffer 2àl dNTP 2.5 mM 1.6àl E6F/E6R 1àl cho mỗi mồi H2O 12àl Taq polymelase 0.4àl MgCl2 2àl Tổng thể tớch phản ứng 25àl Chu trỡnh nhiệt 940C 5 phỳt 940C 1 phỳt 450C 30 giõy x 40 chu kỳ 720C 1 phỳt 40C giữ nhiệt • Phỏt hiện HPV 18
- Mồi HP18F/18R, khuếch đại gien L1, cho sản phẩm PCR dài 561 bp - Điều kiện PCR Thành phần phản ứng ADN 5 àl 10XPCR Buffer 2àl dNTP 2.5 mM 1.6àl HPV18F/18R 1àl cho mỗi mồi H2O 12àl Taq polymelase 0.4àl MgCl2 2àl Tổng thể tớch phản ứng 25àl
Chu trỡnh nhiệt 940C 5 phỳt 940C 1 phỳt 450C 30 giõy x 40 chu kỳ 720C 1 phỳt 40C giữ nhiệt 2.4.2.5. Điện di phỏt hiện sản phẩm PCR
Phương phỏp này dựng để phõn tớch định tớnh và bỏn định lượng trong việc thu nhận mẫu ADN.
Nguyờn tắc: dựa vào đặc tớnh của ADN là cỏc đại phõn tử tớch điện õm
đồng đều trờn khắp bề mặt nờn khi chịu tỏc động của điện trường cỏc phõn tử
này sẽ chuyển động từ cực õm sang cực dương. Quóng đường đi của ADN trong trường điện một chiều này phụ thuộc vào 2 chỉ tiờu là khối lượng phõn tử của đoạn ADN khuếch đại (tỷ lệ thuận so với số lượng nucleotide) và nồng
độ gel chạy.
Cỏc bước tiến hành:
Bước 1: Làm gel Agarose 1.5%
• Chuẩn bị thành phần để làm gel gồm: 160 ml dung dịch đệm TAE1X hoà với 2.4 g bột gel agarose.
• Đun trong lũ vi súng cho đến khi agarose tan hoàn toàn (khoảng 12 phỳt), sau đú để nguội xuống khoảng 500C.
• Đổ thạch vào khay điện di đó cài sẵn răng lược. Sau khi gel đó đụng khoảng 30 phỳt, gỡ lược ra, nếu sử dụng ngay thỡ đặt vào bểđiện di cũn
nếu chưa sử dụng ngay thỡ bao kớn bằng giấy búng và cho vào tủ lạnh bảo quản ở ngăn 40C.
Bước 2: Đổ dung dịch đệm TAE1X vào bồn điện di cho tới khi ngập bản gel
độ khoảng 1-2 mm. Khi pha gel bằng đệm TAE1X thỡ khi chạy điện di cũng nờn chạy ở đệm TAE 1X đểđảm bảo thu được kết quả tốt.
Bước 3: Chuẩn bị bồn chứa EtBr bằng cỏch đổ 300 ml TAE1X vào hộp nhựa màu tối sau đú cho thờm 15àl EtBr 10 mg/ml, đảo đều nhờ lắc nhẹ.
Bước 4: Nhỏ mẫu ADN vào cỏc giếng của bản gel
Lấy 7 àl sản phẩm PCR trộn với 1 àl đệm màu 6X (hợp chất này vừa cú tỏc dụng tạo màu để quan sỏt quóng đường lớn nhất ADN đó đi vừa cú tỏc dụng làm nặng ADN khiến ADN lắng xuống đỏy giếng, khụng bị trụi lờn mặt và nhiễm sang cỏc giếng khỏc). Dựng pipet man trộn đều và đưa vào cỏc giếng nhỏ trong gel. Chọn một giếng thớch hợp để cho ADN thang. Chạy điện di ở hiệu diện thế 100V trong vũng 30 phỳt. Chỳ ý chiều đặt thạch là hàng giếng phải đặt quay về phớa cực õm. Quan sỏt sự di chuyển của màu bromophenol để biết khi nào nờn dừng điện di.
Lấy bản gel ra cho vào bồn chứa EtBr đó chuẩn bị, ngõm trong đú 10 phỳt, EtBr sẽ bỏm vào giữa hai mạch ADN.
Lấy bản gel ra cho vào bồn chứa nước sạch độ 2 phỳt rồi chụp ảnh dưới ỏnh sỏng của tia UV của mỏy chụp gel. Tia UV kớch thớch EtBr phỏt ra ỏnh sỏng ghi lại được.
2.4.3. Kỹ thuật xột nghiệm vi sinh
Chuẩn bị: 2 lam kớnh cú đỏnh số, 1 lam kớnh để soi tươi và 1 lam kớnh để
2.4.3.1. Soi trực tiếp
Lấy bệnh phẩm
Dựng que cấy vụ trựng lấy bệnh phẩm ở 4 vị trớ: được dàn mỏng, trũn,
đều thành 4 điểm trờn mỗi lam kớnh: tại niệu đạo, tuyến skene và tuyến bartholin, cổ tử cung, cựng đồ õm đạo. Sau khi đó lấy bệnh phẩm ở niệu đạo, tuyến skene và tuyến bartholin dựng mỏ vịt bộc lộ CTC, dựng kẹp bụng lau sạch khớ hư và chất nhầy phủ trờn bề mặt CTC rồi đưa nhẹ que cấy vào sõu CTC khoảng 2 cm để lấy dịch của CTC, vị trớ lấy cuối cựng là cựng đồ õm đạo.
Cố định tiờu bản
Bệnh phẩm sau khi lấy xong được cố định bằng cỏch hơ trờn ngọn lửa
đốn cồn với sức núng vừa phải để giết chết vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyờn
được hỡnh thể của chỳng.
Nhuộm Gram
Tiến hành nhuộm tiờu bản theo cỏc bước nhuộm Gram, soi trờn kớnh hiển vi với độ phúng đại 1000X.
Đọc kết quả
Mụ tả hỡnh thể, tớnh chất bắt màu của vi khuẩn, vị trớ của cỏc vi khuẩn nhỡn thấy nằm ở đõu, trong hay ngoài bạch cầu đa nhõn.
Phương phỏp soi trực tiếp bằng nhuộm Gram là phương phỏp được sử
dụng để xỏc định hỡnh thể, tớnh chất bắt màu của vi khuẩn, xỏc định từng loại vi khuẩn cú mặt trờn đú và đỏnh giỏ tỡnh trạng viờm thụng qua số lượng bạch cầu đa nhõn trung tớnh trờn cỏc vi trường.
2.4.3.2. Soi tươi
Lam kớnh dựng cho soi tươi được nhỏ sẵn một giọt nước muối sinh lý, bệnh phẩm được lấy ở cựng đồ và soi ngay để tỡm Trichomonas.
2.4.4. Kỹ thuật xột nghiệm tế bào học cổ tử cung
Phương phỏp nhuộm PAP được ỏp dụng rộng rói cũng như đỏng tin cậy nhất hiện nay trong kỹ thuật nhuộm tế bào học cổ tử cung, là một kỹ thuật nhuộm đa sắc và cú tớnh chất phõn biệt. Thành phần của thuốc nhuộm gồm 3 dung dịch: Hematoxylin Harris, Orange G và dung dịch đa sắc. Hầu hết thành phần của thuốc nhuộm là cồn, nờn khi nhuộm, nguyờn sinh chất sẽ rất sỏng, tế
bào thấy rừ, dự trong phiến đồ tế bào hay bị chập hoặc tụ tập thành đỏm.
2.4.4.1. Kỹ thuật xột nghiệm
Lấy bệnh phẩm:
Bệnh phẩm cho xột nghiệm tế bào học cổ tử cung được lấy bằng quệt Ayrecải tiến vụ trựng.
Sau khi lấy xong bệnh phẩm cho xột nghiệm vi sinh, dựng bệt quẹt Ayre
đưa nhẹ đầu cú ngoàm của bệt quẹt vào trong ống CTC và bệnh phẩm được lấy qua cạo, gại bằng cỏch vừa tỳ nhẹ ngoàm vào vựng cổ ngoài vừa xoay từ
từ 360° bệt quẹt suốt dọc vựng chuyển tiếp giữa biểu mụ vảy và trụ. Trỏnh gõy chảy mỏu CTC, nhưng cũng đủ để lấy đỳng và đủ tế bào cho phộp chẩn
đoỏn dễ dàng.
Dàn phiến đồ
Dàn mỏng bệnh phẩm lờn mặt lam kớnh, trỏnh dàn đi dàn lại nhiều lần trờn lam kớnh, vỡ sẽ làm nỏt tế bào và tạo ra đỏm tế bào chồng chất khú nhận định.
Cốđịnh
Để đảm bảo cho nhuộm đẹp, phiến đồ luụn được bảo quản “phiến đồ ẩm”, được cố định bằng cồn-ete tỷ lệ 1/1 trước khi bị khụ trong khụng khớ.
Cỏch Đọc kết quả
Cỏc phiến đồ được đọc dưới kớnh hiển vi quang học cú độ phúng đại từ
40 đến 1000 lần, kết quả được ghi ở phần kết luận và được đỏnh dấu vào cỏc ụ mục cú sẵn trờn phiếu xột nghiệm.
Cỏc phiến đồ đều được tiến hành theo qui trỡnh nhuộm PAP, do đú đảm bảo được chi tiết của nhõn và sự biệt húa của bào tương rất rừ:
• Nhõn: xanh xỏm hoặc tớm. • Bào tương :
Cỏc tế bào ưa axit: đỏ hồng, đỏ tươi hoặc vàng da cam. Cỏc tế bào ưa bazơ: xanh sỏng, đụi khi xanh ve nhạt.
Cỏc tổn thương được phõn loại theo hệ thống phõn loại Bethesda 2001.
2.4.4.2. Phõn loại trong xột nghiệm tế bào học CTC (Papanicolaou)
Bảng 2.1. Một số cỏch phõn loại tổn thương CTC dựa trờn TBH
PAP
(1954) WHO (1968)
CIN
(1978) Bethesda (2001)
PI Khụng cú tế bào ỏc tớnh. Âm tớnh Bỡnh thường
Viờm khụng điển hỡnh Thay đổi do phản ứng Tế bào lỏt khụng điển hỡnh ASCUS, AGUS PII
Tế bào rỗng khụng điển hỡnh
Loạn sản nhẹ CIN I LSIL+Condyloma
Loạn sản vừa CIN II HSIL PIII
Loạn sản nặng CIN III HSIL
PIV Ung thư tại chỗ CIN III HSIL PV Ung thư xõm nhập Ung xõm nhthậưp Ung thư xõm nhập