Đặc điểm các gen mã hóa β lactamase phổ mở rộng ở một số vi khuẩn gram âm và nguy cơ lan truyền qua trung gian plasmid

2 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HOÀNG THU TRANG ĐẶC ĐIỂM CÁC GEN MÃ HÓA β-LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG Ở MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ NGUY CƠ LAN TRUYỀN QUA TRUNG GIAN PLASMID Chuyên ngành: Di Truyền Học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. STEPHEN BAKER Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 i ACKNOWLEDGEMENTS First and foremost I offer my sincerest gratitude to my supervisor, Dr. Stephen Baker, who has supported me thoughout my thesis with his patient guidance, encouragement and advice. I have been extremely lucky to have a supervisor who cared so much about my work. Without him, this thesis would not have been completed. I would like to thank Doctor James Campbell for his guide on clinical microbiology and his kindness to allow me working in good condition at the microbiology laboratory. ii LỜI CÁM ƠN Tôi muốn dành tặng những lời cảm ơn chân thành và thân thương nhất đến hai người bạn lớn của tôi là chị Thiếu Nga và Thanh Duy. Với tôi, họ thực sự là những bậc Thầy trong lab. Sự hiểu biết, sự năng động và những tình cảm mà họ dành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận cũng như sự quan tâm trong thời gian tôi viết bài là điều đáng giá nhất. Mong những điều t ốt đẹp nhất sẽ đến với họ. Xin gửi đến Thầy Phạm Văn Tới và chị Minh Viện lời cám ơn chân thành vì sự giúp đỡ nhiệt tình để tôi có cơ hội làm việc tại OUCRU. Xin gửi lời cám ơn chân thành đến bạn Sĩ Kiệt vì sự giúp đỡ nhiệt tình trong quá trình làm thí nghiệm. Cám ơn bạn Ngọc Dung, Phương Tú, Khánh Như đã là những người bạn thật dễ thương cũng như đ ã dành thời gian đọc bài và đóng góp nhiều ý kiến hữu ích. Xin chân thành cám ơn anh Hoàng và các anh chị phòng thí nghiệm vi sinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm việc. Xin chân thành cám ơn các Cô và chị ở phòng pha chế môi trường đã luôn hỗ trợ tôi kịp thời trong lúc làm thí nghiệm. Tôi sẽ không bao giờ quên các bạn ở OUCRU đã cho tôi một khoảng thời gian đầy ý nghĩa. Cám ơ n nhóm bi lắc với những buổi trưa thật tuyệt vời! iii Với sự biết ơn và trân trọng nhất tôi muốn dành cho Tiến sĩ Nguyễn Trọng Hiệp, người Thầy suốt đời của tôi. Thầy đã định hướng cho tôi những bước đi đầu tiên, đưa tôi đi khắp nơi và chọn cho tôi một điểm đến lý tưởng. Tôi cám ơn Thầy vì sự tận tâm hướng dẫn, theo dõi từng thí nghiệm của tôi và góp ý một cách khắc khe để tôi có thể làm tốt công việc của mình. Được làm việc với Thầy trong suốt thời gian qua, với tôi, đó là một trải nghiệm khoa học thật bổ ích. Tôi vô cùng biết ơn các Thầy Cô, các chị và các bạn ở Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. HCM đã hết sức giúp đỡ, động viên, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể làm tốt khóa luận của mình. Xin cám ơn và mãi kh ắc ghi những tình cảm ấm áp và sự quan tâm mà mọi người đã dành cho tôi. Tôi biết ơn các Thầy Cô ở trường Khoa Học Tự Nhiên đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Xin chân thành cám ơn Ban giám đốc và các đồng nghiệp ở Khoa Vi sinh Bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình lấ y mẫu bệnh phẩm. Tôi không bao giờ quên các bạn bè ở Khoa Dược, các bạn lớp Di Truyền K18 đã cùng tôi trong suốt thời gian làm việc, học tập. Xin gởi đến các bạn những lời cám ơn chân thành vì tình bạn, sự động viên và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua. iv Từ tận đáy lòng, tôi muốn gởi lời tri ân đến Ba Mẹ vì sự yêu thương, vì đã dành cho tôi những tình cảm trọn vẹn. Rất tự hào vì Ba Mẹ đã luôn bên tôi và mang đến cho tôi những giá trị gia đình thật sự, tổ ấm thân thương nhất trong cuộc đời tôi. Những lời thương yêu nhất tôi muốn dành cho ông xã Nguyễn Bình, người bạn suốt đời của tôi, vì những tình cảm ng ọt ngào, sự động viên và chia sẻ mà anh đã dành cho tôi. Tôi không quên những thiên thần đáng yêu, Thu Anh và Anh Thư, luôn luôn bên cạnh và mang đến cho tôi nhiều may mắn. Cuối cùng, tôi muốn gởi lời cám ơn đến tất cả những người thân trong gia đình, những người đã luôn quan tâm và quý mến tôi. Mong cho điều tốt đẹp nhất sẽ đến với mọi người. XUW v MỤC LỤC ACKNOWLEDGEMENTS i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH xi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ xii MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1 Tổng quan về họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) 4 1.1.1 Escherichia coli (E. coli) 4 1.1.2 Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) 5 1.2 Tổng quan về họ kháng sinh β -lactam 6 1.2.1 Kháng sinh họ β-lactam và cơ chế hoạt động 6 1.2.2 Cơ chế đề kháng β-lactam ở vi khuẩn 7 1.2.3 Phân loại β-lactam 8 1.3 Enzym β -lactamase 9 1.3.1 Định nghĩa 9 1.3.2 Phân loại 9 1.4 Enzym β -lactamase phổ mở rộng (ESBL) 11 1.4.1 Định nghĩa 11 1.4.2 Phân loại 11 vi 1.4.3  Phương pháp phát hiện kiểu hình ESBL 18 1.4.4 Phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen ESBL 19 1.5 Plasmid 20 1.6 Tình hình dịch tễ học của các vi khuẩn sinh ESBL. 20 1.6.1 Tình hình trên thế giới. 20 1.6.2 Tình hình Việt Nam 22 1.7 Dịch tễ học phân tử và sự phát tán các loại ESBL 23 1.7.1 Tình hình trên thế giới 23 1.7.2 Tình hình Việt Nam 24 Chương 2. VẬT LIỆU và PHƯƠNG PHÁP 26 2.1 Chủng vi khuẩn 27 2.2 Định danh họ vi khuẩn Enterobacteriacae 29 2.3 Xác định kiểu hình ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi 29 2.3.1 Nguyên tắc 29 2.3.2 Thực hiện 30 2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) các chủng sinh ESBL 30 2.5 Chiết DNA từ tế bào vi khuẩn 31 2.5.1 Tách chiết DNA bộ gen của vi khuẩn 31 2.5.2 Tách chiết plasmid theo phương pháp của Kadou – Liu [25]. 31 2.6 Phản ứng khuếch đại DNA xác định gen mã hóa ESBL 32 2.7 Tinh sạch DNA 33 2.8 Giải trình tự sản phẩm khuếch đại 34 2.9 Thí nghiệm tiếp hợp 35 vii 2.10  Lai DNA bằng phương pháp Southern Blot 36 2.10.1Chuyển DNA lên màng 36 2.10.2Đánh dấu mẫu dò 37 2.10.3Lai DNA với mẫu dò 38 2.10.4Phát hiện sự quang hóa của mẫu dò bởi ECL 39 Chương 3. KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 41 3.1 Kiểu hình ESBL của các vi khuẩn thử nghiệm 42 3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 42 3.1.2 Đặc điểm kiểu hình ESBL 42 3.2 Đặc điểm đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn sinh ESBL 43 3.3 Đặc điểm các gen mã hóa ESBL 45 3.3.1 Phản ứng khuếch đại gen (PCR) 45 3.3.2 Giải trình tự các gen bla TEM , bla CTX-M-1 , bla CTX-M-9 46 3.3.3 Phân tích plasmid của các chủng sinh ESBL 49 3.3.4 Lai Southern Blot xác định vị trí các gen bla trên plasmid 51 3.3.5 Khả năng tiếp hợp của các plasmid mang gen mã hóa ESBL 53 3.4 Bàn luận 55 Chương 4. KẾT LUẬN và ĐỀ NGHỊ 58 4.1 Kết luận 59 4.2 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO I PHỤ LỤC V viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg/ml Microgam/mililít BLAST Basic Local Alignment Search Tool (công cụ tìm trình tự t ương đồng) bp Base pair CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute (các tiêu chuẩn lâm sàng và tiêu chuẩn phòng thí nghiệm) CTX-M Loại ESBL có hoạt tính mạnh trên cef otaxime, được phân lập đầu tiên ở M unich dH 2 O Distilled water (nước cất) DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate ECL Enhanced Chemiluminescence (hóa phát quang tăng cường) EDTA Ethilendiaminetetraacetic acid ESBL Extended-spectrum beta-lactamase (β-lactamase phổ mở rộng) E-test Epsilometer test LB Môi trường Luria – Bertami LPS Lipopolysaccharide MIC Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) NCBI National Center for Biotechnology Information (trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học) OUCRU Oxford University Clinical Research Unit (Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Đại học Oxford tại Việt Nam) PBP Penicillin Binding Protein (protein gắn kết penicillin) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi) PCR-RFLP PCR - Restriction Fragment Length Polymorphis (PCR - đa hình độ dài các đoạn cắt bằng enzym hạn chế ) SHV S ulfhydryl reagent variable (một loại enzym β-lactamase) SMART Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (nghiên cứu về kiểm định khuynh hướng đề kháng kháng sinh) Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase ix TEM Tem oneira (một loại enzym β-lactamase được đặt theo tên của b ệnh nhân đầu tiên mang vi khuẩn tiết enzym này) TP. HCM Thành phố Hồ Chí Minh UV Ultra violet (tia tử ngoại) [...]... Khảo sát đặc điểm các gen mã hóa enzym ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh phẩm tại bệnh vi n Chợ Rẫy và bệnh vi n Thống Nhất thành phố Hồ Chí Minh - Đánh giá nguy cơ lan truyền các gen mã hóa ESBL này qua trung gian plasmid -3- Chương 1 TỔNG QUAN -4- 1.1 Tổng quan về họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae là một họ rất lớn, phân bố rộng trên... khi ở dạng mạch thẳng Plasmid có thể mang các gen có lợi cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn như các gen kháng kháng sinh, gen cần cho sự xâm nhiễm và gây độc của vi khuẩn vào tế bào chủ; hoặc các plasmid mang các gen mã hóa cho bacteriocin giúp vi khuẩn mang chúng cạnh tranh tốt với các vi khuẩn cùng loài không mang plasmid hoặc với các vi khuẩn khác loài Ngoài ra plasmid còn có thể mang các gen. .. lan truyền những gen này Phần lớn các gen mã hóa ESBL nằm trên các plasmid có kích thước khác nhau và có khả năng tiếp hợp cao Các plasmid kích thước lớn (hơn 50 kb) mang gen mã hóa ESBL cũng thường mang các gen đề kháng với các kháng sinh khác [9],[32] -2- Tại Vi t Nam có rất ít các nghiên cứu về cơ chế đề kháng cephalosporin cũng như cơ chế lan truyền các gen đề kháng này ở các vi khuẩn Gram âm Trước... Aztreonam -9- 1.3 Enzym β -lactamase 1.3.1 Định nghĩa Beta -lactamase là một enzym có khả năng thủy phân vòng β- lactam giúp cho vi khuẩn đề kháng lại với kháng sinh này Các β- lactamase được mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể hoặc trên các plasmid Trong đó, plasmid được xem là nguy n nhân chính làm phát tán tính đề kháng ở vi khuẩn [9] 1.3.2 Phân loại Ở vi khuẩn Gram dương, β- lactamase được tiết ra... giữa các nước trong cùng một vùng, và giữa các thành phố, bệnh vi n trong cùng một nước [38] Đáng lưu ý là, tần số xuất hiện vi khuẩn sinh ESBL ngày một gia tăng theo thời gian [32] 1.6.1 Tình hình trên thế giới Các chủng sinh ESBL được phân lập và phát hiện đầu tiên ở Châu Âu vào giữa thập niên 1980 trên các vi khuẩn họ Enterobacteriaceae, sau đó không lâu các vi khuẩn này được tìm thấy ở Mỹ và một số. .. SHV-12 rất phổ biến ở Nhật và Hàn Quốc cho đến nay [27] ESBL loại CTX-M bắt đầu xuất hiện ở châu Âu trên các vi khuẩn Enterobacteriaceae từ năm 1989 Với tốc độ lan truyền và gia tăng số lượng các biến thể một cách nhanh chóng, CTX-M đã thay đổi sự phân bố ESBL trên thế giới [24] Các ESBL loại CTX-M ngày càng chiếm ưu thế trên các vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là trên E coli và K pneumoniae phân lập ở các nước... hợp dương tính giả và âm tính giả Một số chủng K pneumoniae hoặc E coli không có ESBL nhưng lại sản xuất quá mức các β- lactamase loại TEM và SHV kháng clavulanic acid có thể cho kết quả dương tính giả Trường hợp âm tính giả xảy ra khi một số chủng đồng thời mang cả gen mã hóa AmpC -β- lactamase và ESBL Sự kết hợp này làm chúng trở nên đề kháng với clavulanic acid bởi tác động của AmpC -β- lactamase [29] -19-... vi khuẩn đường ruột có tầm quan trọng bậc nhất trong y học bởi có nhiều loài có khả năng gây bệnh ở người, trong đó có những loài có thể gây thành dịch [38] Chúng chiếm tới hơn 80% các vi khuẩn Gram âm gây bệnh ở người [34] Họ vi khuẩn này đứng đầu trong các nguy n nhân gây nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm khuẩn huyết Ngoài ra, chúng có thể gây vi m đường mật, vi m phổi... MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : Sự khuếch tán của kháng sinh qua thành tế bào và sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm 7  Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các nhóm kháng sinh họ β- lactam 8  Hình 1.3 Vị trí và kiểu thay thế amino acid ở β- lactamase loại TEM 15  Hình 1.4 : Vị trí và kiểu thay thế amino acid ở β- lactamase loại SHV 16  Hình 1.5 : Sự phân nhóm của CTX-M và vị trí các. .. penicillinase trong khi phụ nhóm 2b là các lactamase phổ rộng do chúng có khả năng bất hoạt cả penicillin và cephalosoprin Phụ nhóm 2b lại bao gồm 2be và 2br Trong đó, 2be là các β- lactamase phổ mở rộng hay ESBL (ký tự “e” trong 2be nghĩa là mở rộng – extended) gồm các biến thể của TEM và SHV, các β- lactamase mới xuất hiện như CTX-M, VEB, PER, GES, IBC,… Loại 2br là các biến thể khác của TEM hoặc SHV . NGUY N HOÀNG THU TRANG ĐẶC ĐIỂM CÁC GEN MÃ HÓA β-LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG Ở MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ NGUY CƠ LAN TRUYỀN QUA TRUNG GIAN PLASMID Chuyên ngành: Di Truyền Học Mã số: . các gen đề kháng này ở các vi khuẩn Gram âm. Trước tình hình đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu: - Khảo sát đặc điểm các gen mã hóa enzym ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram âm. bệnh vi n Chợ Rẫy và bệnh vi n Thống Nhất thành phố Hồ Chí Minh. - Đánh giá nguy c ơ lan truyền các gen mã hóa ESBL này qua trung gian plasmid. -3- Chương 1. TỔNG QUAN -4- 1.1 Tổng quan