Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được chạy phản ứng PCR giải trình tự bằng bộ kít BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystem) với các thành phần và chương trình như Bảng 2.4 và Bảng 2.5.
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng giải trình tự
Thành phần Thể tích
BigDye 1 µl
Dung dịch đệm 5X 2 µl
Mồi xuôi hoặc mồi ngược 10 µM 0,5 µl
DNA mục tiêu 5 – 20 ng
Nước cất vừa đủ 10 µl
Bảng 2.5 Chương trình phản ứng PCR giải trình tự
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
Biến tính 960C 1 phút 1 chu kỳ Biến tính 960C 10 giây 25 chu kỳ Bắt cặp 500C 5 giây Kéo dài 600C 4 phút Bảo quản 40C
Sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự được tủa với ethanol, EDTA và natri oxalate theo các bước sau :
‐ Chuẩn bị ống eppendorf vô trùng cho mỗi mẫu.
‐ Cho vào mỗi ống eppendorf 4 µl dung dịch dừng phản ứng (gồm 2 µl NaOAc 3M, pH 5,2 và 2 µl EDTA 100 mM, pH 8,0).
‐ Chuyển 10 µl sản phẩm PCR giải trình tự vào ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch dừng phản ứng và trộn kỹ.
‐ Thêm 70 µl ethanol lạnh 95% và trộn kỹ. Ngay lập tức đem ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Sau đó loại bỏ dịch nổi (ethanol). ‐ Rửa tủa 2 lần, mỗi lần với 200 µl ethanol lạnh 70%. Lưu ý tránh làm tróc cắn
DNA. Ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Loại bỏ dịch nổi (ethanol).
‐ Làm khô bằng máy hút chân không trong 15 phút.
‐ Hòa tan tủa DNA trong 10 µl dung dịch nạp mẫu HiDi formamide (Applied Biosystem). Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để DNA tan hoàn toàn.
Trình tự DNA được xác định bằng máy giải trình tự (Applied Biosystem). Sau đó, trình tự DNA được phân tích bằng phần mềm BioEdit và Vector NTI Suite 7. Các trình tự này được so sánh với các trình tự đã được công bố trên Ngân hàng Gen của NCBI.