Xử lý bản gel chứa plasmid của các chủng sinh ESBL sau khi chạy điện di:
- Chiếu tia UV vào bản gel agarose trong 5 phút.
- Đặt gel agarose vào hộp nhựa, thêm vào 500 mL dung dịch làm sạch, lắc nhẹ đều trong 20 phút. Rửa gel với nước cất, đổ bỏ nước cất.
- Ngâm gel trong 500 mL dung dịch biến tính lắc nhẹ đều trong 15 phút. Rửa gel với nước cất.
- Ngâm lắc gel trong dung dịch trung hòa trong 30 phút. Rửa gel với nước cất.
- Chuyển bản gel vào dung dịch 2X SSC, chuẩn bị cho chuyển màng bằng máy hút chân không.
Chuyển DNA lên màng:
- Chuẩn bị máy hút chân không.
- Cắt màng lai Hybond N+ (Amersham) có kích thước bằng bản gel agarose, làm ướt màng với dung dịch 2X SSC.
- Đặt các thành phần trong bộ chuyển màng của máy hút chân không theo thứ tự lần lượt: vòng cao su → miếng đệm hút chân không → giấy lọc Whatman → màng lai → tấm nylon → gel agarose → khung chặn (Hình 2.3).
- Đổ dung dịch 6X SSC ngập bề mặt gel và bắt đầu chuyển DNA lên màng. Trong quá trình chuyển màng thỉnh thoảng thêm dung dịch 6X SSC để gel không bị khô. Thời gian chuyển màng là 90 phút, áp suất khoảng 5 atm.
- Sau khi chuyển, DNA trên màng được cố định bằng tia UV (120000 µJ/cm2).
Hình 2.3 Chuyển DNA lên màng bằng máy hút chân không 2.10.2Đánh dấu mẫu dò
Mẫu dò được đánh dấu bằng bộ kit ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection Systems (Amersham).
Nguyên tắc :
Mẫu dò DNA được đánh dấu trực tiếp bằng enzym horseradish peroxidase. Các mẫu dò được biến tính hoàn toàn chỉ còn mạch đơn. Enzym peroxidase trong phức hợp với polymer tích điện dương được thêm vào, tạo liên kết lỏng lẻo với mẫu dò DNA bằng liên kết ion. Sau đó glutaraldehyde được thêm vào giúp hình thành các liên kết hóa học chéo và mẫu dò gắn với enzym bằng liên kết cộng hóa trị. Mẫu dò sau khi được đánh dấu sẵn sàng để lai với DNA mục tiêu đã được cố định lên màng (Hình 2.4).
Hình 2.4 Nguyên lý đánh dấu mẫu dò của bộ kít ECL Thực hiện :
- Biến tính 100 ng DNA mẫu dò ở 990C trong 5 phút. Ngay lập tức ủ trên đá trong 5 phút.
- Bổ sung 10 µl hóa chất đánh dấu mẫu dò, trộn đều. Bổ sung 10 µl glutaraldehyde, ủ ở 370C trong 10 phút. Giữ trên đá cho đến khi thực hiện lai.
2.10.3Lai DNA với mẫu dò
Xử lý màng DNA trước khi thực hiện lai :
- Đặt màng DNA vào ống thủy tinh dùng để lai, rửa với 30 mL dung dịch 2X SSC.
- Đổ bỏ dung dịch 2X SSC, thêm vào 10 mL dung dịch tiền lai, để ống thủy tinh quay đều từ 30 đến 50 phút ở 420C, tốc độ quay 50 vòng/phút.
Lai mẫu dò với DNA mục tiêu :
- Bổ sung 100 ng mẫu dò sau khi đánh dấu vào dung dịch tiền lai, ủ màng lai trong dung dịch lai qua đêm ở 420C, tốc độ quay 50 vòng/phút.
Rửa màng: sau khi lai, màng lai được rửa bằng dung dịch đệm rửa để loại các mẫu dò không lai được với DNA mục tiêu.
Thực hiện :
- Rửa màng lai 2 lần, mỗi lần 20 phút với 50 mL dung dịch đệm rửa sau lai ở 420C, tốc độ quay 50 vòng/phút.
- Rửa với 30 mL dung dịch 2X SSC, mở cửa bồn lai và quay ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Chuyển màng lai vào khay nhựa chứa 400 mL 2X SSC và rửa lắc ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó, tiến hành hiện phim.
2.10.4Phát hiện sự quang hóa của mẫu dò bởi ECL Nguyên tắc : Nguyên tắc :
Màng DNA sau lai được ngâm vào trong dung dịch chứa hóa chất phát hiện 1 và 2. Hóa chất phát hiện 1 phân giải hydrogen peroxide (cơ chất của peroxidase), kích thích hóa chất phát hiện 2 thực hiện phản ứng tạo sáng. Ánh sáng tạo ra tăng dần và được kéo dài bởi sự hiện diện của chất cảm ứng. Tín hiệu ánh sáng tạo ra được phát hiện trên phim nhạy với ánh sáng xanh (Hình 2.5)
Hình 2.5 Nguyên tắc hiện phim Thực hiện :
- 12 mL hóa chất phát hiện 1 và 12 mL hóa chất phát hiện 2 được chứa trong 2 tube riêng biệt.
- Chuyển màng vào khay nhựa, nhanh chóng trộn đều hai hóa chất phát hiện và đổ vào khay, lắc đều nhẹ nhàng trong 1 phút 30 giây ở nhiệt độ phòng.
- Đổ bỏ dung dịch trên và đặt màng vào giữa 2 tấm nylon, dùng khăn giấy vuốt cho ráo nước và các bọt khí còn lại trên màng, đánh dấu màng.
- Đặt tấm nylon chứa màng DNA vào trong hộp phim (hypercassette) và đặt film lên trên, đóng kín hộp phim và ủ trong 60 phút. Lưu ý, các bước thao tác với film phải được làm trong bóng tối hoặc ánh sáng được khuyến cáo là không ảnh hưởng đến film.
3.1 Kiểu hình ESBL của các vi khuẩn thử nghiệm
3.1.1 Đặc điểm lâm sàng
Từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2010, chúng tôi đã thu thập được 32 chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae có kiểu hình ESBL gồm 23 chủng E. coli và 9 chủng K. pneumonia. Trong đó, 24 chủng phân lập được ở bệnh viện Chợ Rẫy (21 chủng E. coli và 3 chủng K. pneumonia) và 8 chủng ở bệnh viện Thống Nhất (2 chủng E. coli và 6 chủng K. pneumonia). Các thông tin lâm sàng cho thấy các vi
khuẩn được phân lập chủ yếu từ các bệnh phẩm như đàm, dịch ổ bụng, dịch mủ, phân và vết loét. Trong đó, tỉ lệ vi khuẩn phân lập ở nam là 62,5% (20/32) cao hơn 1,7 lần so với tỉ lệ vi khuẩn phân lập nữ là 37,5% (12/32) (Bảng 4.3).
3.1.2 Đặc điểm kiểu hình ESBL
Thử nghiệm hiệp lực đĩa đôi đã xác định được 32 chủng có kiểu hình ESBL (Hình 3.1). Trong đó, 30/32 chủng dương tính với hai cặp đĩa (ceftazidim/ceftazidim + clavulanic acid và cefotaxim/ cefotaxim + clavulanic acid); 2/32 chủng dương tính với 1 cặp đĩa (cefotaxim/ cefotaxim + clavulanic acid) gồm một chủng E. coli ở bệnh viện Chợ Rẫy (EC11) và một chủng K. pneumoniae ở bệnh viện Thống Nhất (KT4).
Hình 3.1: Các dạng kiểu hình ESBL
A, B, C: dương tính với hai cặp đĩa; D: dương tính với một cặp đĩa
3.2 Đặc điểm đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn sinh ESBL
Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh được thực hiện trên các chủng sinh ESBL sử dụng thanh E-test (AB Biodisk) với 8 loại kháng sinh: amoxicillin/ clavulanic acid, cefepime, ceftriaxone, chloramphenicol, ciprofloxacin, imipenem, nalidixic acid, trimethoprim/ sulfamethoxazole.
Các chủng vi khuẩn mang gen mã hóa ESBL đề kháng hoàn toàn với ceftriaxone, trong đó hơn 84% (27/32) các chủng vi khuẩn có giá trị MIC ≥ 256 µg/mL. Bên cạnh đó, các kháng sinh ciprofloxacin, nalidixic acid và trimethoprim/ sulfamethoxazole đều bị đề kháng ở mức rất cao, trên 80%. Tuy nhiên, các chủng ESBL dương tính cho thấy nhạy cảm hoàn toàn với imipenem một kháng sinh thuộc nhóm carbapemens. Các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu không kháng với amoxicillin/ clavulanic acid, tuy nhiên tỉ lệ kháng trung gian vẫn đáng lo ngại ở mức 56,3% (Biểu đồ 3.1).
Các vi khuẩn sinh ESBL trong thử nghiệm có khả năng đề kháng với nhiều loại kháng sinh cùng lúc, chủ yếu là các kháng sinh ciprofloxacin, chloramphenicol, nalidixic acid và trimethoprim/ sulfamethoxazole (Bảng 3.1). Hơn 80% các chủng thử nghiệm (26/32 chủng) đề kháng từ 4 – 6 kháng sinh khác nhau. Duy nhất một chủng K. pneumoniae chỉ đề kháng 1 loại kháng sinh (Bảng 4.3).
Nhận xét: các vi khuẩn sinh ESBL đề kháng đồng thời với các kháng sinh ciprofloxacin, nalidixic acid, chloramphenicol và trimetoprim-sulfametoxazole với tỉ lệ > 80%.
Biểu đồ 3.1: Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng sinh ESBL
(XL: amoxicillin/ clavulanic acid; PM: cefepime; TX: ceftriaxone; CL: chloramphenicol; CI: ciprofloxacin; IMP: imipenem; NA: nalidixic acid; TS: Trimethoprim/ sulfamethoxazole)
Bảng 3.1: Kiểu hình đề kháng kháng sinh ở các chủng vi khuẩn sinh ESBL
Vi khuẩn Số chủng Số kháng sinh bkháng ị Kiểu hình đa kháng E. coli (n = 23) CR 3 6 PM-CL-TX-CI-NA-TS 1 5 PM-TX-CI-NA-TS 5 5 CL-TX-CI-NA-TS 8 4 TX-CI-NA-TS 1 4 PM-TX-CI-NA 1 3 CL-TX-TS 1 3 TX-CI-NA 1 2 CL-TX TN 2 4 TX-CI-NA-TS K. pneumoniae (n=9) CR 3 5 CL-TX-CI-NA-TS TN 1 6 PM-CL-TX-CI-NA-TS 2 5 CL-TX-CI-NA-TS 1 3 CL-TX-TS 1 2 TX-TS 1 1 TX
PM: cefepime; TX: ceftriaxone; CL: chloramphenicol; CI: ciprofloxacin; NA: nalidixic acid; TS:
3.3 Đặc điểm các gen mã hóa ESBL
3.3.1 Phản ứng khuếch đại gen (PCR)
Các chủng vi khuẩn sau thử nghiệm đĩa đôi có kiểu hình ESBL được xác định kiểu gen thông qua phản ứng khuếch đại DNA với các cặp mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen blaTEM, blaSHV, blaCTX.
Kết quả điện di cho thấy, 100% chủng (32/32 chủng) mang gen blaCTX-M; 75% chủng (24/32 chủng) mang blaTEM và không có chủng nào mang blaSHV. Trong các chủng sinh blaTEM thì E. coli chiếm 75% (18/24 chủng) và K. pneuminiae chiếm 25% (6/24 chủng).
Các chủng dương tính với blaCTX-M được tiếp tục thực hiện phản ứng PCR với các mồi đặc hiệu với các gen nhóm blaCTX-M-1, blaCTX-M-2, blaCTX-M-9 để xác định các biến thể của gen này. Kết quả điện di cho thấy, các chủng mang gen blaCTX-M-1
thì không mang blaCTX-9 và ngược lại; chỉ duy nhất một chủng E. coli (EC2) mang cả hai loại gen này. Ngoài ra, không có chủng nào mang gen blaCTX-M-2.
Cụ thể, 18/32 chủng mang gen blaCTX-M-1 và 15/32 chủng mang gen blaCTX-M-9, kết quả thể hiện bằng một vạch với kích thước 876 bp trên bảng điện di (Hình 3.2). Trên hình, chủng EC17, ET1, ET2 có xuất hiện một số vạch nhưng không đúng kích thước 876 bp thì không được xem là dương tính với cặp mồi CTX-M-1.
Trong các chủng mang blaCTX-M, tỉ lệ E. coli mang blaCTX-M-1 và blaCTX-M-9 là như nhau (12/23 chủng); ở K. pneumonia là 6/9 chủng mang blaCTX-M-1 và 3/9 chủng mang blaCTX-M-9 (Bảng 3.2).
Hình 3.2 : Kết quả điện di với các cặp mồi CTX-M-1 (lane 1), CTX-M-9 (lane 2), TEM (lane 3), của 32 chủng thử nghiệm. Chứng âm (Neg. Ctrl), Chứng dương (Pos. Ctr).
3.3.2 Giải trình tự các gen blaTEM, blaCTX-M-1, blaCTX-M-9
Chúng tôi tiến hành giải trình tự các gene blaTEM, blaCTX-M-1, blaCTX-M-9 sau khi đã có kết quả khuếch đại dương tính với cặp mồi đặc hiệu. Trình tự các sản phẩm DNA sau đó được so sánh với cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen NCBI bằng chương trình Nucleotide BLAST.
‐ Trình tự gen blaTEM :
Mặc dù sản phẩm khuếch đại của gen blaTEM nằm trong vùng bảo tồn nhưng chúng tôi vẫn giải trình tự để xác định bất kỳ đột biến nào xuất hiện trong vùng này. Trình tự DNA của 24 sản phẩm TEM của 18 chủng E. coli và 6 chủng K.
pneumoniae được so sánh độ tương đồng với gen blaTEM-1 (mã số J01749). Kết quả cho thấy, cặp mồi khuếch đại một đoạn trình tự dài 296 bp từ vị trí 228 đến 524 của gen mã hóa cho TEM-1. Trình tự của 2/24 chủng (KT1 và KC5) tương đồng 100% với TEM-1; 22/24 chủng còn lại xuất hiện một đột biến im lặng ở vị trí 396 (GCG → GCT) mã hóa cho Ala132 (Hình 3.3).
Hình 3.3: Kết quả phân tích trình tự gen blaTEM bằng phần mềm Vector NTI Suite 7 ‐ Trình tự gen blaCTX-M-1 :
Trình tự gen blaCTX-M-1 của 18 chủng vi khuẩn (12 chủng E. coli và 6 chủng
K. pneumoniae) được so sánh độ tương đồng với các gen đã được công bố trước đó
trên Genbank. Sau khi so sánh chúng tôi xác định được 3 biến thể của gen blaCTX-M-1 là blaCTX-M-3 (mã số Y10278) , blaCTX-M-15 (mã số AY044436.1) và blaCTX-M-55 (mã số DQ885477.1) (Hình 3.4).
Trong ba biến thể thuộc nhóm blaCTX-M-1, chiếm ưu thế nhất là blaCTX-M-15
với 15/18 chủng; bao gồm 10 chủng E. coli và 5 chủng K. pneumoniae. Hai biến thể còn lại blaCTX-M-55 và blaCTX-M-3 chỉ xuất hiện lần lượt ở 2/18 và 1/18 chủng (Bảng 3.2).
Hình 3.4: Kết quả phân tích trình tự gen blaCTX-M-1 bằng phần mềm Vector NTI Suite 7
‐ Trình tự gen blaCTX-M-9:
Trình tự gen blaCTX-M-9 của 15 chủng vi khuẩn (12 chủng E. coli và 3 chủng
K. pneumoniae) được so sánh độ tương đồng với các gen đã được công bố trên Genbank (Hình 3.5). Chúng tôi đã xác định được 2 biến thể của gen blaCTX-M-9 là
blaCTX-M-14 (mã số AF252622.2) , blaCTX-M-27 (mã số AY156923.1).
Trong đó, 4/15 chủng mang blaCTX-M-14 và 11/15 chủng blaCTX-M-27. Trong các chủng mang blaCTX-M-14, một chủng ET1 mang đột biến im lặng tại vị trí 507 (GAA Æ GAG), mã hóa cho glutamic acid. Các chủng còn lại đều có trình tự tương đồng 100% với các gen tương ứng (Hình 3.5).
Tất cả các chủng mang blaCTX-M-14 đều là E. coli; trong khi blaCTX-M-27 phát hiện ở 8 vi khuẩn E. coli và 3 vi khuẩn K. pneumoniae.
Hình 3.5: Kết quả phân tích trình tự gen blaCTX-M-9 bằng phần mềm Vector NTI Suite 7
Nhận xét: 100% các chủng có kiểu hình ESBL qua thử nghiệm đĩa đôi đều mang gen blaCTX-M. 75% các chủng mang thêm cả β-lactamase loại TEM. Các blaCTX-M-15,
blaCTX-M-14, blaCTX-M-27 là các gen phổ biến ở vi khuẩn E. coli và K. pneumoniae, đặc biệt là blaCTX-M-15 chiếm tỉ lệ cao nhất trong tổng số gen blaCTX-M (15/32 chủng)
3.3.3 Phân tích plasmid của các chủng sinh ESBL
Các chủng sinh ESBL được tách chiết plasmid theo quy trình tách chiết có cải tiến của Kado-Liu [25]. Các plamid sau đó được điện di, chụp hình và phân tích bằng phần mềm Bionumerics (Hình 3.6).
Kết quả phân tích plasmid của 32 chủng thử nghiệm cho thấy, tất cả các chủng sinh ESBL đều mang ít nhất một plasmid có kích thước lớn từ 50 đến 171 kb. Bên cạnh đó, còn mang nhiều loại plasmid khác có kích thước từ 1 đến 50 kb (Bảng 4.3).
Số lượng và kích thước các plasmid khác nhau ở mỗi chủng. Có 3 chủng (EC7, EC9, ET1) chỉ mang một plasmid duy nhất với kích thước từ 124 đến 157 kb.
Đa số các chủng mang nhiều loại plamid, đặc biệt chủng KC1 mang đến 9 plasmid khác nhau, kích thước từ 2 kb đến 171 kb (Bảng 4.3). Số lượng và kích thước plasmid không mang tính đặc trưng cho từng loài E. coli và K. pneumoniae.
Sau khi phân tích độ tương đồng dựa trên số lượng và kích thước của các plasmid trên gel, chúng tôi nhận thấy có hai nhóm chủng mang các plasmid có độ tương đồng cao (Hình 3.6). Nhóm 1 bao gồm các chủng EC5, EC20, EC22, KT7, và nhóm 2 bao gồm EC7, EC9, ET1. Tuy nhiên, các chủng chứa các plasmid có độ tương đồng cao có nguồn gốc phân lập rất khác nhau. Trong nhóm 1 là các chủng E.
coli phân lập từ mẫu dịch ổ bụng (EC5, EC22) và mẫu phân (EC20) tại bệnh viện
Chợ Rẫy, chủng K. pneumoniae được phân lập từ mẫu đàm (KT7) tại bệnh viện Thống Nhất. Các chủng thuộc nhóm 2 được phân lập từ mẫu dịch ổ bụng (EC7, EC9) tại bệnh viện Chợ Rẫy và mẫu bệnh phẩm đàm (ET1) tại bệnh viện Thống Nhất (Bảng 4.3).
Hình 3.6 : Độ tương đồng các plasmid của 32 chủng vi khuẩn được phân tích bằng
phần mềm Bionumerics dựa trên độ tương quan về kích thước các plasmid.
3.3.4 Lai Southern Blot xác định vị trí các gen bla trên plasmid
Nhằm xác định sự phân bố của các gen ESBL là trên nhiễm sắc thể hay plasmid và kích thước của các plasmid mang các gen này chúng tôi thực hiện thử nghiệm lai DNA bằng phương pháp Southern Blot. Với mẫu dò là các sản phẩm khuếch đại gen blaTEM, blaCTX-M-1 và blaCTX-M-9 được đánh dấu bằng bộ kít ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection Systems (Amersham). Các trình tự đích là DNA plasmid trên agarose gel được chuyển lên màng nylon (Hybond N+,