Sự phát tán các ESBL bắt nguồn từ châu Âu sau đó lan sang châu Mỹ và các nước châu Á [29]. ESBL SHV là loại chủ yếu ở châu Á vào những năm 1990, đặc biệt là SHV-5 và SHV-12 rất phổ biến ở Nhật và Hàn Quốc cho đến nay [27]. ESBL loại CTX-M bắt đầu xuất hiện ở châu Âu trên các vi khuẩn Enterobacteriaceae từ năm 1989. Với tốc độ lan truyền và gia tăng số lượng các biến thể một cách nhanh chóng, CTX-M đã thay đổi sự phân bố ESBL trên thế giới [24]. Các ESBL loại CTX-M ngày càng chiếm ưu thế trên các vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là trên E. coli và K. pneumoniae phân lập ở các nước châu Âu, châu Mỹ Latin và châu Á – Thái Bình Dương [13] (Hình 1.7). Ngoài ra, còn có các ESBL loại VEB, GES ⁄ IBC, PER, TLA, BES và SFO hiện diện với tỉ lệ thấp [18].
Các gen blaCTX-M chiếm đến 83% và 71% lần lượt ở vi khuẩn E. coli và K.
pneumoniae, trong khi blaSHV chỉ chiếm 28% (E. coli) và 41% (K. pneumoniae), và
blaTEM chiếm tỉ lệ không đáng kể trong một nghiên cứu đa quốc gia trên các vi khuẩn E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL năm 2008. Nghiên cứu này đã cho thấy được khuynh hướng phân bố ESBL trên thế giới, nhất là sự phân bố rộng khắp của CTX-M-15[13].
Enzym CTX-M-15 lần đầu tiên phát hiện ở Ấn Độ năm 2001 [20], đến nay đã trở thành enzym phổ biến ở các nước châu Á [27] và trên khắp thế giới [32]. Enzym này nằm trên các plasmid thuộc nhóm IncFII trong hệ thống phân loại theo tính không tương hợp của plasmid (plasmid incompatibility) , có kích thước từ 85 đến 160 kb. Hầu hết, các plasmid chứa blaCTX-M-15 cũng đồng thời mang gen blaTEM-
1, blaOXA-1 và aac(6′)-Ib-cr (aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase loại Ib-cr có vai trò trong sự đề kháng với cả aminoglycosid và một số fluoroquinolon). Gen blaCTX-
M-15 nằm cạnh trình tự ISEcp1 - trình tự có khả năng gắn chèn - được cho là di chuyển từ nhiễm sắc thể của vi khuẩn Kluyvera [39].
Trong một nghiên cứu ở Trung Quốc năm 2009 trên các vi khuẩn K. pneumonia mang cả AmpC và ESBL, lại cho thấy blaTEM và blaCTX-M có tần số xuất hiện cao nhất lần lượt là 77,8% và 50%. Một vài chủng vi khuẩn có thể mang một lúc đến 6 gen mã hóa β-lactamase trong đó chủ yếu là TEM-1, TEM-11, SHV-13, SHV-28, CTX-M-9, CTX-M-22, CTX-M-55, OXA-1, LEN, OKP-6 and DHA-1. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng, các gen mã hóa cho SHV-28, CTX-M-22, CTX-M- 55 dễ dàng được truyền từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác thông qua tiếp hợp. Khi kiểm tra kiểu hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn cho và vi khuẩn nhận đã chứng minh được đề kháng các β-lactam và aminoglycoside luôn song hành cùng nhau. Ngoài ra, sự hiện diện của nhiều gen mã hóa β-lactamase (nhiều ESBL hay cả AmpC và ESBL) trong cùng một chủng vi khuẩn sẽ làm thay đổi kiểu hình đề kháng gây khó khăn trong việc xác định kiểu hình ESBL[35].
Hình 1.7: Sự phân bố kiểu gen CTX-M trên thế giới, số liệu năm 2009[32] 1.7.2 Tình hình Việt Nam
Có rất ít các nghiên cứu tại Việt Nam về những gen chịu trách nhiệm sinh ESBL cũng như plasmid mang các gen này. Một nghiên cứu năm 2001 tại các bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh, cho thấy các gen mã hóa cho TEM, SHV, CTX-M và VEB-1 chiếm tỉ lệ lần lượt là 76,3%, 38,1%, 25,5% và 25,5%; với sự hiện diện
độc lập hoặc kết hợp nhiều gen trong cùng một vi khuẩn sinh ESBL. Trong đó, chủ yếu là các gen mã hóa TEM-1, SHV-1, SHV-2, CTX-M-14, CTX-M-17 và VEB-1 ở các vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae và P. mirabilis. Nghiên cứu còn xác định
được gen blaCTX-M nằm dưới vùng trình tự gắn chèn ISEcpl. Các gen blaGES-1 và
blaPER-1 không được tìm thấy [41].
Một nghiên cứu tại bệnh viện Nhiệt Đới năm 2009 trên vi khuẩn Shigella
spp. sinh ESBL đã xác định các CTX-M-24 và CTX-M-15 là loại lưu hành phổ biến, gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có kích thước lớn lần lượt là 70 và 100 kb. Các plasmid này chứa các yếu tố cần thiết cho việc tiếp hợp (trình tự
tra) và khả năng gắn chèn – các gen mã hóa CTX-M nằm dưới vùng trình tự gắn
chèn ISEcp1. Ngoài ra, các chủng sinh ESBL còn đề kháng với nhiều loại kháng sinh như ampicillin, trimethoprim – sulfamethoxazole, tetracycline và nalidixic acid [25].
2.1 Chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm ở hai bệnh viện tại TP. HCM (bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất) từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2010 theo quy trình xét nghiệm tại mỗi bệnh viện. Các chủng vi khuẩn được phân lập, định danh và thử nghiệm kháng sinh đồ. Dựa trên kết quả kháng sinh đồ của bệnh viện, các chủng vi khuẩn có đường kính vòng kháng khuẩn < 22 mm trên ceftazidim 30 µg, cho thấy có sự giảm nhạy cảm với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3. Các chủng này nghi ngờ có khả năng sinh ESBL được thu thập lại. Chúng tôi chỉ đưa vào nghiên cứu các chủng có kết quả định danh rõ ràng và thử nghiệm đĩa đôi dương tính với kiểu hình ESBL khi được thực hiện lại tại phòng thí nghiệm vi sinh của OUCRU.
Nghiên cứu này thực hiện trên 32 chủng vi khuẩn Gram âm sinh ESBL, trong đó, 23 chủng E. coli (21 chủng phân lập được tại bệnh viện Chợ Rẫy và 2 chủng tại bệnh viện Thống Nhất), 9 chủng K. pneumoniae (3 chủng tại bệnh viện Chợ Rẫy và 6 chủng tại bệnh viện Thống Nhất).
Sơđồ 2.1 Quy trình thực nghiệm Mẫu bệnh phẩm
Tên vi khuẩn
Vi khuẩn thuần Thử nghiệm sinh hóa Định danh
Xác định kiểu hình ESBL
Xác định MIC của các chủng sinh ESBL
E-test
Xác định kiểu gen ESBL
Xác định các gen mã hóa ESBL bằng các mồi đặc hiệu
Xác định trình tự gen mã hóa ESBL
PCR
Giải trình tự DNA
Phân tích plasmid các chủng sinh ESBL
Kích thước và số lượng các plasmid
Xác định các plasmid mang gen đề kháng
Xác định khả năng truyền các gen đề kháng giữa các vi khuẩn
Điện di trên gel
agarrose
Southern Blot
2.2 Định danh họ vi khuẩn Enterobacteriacae
Các chủng vi khuẩn được cấy phân lập trên đĩa thạch dinh dưỡng (NA) để kiểm tra độ thuần khiết. Lấy 1 khóm khuẩn lạc cấy vào các môi trường sinh hóa để định danh. Một dãy 5 ống môi trường thể hiện kết quả của 10 phản ứng sinh hóa cho phép định danh một số loài trong họ vi khuẩn Enterobacteriacae.
- Xác định khả năng sử dụng đường glucose, lactose, sử dụng acid amin chứa lưu huỳnh (sinh H2S) và khả năng sinh gas của vi khuẩn.
- Xác định khả năng phân giải urea của vi khuẩn
- Xác định khả năng sử dụng citrate và muối ammonium như nguồn carbon và nitơ duy nhất của vi khuẩn.
- Thử nghiệm indole xác định khả năng sử dụng acid amin chứa nhân indol. - Xác định khả năng di dộng của vi khuẩn.
- Xác định cơ chế lên men đường theo lối cho ra hỗn hợp acid (pH <4,4) như acid acetic, acid formic, acid lactic, … hay hỗn hợp acetoin (pH > 5,5) như acetylmethyl carbinol, 2,3-butanediol, diacetyl, …
Trong trường hợp thử nghiệm này không xác định được vi khuẩn thì sử dụng kit API20E (Biomerieux, USA) để định danh chính xác.
2.3 Xác định kiểu hình ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi
2.3.1 Nguyên tắc
Thử nghiệm sàng lọc, khi chủng cho đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ hơn 22 mm đối với đĩa ceftazidim 30 µg, cho thấy có sự giảm nhạy cảm đối với cephalosporin thế hệ III. Chủng đó được nghi ngờ sinh ESBL [31].
Thử nghiệm xác nhận được thực hiện trên nguyên tắc tìm tác dụng hiệp lực giữa đĩa ceftazidim 30µg (CAZ) và ceftazidim/acid clavulanic 30/10µg (CAZ-CLA) hoặc cefotaxim 30µg (CTX) và cefotaxim/ acid clavulanic 30/10µg (CTX-CLA). Sự kết hợp với chất ức chế ESBL như clavulanic acid sẽ làm tăng hoạt tính của
cephalosporin thể hiện bằng sự giãn rộng của vùng kháng khuẩn. Kết quả được biện luận theo hướng dẫn của CLSI (M100-S18). Khi đường kính vòng kháng khuẩn của đĩa cephalosporion/acid clavulanic ≥ 5 mm so với đường kính vòng kháng khuẩn của đĩa cephalosporin thì chủng đó được ghi nhận là mang kiểu hình ESBL [31].
2.3.2 Thực hiện
Lấy vài khóm từ chủng thuần kháng ceftazidim, cho vào 5 ml nước cất tiệt trùng để tạo thành huyền phù. Điều chỉnh mật độ quang của huyền phù bằng nước cất cho đến khi có được mật độ tương đương với mật độ quang của chuẩn McFarland 0,5. Nhúng que bông khô và tiệt trùng vào huyền phù vi khuẩn, trải đều lên bề mặt thạch. Để bề mặt thạch khô trong phòng vài phút trước khi đặt đĩa kháng sinh. Sử dụng kẹp vô trùng, đặt đĩa giấy có tẩm kháng sinh trên bề mặt thạch. Nên đặt cách bờ hộp thạch 10 mm, và khoảng cách giữa các đĩa là khoảng 30 mm. Kết quả được đọc sau khi ủ 16-18 giờ ở 370C (Hình 2.1).
2.4 Xác định nồng độức chế tối thiểu (MIC) các chủng sinh ESBL
Tạo huyền phù vi khuẩn trong 5 ml nước cất tương đương McFarland 0,5. Dùng que bông vô trùng trải đểu lên bền mặt thạch MH, để bề mặt thạch khô trong vài phút. Sau đó, đặt thanh E-test® (AB Biodisk, Thụy Điển) với từng loại kháng sinh lên bề mặt thạch, ủ 12-16 giờ ở 370C (Hình 2.2). Kết quả được đọc theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. CAZ 19 CAZ-CLA CTX-CLA CTX
19 Hình 2.1 Phương pháp thử nghiệm đĩa đôi. Chủng EC1 dương tính với 2 cặp đĩa
ceftazidim/ ceftazidim+clavulanic acid và cefotaxim/ cefotaxim+clavulanic acid
2.5 Chiết DNA từ tế bào vi khuẩn
2.5.1 Tách chiết DNA bộ gen của vi khuẩn
Hút 1 mL dịch nuôi cấy qua đêm của chủng vi khuẩn trên môi trường LB lỏng, ly tâm 1 phút ở 13000 vòng/phút, thu lấy tế bào. Tiếp tục thực hiện quy trình chiết tách DNA như các bước hướng dẫn trong kit tách chiết DNA bộ gen Wizard (Promega). DNA sau khi chiết được xác định nồng độ bằng máy đo quang và trữ ở - 200C.
2.5.2 Tách chiết plasmid theo phương pháp của Kadou – Liu [25]. Quy trình: Quy trình:
‐ Lấy 2 mL dịch nuôi cấy qua đêm của các chủng vi khuẩn trên môi trường LB lỏng, ly tâm 2 phút ở 13000 vòng/phút, thu lấy sinh khối tế bào.
‐ Huyền phù sinh khối bào trong 150 µl dung dịch đệm E (E buffer). ‐ Bổ sung 300 µl dung dịch đệm ly giải, trộn đều nhẹ nhàng.
‐ Ủ huyền dịch này trong 60 phút ở 550C.
‐ Bổ sung 600 µl Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), trộn đều nhẹ nhàng cho đến khi dịch huyền phù có màu trắng sữa. Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
‐ Hút 32 µl dịch nổi, bổ sung 8 µl đệm tải và nạp mẫu vào gel để tiến hành điện di. Quá trình điện di được thực hiện trên gel agarose 0,7%, với hiệu điện
Hình 2.2 Phương pháp xác định MIC. Chủng EC21 có giá trị MIC = 3 µg/ml với nalidixic acid (NA) và MIC > 256 µg/ml với chloramphenicol (CL) được xác định bằng thanh E-test
thế 100 Volt trong 4 giờ. Sau điện di, gel được nhuộm với ethidium bromide 5% trong 15 phút và đọc kết quả dưới tia UV có bước sóng 254 nm bằng máy chụp hình gel Gel-Doc (Biorad).
2.6 Phản ứng khuếch đại DNA xác định gen mã hóa ESBL
DNA bộ gen sau khi tách chiết được dùng làm khuôn mẫu để khuếch đại các gen mã hóa ESBL nhờ các cặp mồi đặc hiệu. Tuy nhiên, các vi khuẩn thu thập được đều là các vi khuẩn họ đường ruột và đề kháng với cefotaxim bị ức chế bởi clavulanic acid. Do vậy, chúng tôi chỉ phát hiện các ESBL họ TEM, SHV và CTX-M dựa vào các đoạn mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các vùng bảo tồn của các gen này. Tiếp theo, các chủng mang gen mã hóa CTX-M được phân loại dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho CTX-M-1, CTX-M-2 và CTX-M-9 (Bảng 2.1). Thành phần và chương trình các phản ứng, xem bảng 2.2 và bảng 2.3. Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1% ở 120 V trong 60 phút và được đọc kết quả bằng máy chụp gel Gel-Doc (Biorad).
Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dùng để phát hiện gen mã hóa ESBL [25]
Gen Trình tự mồi Kích thước sản phẩm blaSHV Fa 5’-TCTCCCTGTTAGCCACCCTG-3’ 593bp R 5’-CCACTGCAGCAGCTGC-3’ blaTEM F 5’-TGCGGTATTATCCCGTGTTG-3’ 296bp R 5’-TCGTCGTTTGGTATGGCTTC-3’ blaCTX-M F 5’-CGATGTGCAGTACCAGTAA-3’ 585bp R 5’-TTAGTGACCAGAATCAGCGG-3’ blaCTX-M-1 F 5’-ATGGTTAAAAAATCACTGCG-3’ 876 bp R 5’-TTACAAACCGTCGGTGAC-3’ blaCTX-M-2 F 5’-TGGAAGCCCTGGAGAAAAGT-3’ 448 bp R 5’-CTTATCGCTCTCGCTCTGTT-3’ blaCTX-M-9 F 5’-ATGGTGACAAAGAGAGTGCAAC-3’ 876 bp R 5’-TTACAGCCCTTCGGCGATG-3’
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR [25] Thành phần Thể tích Nồng độ Đệm 10X 5 µl 1X dNTP (20 mM/loại) 0,5 µl 2 mM MgCl2 (50 mM) 2 µl 10 mM Mồi xuôi (10 µM) 1 µl 0,2 µM Mồi ngược (10 µM) 1 µl 0,2 µM
Taq DNA polymerase 5 U/ µl 0,3 µl
DNA khuôn mẫu 100 ng 2 ng/ µl
Nước cất vừa đủ 50 µl
Bảng 2.3 Chương trình phản ứng PCR [25]
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
Biến tính 950C 1 phút 1 chu kỳ
Biến tính 940C 30 giây
30 chu kỳ
Bắt cặp 570C 30 giây
Kéo dài 720C 1,5 phút
Kéo dài 720C 3 phút 1 chu kỳ
Bảo quản 40C
2.7 Tinh sạch DNA
Sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose, các sản phẩm khuếch đại được tinh sạch bằng bộ kít tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR của Qiagen (USA). Bột kít này tinh sạch sản phẩm PCR bằng cách sử dụng các cột gắn màng chứa hạt silica. Quá trình tinh sạch gồm các bước: (1) hấp phụ sản phẩm PCR trên màng silica, (2) rửa màng để loại bỏ các mồi, enzym, muối, … (3) ly giải DNA vào dung dịch đệm TE. DNA sau khi tinh sạch được đo nồng độ bằng máy đo quang phổ Nanodrop.
2.8 Giải trình tự sản phẩm khuếch đại
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được chạy phản ứng PCR giải trình tự bằng bộ kít BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystem) với các thành phần và chương trình như Bảng 2.4 và Bảng 2.5.
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng giải trình tự
Thành phần Thể tích
BigDye 1 µl
Dung dịch đệm 5X 2 µl
Mồi xuôi hoặc mồi ngược 10 µM 0,5 µl
DNA mục tiêu 5 – 20 ng
Nước cất vừa đủ 10 µl
Bảng 2.5 Chương trình phản ứng PCR giải trình tự
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
Biến tính 960C 1 phút 1 chu kỳ Biến tính 960C 10 giây 25 chu kỳ Bắt cặp 500C 5 giây Kéo dài 600C 4 phút Bảo quản 40C
Sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự được tủa với ethanol, EDTA và natri oxalate theo các bước sau :
‐ Chuẩn bị ống eppendorf vô trùng cho mỗi mẫu.
‐ Cho vào mỗi ống eppendorf 4 µl dung dịch dừng phản ứng (gồm 2 µl NaOAc 3M, pH 5,2 và 2 µl EDTA 100 mM, pH 8,0).
‐ Chuyển 10 µl sản phẩm PCR giải trình tự vào ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch dừng phản ứng và trộn kỹ.
‐ Thêm 70 µl ethanol lạnh 95% và trộn kỹ. Ngay lập tức đem ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Sau đó loại bỏ dịch nổi (ethanol). ‐ Rửa tủa 2 lần, mỗi lần với 200 µl ethanol lạnh 70%. Lưu ý tránh làm tróc cắn
DNA. Ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Loại bỏ dịch nổi (ethanol).
‐ Làm khô bằng máy hút chân không trong 15 phút.
‐ Hòa tan tủa DNA trong 10 µl dung dịch nạp mẫu HiDi formamide (Applied Biosystem). Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để DNA tan hoàn toàn.
Trình tự DNA được xác định bằng máy giải trình tự (Applied Biosystem). Sau đó, trình tự DNA được phân tích bằng phần mềm BioEdit và Vector NTI Suite 7. Các trình tự này được so sánh với các trình tự đã được công bố trên Ngân hàng Gen của NCBI.
2.9 Thí nghiệm tiếp hợp
Thử nghiệm tiếp hợp được tiến hành trên các chủng sinh ESBL để xác định khả