Trên nguyên tắc, các phương pháp phát hiện ESBL bao gồm 2 bước sau:
• Thử nghiệm sàng lọc: bước này nhằm kiểm tra sự đề kháng hoặc giảm nhạy cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn bằng cách sử dụng một hay nhiều cephalosporins như cefpodoxime, ceftazidime, cefotaxime, hoặc ceftriaxone. Thử nghiệm này có thể tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch hoặc pha loãng kháng sinh [29].
• Thử nghiệm xác nhận: các chủng nghi ngờ sinh ESBL trong thử nghiệm sàng lọc sẽ được kiểm tra sự hiệp lực giữa oxyimino-cephalosporin và clavulanate, nhằm phân biệt giữa các chủng sinh ESBL thật sự và các chủng đề kháng không phải ESBL. Thử nghiệm này được phát triển bởi nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp của Jarlier (1988), Jacoby và Han (1996) hoặc theo chỉ dẫn của CLSI (2009) [24], [29]. Ngoài ra, còn có thể sử dụng các kit thương mại như E-test® (AB Biodisk, Thụy Điển), Vitek ESBL (Biomerieux, USA), BD Phoenix, Becton Dickinson Biosciences (Sparks, Md) [29].
Theo đề nghị của CLSI (2009), tác dụng hiệp lực giữa đĩa ceftazidim (30µg) và ceftazidim/acid clavulanic (30/10µg) hoặc cefotaxim (30µg) và cefotaxim/acid clavulanic (30/10µg) được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Khi đường kính vòng kháng khuẩn của đĩa kháng sinh phối hợp với acid clavulanic ≥ 5 mm so với đĩa chỉ chứa ceftazidim hoặc cefotaxim thì chủng đó được xác nhận là mang kiểu hình ESBL [31].
Hạn chế của các phương pháp này là xảy ra các trường hợp dương tính giả và âm tính giả. Một số chủng K. pneumoniae hoặc E. coli không có ESBL nhưng lại
sản xuất quá mức các β-lactamase loại TEM và SHV kháng clavulanic acid có thể cho kết quả dương tính giả. Trường hợp âm tính giả xảy ra khi một số chủng đồng thời mang cả gen mã hóa AmpC-β-lactamase và ESBL. Sự kết hợp này làm chúng trở nên đề kháng với clavulanic acid bởi tác động của AmpC-β-lactamase [29].