Chúng tôi tiến hành giải trình tự các gene blaTEM, blaCTX-M-1, blaCTX-M-9 sau khi đã có kết quả khuếch đại dương tính với cặp mồi đặc hiệu. Trình tự các sản phẩm DNA sau đó được so sánh với cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen NCBI bằng chương trình Nucleotide BLAST.
‐ Trình tự gen blaTEM :
Mặc dù sản phẩm khuếch đại của gen blaTEM nằm trong vùng bảo tồn nhưng chúng tôi vẫn giải trình tự để xác định bất kỳ đột biến nào xuất hiện trong vùng này. Trình tự DNA của 24 sản phẩm TEM của 18 chủng E. coli và 6 chủng K.
pneumoniae được so sánh độ tương đồng với gen blaTEM-1 (mã số J01749). Kết quả cho thấy, cặp mồi khuếch đại một đoạn trình tự dài 296 bp từ vị trí 228 đến 524 của gen mã hóa cho TEM-1. Trình tự của 2/24 chủng (KT1 và KC5) tương đồng 100% với TEM-1; 22/24 chủng còn lại xuất hiện một đột biến im lặng ở vị trí 396 (GCG → GCT) mã hóa cho Ala132 (Hình 3.3).
Hình 3.3: Kết quả phân tích trình tự gen blaTEM bằng phần mềm Vector NTI Suite 7 ‐ Trình tự gen blaCTX-M-1 :
Trình tự gen blaCTX-M-1 của 18 chủng vi khuẩn (12 chủng E. coli và 6 chủng
K. pneumoniae) được so sánh độ tương đồng với các gen đã được công bố trước đó
trên Genbank. Sau khi so sánh chúng tôi xác định được 3 biến thể của gen blaCTX-M-1 là blaCTX-M-3 (mã số Y10278) , blaCTX-M-15 (mã số AY044436.1) và blaCTX-M-55 (mã số DQ885477.1) (Hình 3.4).
Trong ba biến thể thuộc nhóm blaCTX-M-1, chiếm ưu thế nhất là blaCTX-M-15
với 15/18 chủng; bao gồm 10 chủng E. coli và 5 chủng K. pneumoniae. Hai biến thể còn lại blaCTX-M-55 và blaCTX-M-3 chỉ xuất hiện lần lượt ở 2/18 và 1/18 chủng (Bảng 3.2).
Hình 3.4: Kết quả phân tích trình tự gen blaCTX-M-1 bằng phần mềm Vector NTI Suite 7
‐ Trình tự gen blaCTX-M-9:
Trình tự gen blaCTX-M-9 của 15 chủng vi khuẩn (12 chủng E. coli và 3 chủng
K. pneumoniae) được so sánh độ tương đồng với các gen đã được công bố trên Genbank (Hình 3.5). Chúng tôi đã xác định được 2 biến thể của gen blaCTX-M-9 là
blaCTX-M-14 (mã số AF252622.2) , blaCTX-M-27 (mã số AY156923.1).
Trong đó, 4/15 chủng mang blaCTX-M-14 và 11/15 chủng blaCTX-M-27. Trong các chủng mang blaCTX-M-14, một chủng ET1 mang đột biến im lặng tại vị trí 507 (GAA Æ GAG), mã hóa cho glutamic acid. Các chủng còn lại đều có trình tự tương đồng 100% với các gen tương ứng (Hình 3.5).
Tất cả các chủng mang blaCTX-M-14 đều là E. coli; trong khi blaCTX-M-27 phát hiện ở 8 vi khuẩn E. coli và 3 vi khuẩn K. pneumoniae.
Hình 3.5: Kết quả phân tích trình tự gen blaCTX-M-9 bằng phần mềm Vector NTI Suite 7
Nhận xét: 100% các chủng có kiểu hình ESBL qua thử nghiệm đĩa đôi đều mang gen blaCTX-M. 75% các chủng mang thêm cả β-lactamase loại TEM. Các blaCTX-M-15,
blaCTX-M-14, blaCTX-M-27 là các gen phổ biến ở vi khuẩn E. coli và K. pneumoniae, đặc biệt là blaCTX-M-15 chiếm tỉ lệ cao nhất trong tổng số gen blaCTX-M (15/32 chủng)