Tiểu luận Công nghệ sinh học KỸ THUẬT NUÔI CẤY

MỤC LỤC A. Đặt vấn đề. B. Nội dung chính. I. Khái niệm về thể đơn bội. 1. Thể đơn bội. 2. Các cách hình thành thể đơn bội. 3. Một số đặc điểm của thể đơn bội. II. Ý nghĩa của cây đơn bội trong chọn giống, nghiên cứu di truyền. III. Kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn và bao phấn. 1. Nguyên lý. 2. Các giai đoạn cơ bản trong nuôi cấy hạt phấn và bao phấn tách rời. 3. Các phương thức sinh sản vô tính đực in vitro tạo cây đơn bội. 4. Các phương pháp cơ bản. 5. Kỹ thuật nuôi cấy. 6. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cáy hạt phấn và bao phấn in vitro. 7. Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng. IV. Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh. 1. Khái niệm. 2. Quy trình tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh. 3. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh. V. So sánh nuôi cấy: hạt phấn tách rời, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. VI. Hiện trạng. VII. Ví dụ cụ thể về nuôi cấy tạo cây đơn bội: nuôi cấy noãn và phôi non của cây ngô. 1. Xác định thành phần của môi trường nuôi cấy. 2. Môi trường nuôi cấy noãn và phôi non của cây ngô. 3. Các bước tiến hành nuôi cấy. VIII. Kết luận. IX. Tài liệu tham khảo. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chọn tạo giống cây trồng việc tạo ra được dòng đồng hợp tử tuyệt đối là một vấn đề rất được quan tâm. Các dòng này đã được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: tự phối, nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục… Trong đó tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục là một kĩ thuật mới có nhiều ưu điểm so với các kĩ thuật khác. Hầu hết các loài cây trồng của chúng ta đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội (2n) và tứ bội (4n). Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai hay nhiều allen của một gen chi phối. Nếu đó là những cá thể dị hợp tử, tức là các gen trong mỗi hệ gen nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng (phenotype) của gen đó hoàn toàn tùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định. Vì vậy, mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng phải là mức đơn bội (1n) hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng phải đồng nhất tuyệt đối. NỘI DUNG I) Khái niệm về thể đơn bội 1) Thể đơn bội Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác nguồn mà trong tế bào của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng nhiễm sắc thể của loài khởi đầu, trong mỗi cặp nhiếm sắc thể tương đồng nó chỉ có một nhiễm sắc thể (n).

3 Một số đặc điểm của thể đơn bội.

II Ý nghĩa của cây đơn bội trong chọn giống, nghiên cứu di truyền.

III Kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn và bao phấn.

1 Nguyên lý.

2 Các giai đoạn cơ bản trong nuôi cấy hạt phấn và bao phấn tách rời.

3 Các phương thức sinh sản vô tính đực in vitro tạo cây đơn bội.

4 Các phương pháp cơ bản.

5 Kỹ thuật nuôi cấy.

6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cáy hạt phấn và bao phấn in vitro.

7 Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng.

IV Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh.

1 Khái niệm.

2 Quy trình tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh.

3 Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh.

V So sánh nuôi cấy: hạt phấn tách rời, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.

VI Hiện trạng.

VII Ví dụ cụ thể về nuôi cấy tạo cây đơn bội: nuôi cấy noãn và phôi non của cây

ngô.

1 Xác định thành phần của môi trường nuôi cấy.

2 Môi trường nuôi cấy noãn và phôi non của cây ngô.

3 Các bước tiến hành nuôi cấy.

VIII Kết luận.

IX Tài liệu tham khảo.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong chọn tạo giống cây trồng việc tạo ra được dòng đồng hợp tử tuyệt đối là một vấn đề rất được quan tâm Các dòng này đã được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: tự phối, nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục… Trong đó tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục là một kĩ thuật mới có nhiều ưu điểm

so với các kĩ thuật khác

Hầu hết các loài cây trồng của chúng ta đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội (2n) và tứ bội (4n) Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai hay nhiều allen của một gen chi phối Nếu đó là những cá thể dị hợp tử, tức là các gen trong mỗi hệ gen nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng (phenotype) của gen đó hoàn toàn tùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định Vì vậy, mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng phải là mức đơn bội (1n) hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng phải đồng nhất tuyệt đối

2) Các cách hình thành thể đơn bội

- Phương pháp tạo thể đơn bội in vivo:

Kể từ khi Bergner phát hiện ra cây đơn bội ở Datura stramonium vào năm

1921, các nhà tạo giống thực vật đã tập trung nghiên cứu và thu được nhiều cây đơn bội hoặc trong điều kiện in vitro hoặc trong điều kiện in vivo Trong tự nhiên, các dạng đơn bội tăng lên do kết quả của sự trinh sản và các cây này hiếm khi mang các đặc điểm của cây bố Các kỹ thuật in vivo được ứng dụng để sản xuất cây đơn bội như sau:

+ Sinh sản đơn tính cái (gynogenesis)

Sản xuất các thể đơn bội riêng rẽ bằng cách phát triển các tế bào noãn bất thụ (unfertilised egg-cell) trong trường hợp sự thụ phấn xảy ra chậm Gynogenesis

được tìm thấy khi lai khác loài giữa Solanum tuberosum (2n = 4x) × S phureja (2n

= 2x) kết quả tạo ra dạng song đơn bội (dihaploid) là khoai tây (2n = 2x)

+ Sinh sản đơn tính đực (androgenesis)

Sản xuất các thể đơn bội riêng rẽ bởi sự phát triển của tế bào noãn mang nhân của bố Trong trường hợp này, sự đào thải hoặc bất hoạt của nhân noãn (egg-nucleus) xuất hiện trước khi thụ tinh

+ Sự đào thải hệ gen bằng lai xa

Hiện tượng này xảy ra khi lai khác chi và khác loài do sự đào thải chọn lọc của một trong những hệ gen của bố mẹ trong quá trình phát triển sau khi thụ tinh Vì thế, phôi được tạo thành chỉ với một hệ gen và cây phát triển từ phôi như thế có

thể là cây đơn bội Chẳng hạn: lai khác loài giữa Hordeum vulgare và H bulbosum cho ra cây đơn bội H vulgare.

+ Sự giao phối không hoàn toàn (semigamy)

Quá trình lai mà ở đó nhân của tế bào noãn và nhân sinh sản (generative nucleus) của hạt phấn nảy mầm phân chia độc lập, cho kết quả tạo ra thể khảm đơn bội (haploid chimera).

+ Xử lý hóa chất

Một số hóa chất, như chloramphenicol và parafluorophenylalanine có thể cảm ứng đào thải một bộ nhiễm sắc thể ở các tế bào hoặc mô soma, làm tăng các thể đơn bội Xử lý bằng toluene blue, maleic hydrazide, nitrous oxide và colchicine cũng có thể cho các kết quả tương tự

+ Shock nhiệt

Xử lý nhiệt độ cao hoặc nhiệt độ thấp có thể có tác dụng trong việc ngăn cản sinh sản hữu tính (syngamy) và cảm ứng thể đơn bội

+ Ảnh hưởng của chiếu xạ

Tia X hoặc ánh sáng UV gián tiếp cảm ứng làm đứt gãy nhiễm sắc thể và đào thải chúng, tạo ra các thể đơn bội

Nhìn chung, các phương pháp in vivo có hiệu suất sản xuất cây đơn bội thấp Các phương pháp in vitro cho hiệu quả cao hơn nhờ kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn

(pollen culture) hoặc nuôi cấy bao phấn (anther culture) ở khoảng 250 loài và loài lai Các loài đặc trưng của họ Solanaceae cho kết quả tốt hơn cả, mặc dù ở các họ Cruciferae, Poaceae, Ranunculaceae và một số họ khác cũng có khả năng cảm ứng tạo cây đơn bội bằng sinh sản đơn tính bao phấn hoặc từ nuôi cấy hạt phấn phân lập

- Các phương pháp phát sinh cây đơn bội invitro

Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực (androgenesis) Người ta phân biệt 3 phương thức sinh sản đơn tính đực:

+ Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử

Tiểu bào tử (trong bao phấn) → Phôi → Cây đơn bội (n = 1)

Cấu trúc dạng phôi (embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn Quá trình này

thường xảy ra trong bao phấn, điển hình là: Datura, Nicotiana, Atroppa.

+ Sinh sản vô tính qua callus

Tiểu bào tử (trong bao phấn) → Callus → Chồi → Cây đơn bội (n = 1)

Cây hoàn chỉnh phát triển từ khối callus, khối mô này thường phát triển ra ngoài

bao phấn, ví dụ: Oryza, Brassica, Lolium, Hordeum.

+ Sinh sản đơn tính hỗn hợp

Giai đoạn phát triển callus xảy ra rất ngắn và khó nhận biết, ví dụ: Datura,

Lycopersicum (chưa chắc chắn).

3) Một số đặc điểm của thể đơn bội

+ Trong cơ thể thực vật chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội Nếu chúng phất triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n) + Ở thể đơn bội thì kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen vì vậy thể đơn bội là nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn giống cây trồng

II) Ý nghĩa của cây đơn bội trong chọn giống, nghiên cứu di truyền

- Khó khăn trong việc tạo dòng thuần và hướng khắc phục

Tự thụ qua nhiều thế hệ

Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong 1 thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo ra được dòng thuần chủng Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở 1 số loài thực vật ở Hyacinthus Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội

- Một số ưu điểm của cây đơn bội

Sử dụng thể đơn bội có thể rút ngắn quá trình đồng hợp tử hóa bằng cách chuyển từ đơn bội sang đơn bội kép Cây đơn bội biểu hiện tất cả thông tin di truyền ra kiểu hình, dễ dàng nhận biết các alen ẩn, khả năng kháng các điều kiện bất lợi có thể nhận biết và chọn lọc

- Khả năng ứng dụng của cây đơn bội

+ Nghiên cứu về phôi học thực nghiệm Chủ yếu trên các đối tượng mà phôi phát triển trực tiếp từ tiểu bào tử trong nuôi cấy bao phấn thông qua quá trình phát sinh phôi đơn tính, còn gọi là sinh sản đơn tính đực (androgensis).

+ Nghiên cứu về tế bào học Cây đơn bội có thể sinh trưởng và phát triển tới giai đoạn ra hoa, nhưng bất dục Khi nghiên cứu quá trình phân bào giảm nhiễm đầu tiên của tế bào mẹ hạt phấn cây đơn bội có thể phát hiện được mối quan hệ tương tác giữa các nhiễm sắc thể, bởi vì bộ nhiễm sắc thể đơn bội không thể giảm nhiễm bình thường được

Ví dụ:

Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể cây thuốc lá trồng (Nicotiana tabaccum) nhị bội người ta thấy có 48 NST, lúc phân chia giảm nhiễm chúng sắp thành 2 dãy, gọi là dãy S và dãy T Mỗi dãy gồm 24 NST Nuôi cấy đơn bội của nó có số lượng NST n = 24 và theo dõi phân chia giảm nhiễm của tế bào mẹ hạt phấn cũng thấy các NST xếp thành cặp: 12S + 12T Điều này chứng tỏ bộ NST đơn bội của cây thuốc lá có những biểu hiện như một bộ NST lưỡng bội, vì các NST trong dãy S đều tìm thấy NST tương đồng trong dãy T Đây là kết quả rất phù hợp với lịch sử phát sinh chủng loại của cây thuốc lá trồng

Như vậy cây thuốc lá trồng là một dạng tứ bội, nhưng không hoàn chỉnh (allotetraploid), biểu hiện là cây đơn bội n = 12S + 12T bất thụ do không phải tất cả NST của bộ S đều có NST tương đồng ở bộ T

+Nghiên cứu đột biến và di truyềnTrong hệ gen (genome) của thể đơn bội không có quan hệ tính trội mà chỉ có quan hệ bổ sung giữa các gen, do đó các thể đơn bội là những nguyên liệu lý tưởng trong chọn dòng đột biến cũng như trong những nghiên cứu về mối tương tác của

các gen.

+ Cải thiện giống cây trồng:

§ Tạo dòng thuần

§ Tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1

§ Nghiên cứu tạo cây từ hạt phấn của các giống thuần

§ Nghiên cứu đột biến, gây đột biến ở các dạng đơn bội và chọn lọc

§ Phát triển các dòng vô tính ở các loài cây thân gỗ lâu năm

§ Chuyển các gen ngoại lai mong muốn

§ Thiết lập các dòng tế bào đơn bội và nhị bội của cây hạt phấn

III) Kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn và bao phấn

1) Nguyên lý

Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực (androgensis), người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội

2) Các giai đoạn cơ bản trong nuôi cấy hạt phấn và bao phấn tách rời

- Giai đoạn tạo cấu trúc phôi từ các hạt phấn nuôi cấy

- Giai đoạn biệt hóa cơ quan và tái sinh cây đơn bội từ các cấu trúc phôi ( giai đoạn tái sinh)

- Giai đoạn lưỡng bội hóa bộ NST của các cây đơn bội tạo thành cây đơn bội kép ( doubled hapdoids) đồng hợp tử cùng nguồn gen

3) Các phương thức sinh sản vô tính đực invitro tạo cây đơn bội

- Sinh sản đơn tính trực tiếp (thuốc lá, cà độc dược).

Hạt phấn đơn nhân à phôi 1n àcây 1n

- Sinh sản đơn tính đực gián tiếp (lúa, ngô)

Hạt phấn đơn nhân à mô sẹo 1n à chồi 1n àcây1n

- Sinh sản vô tính đực hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản vô tính đực gián tiếp, nhưng sự tạo thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết Ví dụ: cà chua

5) Kỹ thuật nuôi cấy

- Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể tứ bào tử đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn

- Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây

và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội

- Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng

- Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích thước

6) Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro

- Kiểu gen:

Đóng vai trò chính quyết định đến sự thành công hay thất bại của thí nghiệm Do tác dụng của kiểu gen, việc sử dụng ngày càng nhiều sự đa dạng về di truyền sẽ càng tốt khi triển khai quy trình sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy hạt phấn

- Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn:

Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố,

mẹ cho bao phấn, hạt phấn Trạng thái sinh lý lại liên quan đến điều kiện môi trường mà cây sinh trưởng như: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khoáng

Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo

Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, ngày ngắn sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn

- Dinh dưỡng, hoocmon và các nhân tố khác

Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn là: MS-1962, LS-1965, B5-1968, N6-1976

Các Auxin ngoại sinh (IAA, NAA, IBA, 2,4 D) và cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin) cần được đưa vào môi trường để thúc đẩy quá trình phát sinh phôi

Các nguồn chất hữu cơ không xác định như: dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, cà chua… và các axit amin, glutamin có tác động tích cực với sinh trưởng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn

Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc đẩy sự khởi đầu của phôi từ mô bao phấn đơn bội

Khi sử dụng môi trường đặc cần lựa chọn thạch có độ tinh khiết cao sẽ cho hiệu quả tạo mô sẹo và cây con cao hơn

Hàm lượng đường cho vào môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy

7) Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng

- Ở nước ta từ năm 1975 đến nay đã tạo được nhiều loại cây trồng bằng nuôi cấy đơn bội như ngô, bắp cải, thuốc lá

Thành tựu:

- Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78 giống, 31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và Zhang, 1985)

- Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao

1105, VH2 Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống DR1, DR2, DR3 đang mở rộng ra qui mô sản xuất Kết hợp biến dị tế bào soma với gây đột biến đã tạo giống lúa KDM39 Trong nghiên cứu lúa lai đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột biến tạo dòng TGMS và CMS mới

- Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào

- mô phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần Hàng loạt dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26 ) đã được tạo ra bằng

kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene quý như gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS) Đối với ngô, đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng

- Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô, khoai tây…

Ưu điểm của việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

• Nuôi cấy bao phấn:

- Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng

- Môi trường nuôi cấy đơn giản