Tiểu luận Công nghệ sinh học thực vật: Sản suất Anthocyanyl trong nuôi cấy rễ bất định củ cải đường L. CV. Peking Koushin

Tiểu luận Công nghệ sinh học thực vật: Sản suất Anthocyanyl trong nuôi cấy rễ bất định củ cải đường

Đề tài

SẢN SUẤT ANTHOCYANYL TRONG NUÔI CẤY

RỄ BẤT ĐỊNH CỦ CẢI ĐƯỜNG L CV PEKING

Nội dung

Tóm tắt Giới thiệu Vật liệu và phương pháp

Kết quả và thảo luận

4

1

2

3

I Tóm tắt

Tạo rễ bất định của củ Cải đường L cv Peking Koushin từ đoạn rễ cây giống in vitro trong môi trường 1/2 MS lỏng + 0,5 mg/l IBA

Rễ bất định nuôi cấy trong môi trường 1/2 MS lỏng + 0,5 mg/l IBA sản xuất

anthocyanin trong bóng tối Khi nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng 14

giờ/ngày, rễ bất định trong môi trường có 0,5 mg/l IBA sản xuất anthocyanin nhiều hơn môi trường có 0,1 hoặc 0,5 mg/l NAA

Quá trình thủy phân acid của

các dịch chiết xuất rễ cho

thấy anthocyanidin chính là

pelargonidin

Ngoài ra, so sánh tinh sạch hoàn toàn chiết xuất rễ bất định bằng DPPH với rễ nguyên của cây cùng loại trong nghiên cứu này

II Giới thiệu

Sắc tố anthocyanin được sử dụng như màu thực phẩm tự nhiên

III Vật liệu và phương pháp

1 Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định và củ

Hạt giống ngâm với ethanol 75% trong 30

phút

Khử trùng với 2% NaOCl có chứa 0.1%

Tween 20 trong 10 phút

Đặt hạt trên môi trường 0.5% agar + 0.5% saccharose Nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng 14h/ngày ở 25 0 C

Rửa một lần nước cất vô trùng

Rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng

III Vật liệu và phương pháp

1 Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định và củ

III Vật liệu và phương pháp

2 Phân tích sắc tố

a Tách chiết anthocyanin

III Vật liệu và phương pháp

2 Phân tích sắc tố

b Thủy phân acid của anthocyanin

III Vật liệu và phương pháp

3 Phân tích HPLC

Thời gian lưu của anthocyanidins chính trong các mẫu rễ bất định và rễ nguyên phân tích bằng HPLC được so sánh với những chất chuẩn của anthocyanin (pelargonidin chloride, cyanidin chloride, peonidin chloride và delphinidin

chloride)

Thời gian lưu của anthocyanidins chính trong các mẫu rễ bất định và rễ nguyên phân tích bằng HPLC được so sánh với những chất chuẩn của anthocyanin (pelargonidin chloride, cyanidin chloride, peonidin chloride và delphinidin

III Vật liệu và phương pháp

4 Phân tích định lượng anthocyanin

Chiết riêng khoảng 20mg mẫu

khô với 2ml methanol 80% có chứa 1% TFA bằng sóng siêu

âm trong 20 phút

Lọc qua nút bông, lấy 2ml dịch chiết Đo độ hấp thu ở 521nm và tính toán nồng độ anthocyanin tương

ứng

III Vật liệu và phương pháp

5 Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH

• Tinh sạch hoàn toàn bằng phương pháp sử 1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl (DPPH)

• Hòa tan 10mg dịch chiết từ rễ tươi hoặc khô vào 1ml methanol 80% có chứa 1% TFA rồi lấy 100μl.l

• Thêm vào mỗi dung dịch mẫu 500μl.l dung dịch DPPH ethanol 0,5mM và 400μl.l

methanol 80% có chứa 1% TFA

• Sau đó lắc nhẹ, hỗn hợp phản ứng được để yên trong bóng tối 20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đem đi đo độ hấp thu ở 517nm

Tỷ lệ phần trăm tinh sạch được tính bằng công thức:

Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH (%) = 100 – (Abs của mẫu

phản ứng)/(Abs của mẫu kiểm chứng) × 100

Hoạt tính chống oxy hóa được đo bằng phương pháp TBA sử dụng acid linoleic

III Vật liệu và phương pháp

6 Đo hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp 2–thiobarbituric acid (TBA)

III Vật liệu và phương pháp

6 Đo hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp 2–thiobarbituric acid (TBA)

Tỷ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính bằng công thức:Hoạt tính chống oxy hóa (%) = 100 – (Abs của mẫu phản ứng)/(Abs

của mẫu kiểm chứng) × 100

Tỷ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính bằng công thức:Hoạt tính chống oxy hóa (%) = 100 – (Abs của mẫu phản ứng)/(Abs

của mẫu kiểm chứng) × 100

IV Kết quả và thảo luận

1 Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định

IV Kết quả và thảo luận

1 Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định

Sản lượng sắc tố của rễ bất định

sinh trưởng trong bóng tối thấp

hơn so với rễ nhánh của cây

nguyên vẹn cùng loại trong nghiên

cứu này

Sản lượng sắc tố của rễ bất định

sinh trưởng trong bóng tối thấp

hơn so với rễ nhánh của cây

nguyên vẹn cùng loại trong nghiên

cứu này

Sự phát triển của rễ bất định không bị ảnh hưởng bởi hai điều kiện ánh sáng/tối Khi nuôi cấy rễ bất định (khoảng 45mg trọng lượng tươi/bình 100ml) trong môi trường 1/2 MS lỏng + 0,5 mg/l IBA,chiếu sáng trong bốn tuần, sự hình thành sắc tố

tăng rõ rệt

Rễ bất định được cấy truyền

vào môi trường 1/2 MS lỏng bổ

sung NAA (0,1; 0,5 mg/l) hoặc

IBA (0,1; 0,5 mg/l), nuôi cấy

lỏng lắc tốc độ 100rpm ở 250C,

chiếu sáng 14giờ/ngày hoặc

trong bóng tối

Rễ bất định được cấy truyền

vào môi trường 1/2 MS lỏng bổ

sung NAA (0,1; 0,5 mg/l) hoặc

IBA (0,1; 0,5 mg/l), nuôi cấy

lỏng lắc tốc độ 100rpm ở 250C,

chiếu sáng 14giờ/ngày hoặc

trong bóng tối

Rễ bất định được nuôi cấy trong bình tam giác 100ml (chứa môi

trường ½ MS lỏng + 0.5 mg/l IBA) khoảng 4 tuần ở 250C, chiếu sáng

14 giờ/ngày

Sắc tố đỏ(Anthocyanin)Bóng tối 14h chiếu sáng0.1mg/l NAA

0.5mg/l NAA0.1mg/l IBA0.5mg/l IBA

 : Sản lượng anthocyanin trung bình

 : Sản lượng anthocyanin cao

IV Kết quả và thảo luận

pelargonidin clorua,

cyanidin clorua, peonidin clorua và

delphinidin clorua

Phân tích HPLC để chứng minh rằng anthocyanidin chính của rễ bất định và rễ củ của Peking Koushin là

pelargonidin

Hàm lượng anthocyanin của rễ bất định đông lạnh (0,15% trọng lượng khô) cao hơn của rễ củ một chút (0,11% trọng lượng khô), mặc dù sự khác nhau không có ý nghĩa

ở mức 5% của F test

Kết quả phân tích HPLC của chất chuẩn (A) và dịch thủy phân của rễ củ (B) và rễ bất

định (C)

Hàm lượng anthocyanin trong nuôi

cấy rễ củ và rễ bất định Hàm lượng

anthocyanin tương đương với lượng

pelargonidin Cây được trồng khoảng

3 tháng và khi rễ bất định được 4

tuần tuổi thì nuôi cấy trong điều kiện

chiếu sáng đã được phân tích Số

liệu trung bình của 3 lần thí nghiệm Thanh đại diện cho sai số chuẩn

1, rễ khô; 2, nuôi cấy rễ bất định khô

Nuôi cấy rễ bất định (khoảng 45 mg trọng lượng tươi) trong môi trường ½

MS lỏng + 0.5 mg/l IBA ở 250C, chiếu sáng 14 giờ/ngày trong máy lắc tốc

độ 100rpm

IV Kết quả và thảo luận

3 Thời gian tăng trưởng và hàm lượng anthocyanin trong nuôi cấy rễ bất định

Trọng lượng tươi và khô của rễ bất định tăng lên nhanh chóng trong 2

tuần đầu tiên, tăng đến tuần thứ 7 Athocyanin sản xuất giai đoạn đầu quá trình nuôi cấy, khối lượng lớn nhất trong tuần 5 (khoảng 250 μg/ bình g/ bình

100ml), sau đó giảm dần

Thời gian tăng trưởng (A) và hàm

lượng anthocyanin trong nuôi cấy rễ bất định của Peking Koushin Rễ bất định được nuôi cấy trong môi trường

½ MS lỏng + 0.5 mg/l IBA trong 4

tuần, ở 250C, chiếu sáng 14giờ/ngày

Số liệu trung bình của 3 lần thí

nghiệm Thanh đại diện cho sai số

chuẩn

Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH của 0.2 và 1 mg/ml dung dịch phản ứng chuẩn bị từ những mẫu khác nhau đã được khảo sát 0.2 mg/ml dung

dịch phản ứng cho thấy hoạt tính thấp hơn nhiều so với 1 mg/ml dung

dịch phản ứng

IV Kết quả và thảo luận

4 Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH

Số liệu trung bình trong 3

lần thí nghiệm Thanh đại

diện cho sai số chuẩn 1, rễ

Peking Koushin tươi; 2, rễ

Peking Koushin khô; 4, rễ

bất định Peking Koushin

khô; 5, rễ Aokubi tươi

IV Kết quả và thảo luận

5 Hoạt tính chống oxi hoá đo bằng phương pháp TBA

Các hoạt tính chống oxy hóa trong rễ củ và rễ bất định được xác định bằng phương pháp TBA Các hoạt tính

chống oxy hóa của rễ khô và tươi khoảng 25%

Các hoạt tính chống oxy hóa trong rễ củ và rễ bất định được xác định bằng phương pháp TBA Các hoạt tính

chống oxy hóa của rễ khô và tươi khoảng 25%

Số liệu trung bình trong 3 lần thí

nghiệm Thanh đại diện cho sai số

chuẩn 1,rễ Peking Koushin tươi; 2,rễ

Peking Koushin khô; 3,rễ bất định

Peking Koushin tươi; 4,rễ bất định

Peking Koushin khô; 5, rễ Aokubi tươi

IV Kết quả và thảo luận

5 Hoạt tính chống oxi hoá đo bằng phương pháp TBA

Số liệu trung bình trong 3 lần thí

nghiệm Thanh đại diện cho sai

số chuẩn 1,rễ Peking Koushin

tươi; 2,rễ Peking Koushin khô;

3,rễ bất định Peking Koushin

tươi; 4,rễ bất định Peking

Koushin khô; 5, rễ Aokubi tươi

Hoạt tính chống oxi hóa anthocyanin trong các mẫu khác nhau

(phương pháp TBA)

Hoạt tính chống oxi hóa anthocyanin trong các mẫu khác nhau

(phương pháp TBA)

Kết luận

Từ những kết quả này, nuôi cấy rễ bất định của R.sativus

L cv Peking Koushin, trong đó sản xuất anthocyanin và tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH, các hoạt tính chống oxy hóa (phương pháp TBA), có thể được sử dụng như một

nguồn thay thế màu thực phẩm với hoạt tính sinh học

Từ những kết quả này, nuôi cấy rễ bất định của R.sativus

L cv Peking Koushin, trong đó sản xuất anthocyanin và tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH, các hoạt tính chống oxy hóa (phương pháp TBA), có thể được sử dụng như một nguồn thay thế màu thực phẩm với hoạt tính sinh học

Cảm ơn cô và các bạn!!!