KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH học KHẢO sát sự ẢNH HƯỞNG của DỊCH CHIẾT từ lá cây SỐNG đời (KALANCHOE PINNATA) lên QUÁ TRÌNH TĂNG SINH tế BÀO CÓ NGUỒN gốc từ DA

Các tế bào này khôngchỉ tổng hợp, biến hóa và nối tiếp chéo các protein mới trong quá trình sừng hóa màcòn làm nhiện vụ tự hủy theo chương trình để biến từ tế bào hạt thành tế

Trang 1

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG

ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) LÊN

QUÁ TRÌNH TĂNG SINH TẾ BÀO

Sinh viên thực hiện

NGÔ QUỐC NGUYÊN ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

Trang 2

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH

CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG ĐỜI

(KALANCHOE PINNATA) LÊN QUÁ TRÌNH

TĂNG SINH TẾ BÀO CÓ NGUỒN GỐC TỪ

DA CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS

MUSCULLUS VAR.ALBINO) SƠ CẤP

Giảng viên hướng dẫn

Ths LẠI ĐÌNH BIÊN

Sinh viên thực hiện

NGÔ QUỐC NGUYÊN

Mã số SV: 2008100005

ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN

Mã số SV: 2008100084 Lớp: 01ĐHSH1

Trang 3

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

TP HCM,tháng 6 năm 2014

Ký tên

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành khóa luận này, nhóm chúngtôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị cùng cácbạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, chúng tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chânthành tới:

Thạc sĩ – Lại Đình Biên, người Thầy kính mến đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và

tạo mọi điều kiện thuận lợi cho nhóm chúng tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tập thể các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và Kĩ thuật môi trường, đãtrang bị cho chúng tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý giá trong quá trình học tậptại trường và nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi thực hiện đề tài này

Tập thể các bạn sinh viên khóa 01ĐHSH đã luôn giúp đỡ và động viên chúng tôimỗi khi chúng tôi gặp khó khăn trong quá trình làm việc

Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng do thời gian có hạn, trình độ, kỹ năng của bảnthân còn nhiều hạn chế nên chắc chắn đề tài khóa luận tốt nghiệp này của chúng tôikhông tránh khỏi những hạn chế, thiếu sót, rất mong được sự đóng góp, chỉ bảo, bổsung thêm của thầy cô và các bạn

Trang 5

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi cam đoan rằng khóa luận tốt nghiệp này là do chính chúng tôi thực hiện.Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từbất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào

Tháng 6 năm 2014

Sinh viên thực hiện

NGÔ QU ỐC NGUYÊN

ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN

Trang 6

MỤC LỤC

Trang bìa lót

Nhận xét của giáo viên hướng dẫn

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các bảng biểu và sơ đồ

Danh mục các hình ảnh và biểu đồ

PHẦN MỞ ĐẦU 1

Đặt vấn đề 2

Mục tiêu nghiên cứu 2

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về mô da động vật 4

1.1.1 Các loại tế bào của mô da 4

1.1.2 Cấu trúc mô da 5

1.2.1 Lịch sử nuôi cấy tế bào 8

1.2.2 Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào 9

1.2.3 Các phương pháp tách tế bào từ mô sống 11

1.2.4 Enzyme sử dụng trong tách tế bào 12

1.2.5 K ỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 14

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 18

1.2.7 Tỉ lệ môi trường với mật độ tế bào đem nuôi, lượng mô đem cấy 22

1.2.8 Môi trường nuôi cấy 22

1.2.9 Ðánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy 24

1.3 Đại cương về nguyên bào sợi 25

Trang 7

1.3.2 Đặc điểm của nguyên bào sợi 25

1.3.3 Chức năng của nguyên bào sợi 26

1.3.4 Sơ lược về kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sợi trên thế giới 26

1.3.5 Nguyên bào sợi trong các nghiên cứu và ứng dụng 29

1.4 Sơ lược về cây sống đời (Kalachoe pinata) 30

1.4.1 Nguồn gốc, phân bố và danh pháp cây sống đời 30

1.4.2 Đặc điểm hình thái 31

1.4.3 Công dụng của cây sống đời 32

1.4.4 Thành phần hóa học trong cây sống đời 33

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Vật liệu 35

2.1.1 Dụng cụ - thiết bị 35

2.1.2 Hóa chât 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Phương pháp thu nhận dịch chiết cây sống đời 36

2.2.2 Phương pháp phân lập và nuôi cấy nguyên bào sợi chuột từ da chuột 38

2.2.3 Xử lý số liệu 43

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Thu nhận dịch chiết từ lá cây sống đời 45

3.2 Khảo sát khả năng tách tế bào bằng phương pháp trypsin ấm và trypsin lạnh 45

3.2.1 Trypsin ấm 46

3.2.2 Trypsin lạnh 47

3.3.1 Quá trình tăng sinh và bám của tế bào nguyên bào sợi chuột trong môi trường D’MEM 5% huyết thanh thỏ 50

3.3.2 Quá trình tăng sinh của tế bào nguyên bào sợi chuột trong môi trường D’MEM 5% huyết thanh thỏ có bổ sung dịch chiết từ lá cây sống đời 52

3.4 Khảo sát nồng độ dịch chiết tối ưu khi bổ sung dịch chiết lá cây sống đời vào môi trường nuôi cấy 54

Trang 8

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 61

Trang 10

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 1.4.3.1: Công dụng chữa bệnh của cây sống đời 32

Bảng 1.4.4: Thành phần hóa học trong cây sống đời 33

Bảng 2.2.2.4: Thí nghiệm khảo sát nồng độ trypsin và phương pháp phù hợp để tách tế bào đơn 40

Bảng 3.2.1.1: Tổng mật độ tế bào đơn khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau 46

Bảng 3.2.1.2: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau 46

Bảng 3.2.2.1: Tổng mật độ tế bào đơn khi ủ với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau 47

Bảng 3.2.2.2: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau 47

Bảng 3.2.2.3: Xác định phương pháp phù hợp để tách tế bào đơn 49

Sơ đồ 1.2.5: Quy trình nuôi cấy sơ cấp 16

Sơ đồ 2.2.1: Quy trình thu dịch chiết từ lá cây sống đời 37

Sơ đồ 2.2.2: Quy trình phân lập và nuôi cấy nguyên bào sợi từ da chuột 43

Trang 11

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1.1: Cấu tạo da 5

Hình 1.1.2.1: Cấu trúc lớp biểu bì 6

Hình 1.1.2.2: Mô liên kết trung bì 7

Hình 1.2.4.1: Cấu trúc không gian của enzyme trypsin 13

Hình 1.3.2: Cấu trúc nguyên bào sợi 25

Hình 1.4.1: Cây sống đời 31

Hình 2.2.2.4: Buồng đếm hồng cầu loại 25 ô lớn 41

Hình 3.1: Dịch chiết lá sống đời tươi 45

Hình 3.2: Tế bào được nhuộm trypan blue 46

Hình 3.3.1.1: Tế bào nuôi ngày thứ nhất 50

Hình 3.3.1.2: Tế bào nuôi ngày thứ ba 50

Hình 3.3.1.3: Tế bào nuôi ngày thứ năm 51

Hình 3.3.1.4: Tế bào nuôi ngày thứ bảy 51

Hình 3.3.1.5: Tế bào nuôi ngày thứ tám 52

Hình 3.3.2.1: Tế bào nuôi ngày thứ nhất 52

Hình 3.3.2.2: Tế bào nuôi ngày thứ ba 53

Hình 3.3.2.3: Tế bào nuôi ngày thứ tư 53

Hình 3.3.2.4: Tế bào nuôi ngày thứ năm 54

Hình 3.4.1: Tế bào nuôi ở nồng độ dịch chiết 10μll 55

Trang 12

Đồ thị 3.2.1: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau 47

Đồ thị 3.2.2.1: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau 48

Đồ thị 3.2.2.2: So sánh mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm và trypsin lạnh ởcác nồng độ khác nhau 49

Trang 13

PHẦN MỞ ĐẦU

Trang 14

 Đặt vấn đề

Với quan niệm “ nhất dáng nhì da” thì da xếp thứ hai để quan sát và đánh giá vẻđẹp của một con người Hiện nay do kinh tế xã hội phát triển nên nhu cầu thẩm mỹ về

da ngày càng phát triển, đặc biệt nhu cầu thẩm mỹ trong điều trị bỏng Chính vì những

lý do đó các nhiều nghiên cứu về trị bỏng tức thời và lâu dài bằng cách tạo vật liệu sinhhọc trị bỏng hay da nhân tạo để ghép tự thân Hiện nay, những vật liệu sinh học có bổsung hoạt chất tự nhiên để trị bỏng với những ưu điểm như kháng viêm, kháng khuẩn,tính sinh miễn dịch thấp… trong việc tạo da nhân tạo bằng nuôi cấy tế bào da để ghép

tự thân đang là tiêu chuẩn vàng để tạo vết da đẹp và liền không có vết sẹo Trên thếgiới, công nghệ này liên tục được nghiên cứu hoàn chỉnh về quy trình công nghệ nuôicấy tế bào Nhiều nước đã đạt những tiến bộ vượt bậc trong điều trị bỏng và tổn thươngmất da, nhiều nạn nhân bỏng sâu và rộng trên 70% diện tích đã được cứu sống cũngnhư giảm thiểu các di chứng nặng do mất da để lại

Tại Việt Nam là một nước rừng nhiệt đới nên có rất nhiều loại cây cỏ và hoạt chấtứng dụng trong trị bỏng Hiện nay các nghiên cứu về sử dụng hoạt chất thiên nhiên ứngdụng trong trị bỏng ngày càng nhiều dựa theo các phương pháp dân gian thì các cây cóứng dụng trị bỏng giúp trị lành vết thương như dầu mù u, củ nghệ, mỡ trăn cây sốngđời… Trong các loại cây, thì chỉ có vài cây được khoa học nghiên cứu và khẳng địnhtính năng trị bỏng như dầu mù ứng dụng trong việc tạo màng sinh học trong trị bỏng ,cucurmine trong củ nghệ ứng dụng trong mỹ phẩm có chức năng trị lành vêt thương.Tuy nhiên, cây sống đời một loại cây cũng được dân gian sử dụng nhiều trong trị bỏnglại chưa có đề tài và sự nghiên cứu về công dụng trị bỏng của nó chính vì vậy chúng tôi

tiến hành đề tài : “Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch chiết từ lá cây sống đời

(Kalanchoe pinnata) lên quá trình tăng sinh tế bào nguyên bào sợi da chuột nhắt trắng (Mus muscullus var.albino)”

Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát khả năng tách của tế bào bằng hai phương pháp trypsin ấm và trypsinlạnh

Khảo sát khả năng bám và tăng sinh của tế bào sau thời gian nuôi cấy trong môitrường có bổ sung dịch chiết

Trang 15

Xác định nồng độ dịch chiết tối ưu cho khả năng bám dính của tế bào nguyên bàosợi chuột trong giai đoạn nuôi sơ cấp.

Từ những yếu tố trên chúng tôi sẽ xây dựng được quy trình phân lập, và nuôi cấy tếbào nguyên bào sợi da có bổ sung dịch chiết cây sống đời trong môi trường nuôi cấy

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 16

1.1 Đại cương về mô da động vật [3]

Da là mô lát tầng, là một loại mô liên kết biểu bì Cấu trúc của da có một điểm đặcbiệt là chúng có nhiều lớp tế bào, trong đó các lớp ngoài luôn bị thoái hóa, bong ra vàthay thế bằng các lớp tế bào bên dưới Nguồn gốc của sự thay mới thường xuyên này là

do một lớp tế bào của da ở vị trí tiếp giáp với mô liên kết có khả năng thường xuyêntạo tế bào mới Đây chính là tế bào mầm của cơ thể trưởng thành, có khả năng tạothành những dòng tế bào ổn định phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng Chính vì vậy,

da có tiềm năng lớn trong công nghệ tế bào

1.1.1 Các loại tế bào của mô da

1.1.1.1 Keratinocyte

Tế bào keratin (keratinocyte) thường thấy ở lớp biểu bì – lớp ngoài cùng của da.Keratinocyte chiếm đa số trong biểu bì Các keratinocyte trưởng thành khi nó dichuyển từ tầng dưới lên để hình thành tầng mới bên trên Keratinocyte xây dựng mộtkhung tế bào rất vững chắc nhờ thay đổi sự biểu hiện của các loại vi sợi keratin từkeratin 5 và 14 thành keratin 1 và 10 Keratinocyte có khả năng sản xuất ra protein cóvỏ keratin như involucrin và loricrin cho việc chuẩn bị hình thành tế bào sừng(corneocyte) Keratin do keratinocyte tạo ra luôn có xu hướng tích lũy theo hướng lêntrên, do đó các tế bào ở phía trên của lớp biểu bì thường tích lũy nhiều keratin và tạothành tầng sừng Sự tích lũy chất keratin trong các tế bào của lớp biểu bì tạo nên sựsừng hóa tế bào

1.1.1.2 Fibroblast (nguyên bào sợi)

Fibroblast là những tế bào có khả năng tạo sợi Fibroblast thường thấy ở lớp dachính thức

1.1.1.3 Melanocyte (hắc tố bào)

Melanocyte là loại tế bào có trong mô biểu bì với mật độ khá ít, thường tập trung ởtầng sinh sản Melanocyte tạo màu cho da, lông, tóc nhờ tạo ra các hạt sắc tố melanin

và ngấm vào keratin

1.1.1.4 Tế bào Langerhans

Tế bào Langerhans là những đại thực bào (macrophage) có hình sao, có vai tròtrong miễn dịch

1.1.1.5 Tế bào Merkel

Tế bào Merkel là những tế bào ít phân bố trong mô biểu bì, chúng tập trung chủ yếu

ở lớp da chính thức Tế bào Merkel là loại tế bào thần kinh làm nhiệm vụ thụ quan cảmgiác, có khả năng trả lời các kích thích nhiệt độ, áp suất, xúc giác…

Trang 17

Lớp mầm (stratum germinatum)

Lớp mầm được tạo thành bởi một hàng tế bào khối vuông và trụ có khả năng phânchia liên tục, sản sinh ra các tế bào cho lớp biểu bì Gồm các loại tế bào: tế bào sừng, tếbào hắc sắc tố, tế bào Langerhans và tế bào Merkel

Lớp gai (stratum spinosum hoặc filamentosum)

Gồm các tế bào có hình khối đa điện, nhân tròn, nằm trên lớp đáy, có 7 – 15 tầng tếbào Những kẽ trống giữa các tế bào này chứa dịch nuôi được tạo ra từ lớp nhú củatrung bì để trao đổi dinh dưỡng với tế bào biểu bì Các khe trống này bảo đảm cho sựchuyển hóa, tăng trưởng và biệt hóa của các tế bào sừng Các đầu tận cùng của dâythần kinh nhận cảm giác đau cũng nằm rải rác trong các khe này

Lớp hạt (stratum granulosum)

Trang 18

Gồm những tế bào dẹt có nhân chứa các chất sừng trong suốt Các tế bào này khôngchỉ tổng hợp, biến hóa và nối tiếp chéo các protein mới trong quá trình sừng hóa màcòn làm nhiện vụ tự hủy theo chương trình để biến từ tế bào hạt thành tế bào sừng.Lớp bóng (stratum lucidum)

Là lớp tế bào trong suốt, được hình thành tạo nên từ lớp đáy, các lớp tế bào giàđược đẩy dần ra khỏi môi trường nuôi dưỡng và sự biệt hóa cũng hoàn thành Lớpbóng nằm ngay dưới lớp tế bào sừng, có chức năng giữ cho da không bị mất nước vàbảo vệ lớp tế bào phía dưới đối với các tác động cơ học

Lớp sừng (stratum corneum)

Là lớp ngoài cùng có 15 – 20 tầng tế bào, có hình khối dẹt rộng, hoặc hình đa điện.Các tế bào này đã mất khả năng sống, hoàn toàn sừng hóa Chúng dính chặt vào lớp tếbào trong suốt tạo thành một lớp bảo vệ ngoài cùng của da

Hình 1.1.2.1 Cấu trúc lớp biểu bì

1.1.2.2 Lớp trung bì (dermis)

Trung bì nằm dưới lớp biểu bì, dày từ 0,7 – 7mm, dày hơn chiều dày của biểu bì từ

15 – 40 lần Trung bì là một lớp xơ rất chắc, được tạo nên từ các chất nền (chất gianbào), các tế bào liên kết, bó sợi liên kết, sợi đàn hồi, các tuyến ống, cơ dựng nang lông,mạch máu và dây thần kinh Nguyên bào sợi được coi là tế bào chủ của trung bì, chúngsản sinh ra chất keo mạng lưới (reticular collagen), các sợi đàn hồi và các chất nền củatrung bì Trung bì gồm hai lớp: lớp nhú và lớp lưới

Lớp nhú

Trang 19

Là một lớp tế bào mỏng, nằm sát ngay dưới màng nền và lớp tế bào mầm của lớpđáy hình thành nhiều gai nhú gồ lên hình làn sóng Lớp nhú có các sợi tơ tạo keo, sợi tơđàn hồi, chất keo đặc giữa các sợi tơ và các tế bào liên kết, bạch cầu, tế bàoLangerhans… Lớp nhú là nơi trao đổi các yếu tố tăng trưởng, cytokine và các chất cơbản của trung bì gắn kết với các tế bào biểu bì qua thụ cảm xuyên màng.

Lớp lưới (reticular dermis)

Có chiều dày 4 – 5mm, có ít tế bào và mạch hơn lớp nhú Lớp lưới chứa các bó sợiliên kết gồm các sợi tạo keo, sợi đàn hồi, các sợi bắt màu bạc Lớp lưới chia làm haivùng: vùng trên (nông) có nhiều tế bào liên kết, nguyên bào sợi, tế bào viêm, các bókeo, các sợi chun dãn xếp theo hướng ngang và vùng dưới (sâu)

Chức năng của lớp lưới là làm nền cho da bền chắc

Hình 1.1.2.2 Mô liên kết trung bì

1.1.2.3 Lớp hạ bì (hypodermis, subcutis)

Là một lớp mô liên kết – mỡ, dày 0,25mm đến vài cm Hạ bì gồm 3 lớp: lớp mỡ,lớp chân nông và lớp tế bào dưới da

- Lớp mỡ: các bó xơ dày to hình nón quây thành những khoang chứa các tế bàomỡ Chúng góp phần tạo hình, dự trữ năng lượng và cách nhiệt

- Lớp chân nông: có chỗ dày tới 1mm

- Lớp tế bào dưới da: là mô liên kết lỏng lẻo, làm cho da dễ dàng di động trên cơ,gân, xương Các tổ chức tế bào lỏng lẻo này có khả năng thấm nước và các chấthòa tan của dịch

Trang 20

1.2 Sơ lược về nuôi cấy tế bào

1.2.1 Lịch sử nuôi cấy tế bào [7, 10, 21]

Năm 1883, người ta có thể duy trì được các tế bào phôi gà trong dung dịch nướcmuối

Năm 1709, Harrison đã tách tế bào thần kinh ếch và nuôi trong môi trường bạchhuyết Sau vài tuần nuôi cấy, ông thấy có sự xuất hiện và tăng trưởng những tế bào nàytrên mẫu cấy

Năm 1910, Roux tiếp tục nghiên cứu trên những tế bào ung thư ở gà

Năm 1913, Carrel và công sự đã làm nhiều thí nghiệm chứng minh được tế bào

động vật hoàn toàn có thể sống được một khoảng thời gian dài trong điều kiện in vitro,

nếu thường xuyên cung cấp các chất dinh dưỡng vô trùng cần thiết Đến năm 1923, ôngthiết kế ra hộp chuyên sử dụng để nuôi cấy mô động vật trong điều kiện vô trùng gọi làhộp Carrel

Năm 1948, Earle đã tiến hành phân lập các tế bào và nuôi cấy chúng trong điềukiện môi trường đặc biệt

Năm 1952, Grey đã tách và nuôi thành công tế bào ung thư cổ tử cung người(HeLa) Đây là một trong những dòng tế bào tốt nhất được tạo ra đầu tiên trên thế giới

từ khối u cổ tử cung của một phụ nữ 31 tuổi tên Henrietta Lacks

Năm 1954, Levi – Moutalcini đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất điều hòa

tăng trưởng lên khả năng phát triển của tế bào trong nuôi cấy in vitro.

Năm 1955, Eagle và năm 1965, Ham đã tìm được môi trường và quy trình nuôi cấythích hợp cho nhiều loại mô khác nhau của người và động vật

Năm 1961, I.A.Macpherson và M.G.P Stoker tạo được dòng nguyên bào sợi thậnchuột đồng con (BHK-21) Dòng tế bào được sử dụng rộng rãi là dòng 13 từ thận của 5con chuột một ngày tuổi chưa xác định giới tính, những chú chuột đồng này thuộc loài

Mesocriteus auratus Công việc nuôi cấy tiến hành liên tục trong 84 ngày và dòng 13

được phân lập từ tế bào đơn

Năm 1962, George Todaro và Howard Green đã tạo được dòng nguyên bào sợi phôi

chuột (3T3) từ mô phôi của chuột Mus musculus Dòng tế bào này được ứng dụng

trong nghiên cứu các protein cơ bản của sợi myelin

Năm 1964, J Ponten và E Saksela đã tạo ra dòng tế bào ung thư xương người (U-2OS), có nguồn gốc từ dòng 2T được phân lập từ mô xương của một bé gái 15 tuổi bịbệnh về xương

Trang 21

Năm 1966, J.P Jacobs tạo ra dòng nguyên bào sợi phổi bào thai người (MRC-5) từkhối u mô phổi thai nhi 14 tuần tuổi Dòng tế bào này được sử dụng trong việc pháttriển vaccine, trong chuyển nhiễm tế bào chủ để nghiên cứu virus và kiểm tra cytotoxic

in vitro.

Năm 1972, D.J Giard và cộng sự đã tạo được dòng tế bào ung thư biểu mô phổingười (A-549) từ khối u của biểu mô phổi ở một nam giới người Caucasian 58 tuổi.Dòng tế bào này được dùng để nghiên cứu về những bệnh có liên quan đến hệ hô hấp

Từ năm 1970 – 1980, sản xuất được kháng thể lai đơn dòng

Từ năm 1987 – 1995, kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã tạo ra nhiều loại sản phẩm sinhhọc từ các tế bào biến đổi di truyền

Sự phát triển của nuôi cấy mô như là một kĩ thuật tinh vi hiện đại nhờ vào sự cầnthiết của hai nhánh chính nghiên cứu về y học: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứuvề ung thư Sự tiêu chuẩn hóa các điều kiện và các dòng tế bào để sản xuất và thínghiệm virus rõ ràng đã thúc đẩy sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô hiện đại, cụthể là tạo ra một lượng lớn tế bào phù hợp cho các phân tích sinh hóa Cùng với sự pháttriển của những kỹ thuật khác đã tạo nên những sản phẩm môi trường và huyết thanhđáng tin cậy được thương mại hóa, và kiểm soát tốt hơn về ngoại nhiễm với các khángsinh và thiết bị làm sạch không khí, làm nuôi cấy mô có thể được quan tâm rộng rãi

1.2.2 Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào

1.2.2.1 Sự điều hòa trao đổi chất [11]

Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào Sựchuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của

cơ thể sống

Ở vi sinh vật, quá trình trao đổi chất là quá trình xảy ra giữa tế bào và môi trườngsống Do đó, ngoài các yếu tố ảnh hưởng từ bên ngoài (nhiệt độ, pH, nồng độ các chấtdinh dưỡng, các chất độc…), tế bào còn phụ thuộc rất nhiều vào các hoạt động củaenzyme

Ở tế bào thực vật, ngoài tác động của enzyme, quá trình trao đổi chất còn chịu tácđộng rất mạnh bởi hệ dịch bao quanh tế bào

Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme, hệ dịch quanh tế bào như ở thực vật,chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh Hệ thần kinh thu nhận những phản xạphong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quátrình trao đổi chất ở tế bào Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất

Trang 22

chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh Do đó, việc điều khiển trao đổi chất của tếbào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp.

Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình dinh dưỡng tế bào trong cơ thể Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất

của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theoquy luật của mô và của cơ thể đa bào Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiệntrên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của enzyme, đâycũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sảnphẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân chia tế bào

Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kếtquả:

- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào

- Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào

Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, còn sự hiểubiết về đặc trưng riêng biệt giúp ta điều chỉnh (hay điều khiển) để tính trạng đó đượcbiểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy

Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển của chính tế bào đó trong cơ thể Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in vitro là những

tác động trực tiếp Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này không chỉ chịu tácđộng trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp Do đó, mọi tác động của môi

trường đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần tạo ra sự hài hòa

trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được nuôi cấy

1.2.2.2 Tính chất cơ học yếu [8]

Ở tế bào vi sinh vật, tế bào được bao bọc bởi thành tế bào – được cấu tạo từ nhữnghợp chất hữu cơ khá bền, khó bị phân hủy khi tế bào còn đang phát triển Ở tế bào thựcvật, thành tế bào còn được cấu tạo bởi hợp chất lignocellulose hay pectinocellulose, cáchợp chất này tạo ra tính chất cơ học, hóa học, vật lý khó bị phân hủy hơn rất nhiều sovới cấu trúc thành tế bào của vi sinh vật

Tế bào động vật hoàn toàn không có thành tế bào, mà chúng chỉ được bao bọc bởimột màng tế bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào khác trong

mô Mặt khác, kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10 μlm, lạikhông có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu Do đó, khi nuôi cấy cầnnhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào (Phan Kim Ngọc, 2002)

Trang 23

1.2.2.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng rất chậm [7]

Do đặc điểm di truyền, các tế bào vi khuẩn thường phân chia với tốc độ rất nhanh,khoảng 20-50 phút Ở động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo dài 20-70giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nếu trong một điều kiện nào đó,một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất thường, cơ thể sẽchuyển sang trạng thái bệnh lý

1.2.2.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi [8]

Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bàođộng vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia Tế bào sẽ ngừng phân chiakhi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi Tuy vậy, một sốdòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường (sau khiđược thuần hóa) có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cầnbám vào giá đỡ

1.2.2.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng [11]

Đây là cơ chế kiềm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (negative feed – back) Bất kỳ tếbào sinh vật nào cũng biểu hiện cơ chế này, điểm khác biệt của tế bào động vật là ở chỗquá trình tổng hợp sản phẩm thừa ít xảy ra và thường thì các sản phẩm trao đổi chấtthoát ra khỏi tế bào rất chậm

1.2.2.6 Khả năng tiếp nhận gene lạ [11]

Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên.Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ởtrạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (từ virus…) hoặckhi cho những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ xảy rahiện tượng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai

1.2.2.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo [11]

Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải được bảoquản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ được những đặc tính riêngcủa nó

Bằng cách sử dụng Nitrogen lỏng (-1960C), tế bào động vật vẫn duy trì được đặctính của chúng trong thời gian rất dài Phương pháp này được áp dụng nhiều ở các ngânhàng giống động vật trên thế giới

Khi sử dụng, tế bào động vật được tiến hành giải đông và được hoạt hóa để phụchồi khả năng tăng trưởng và phân chia như trước khi đem bảo quản

Trang 24

Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trường, rất nhạy cảmvới kim loại Trong quá trình phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyếtthanh, hormone.

1.2.3 Các phương pháp tách tế bào từ mô sống [3, 20 ]

Các tế bào trong mô sống thường gắn kết chặt chẽ với nhau nên không thể nuôi cấytrong môi trường nhân tạo Chính vì vậy cần phải tách rời các tế bào tạo thành dịch tếbào trước khi chuyển sang nuôi cấy Có hai phương pháp để tách tế bào từ mô sống:

- Phương pháp cơ học: Sử dụng để tách các mô có liên kết giữa các tế bào tươngđối lỏng lẻo như mô tủy xương, các mô mềm như mô não Nguyên tắc để tách tếbào bằng phương pháp cơ học là dùng lực cơ học đẩy mô qua các rây kín loại cóđường kính lỗ tương ứng với kích thước tế bào cần tách Phương pháp cơ học có

ưu điểm là không tốn kém, dễ thực hiện tuy nhiên chỉ thích hợp với một số loạimô

- Phương pháp enzyme: Các liên kết giữa các tế bào mô sống của động vật đều cóbản chất protein Phương pháp tách tế bào bằng enzyme sử dụng các protease đểphân cắt protein của các liên kết này từ đó tách rời các tế bào

1.2.4 Enzyme sử dụng trong tách tế bào [3]

Về nguyên lý, tất cả các enzyme thủy phân protein đều có thể tham gia tách tế bào.Một số protease như dipase I và II, pronase, papain… đã được sử dụng trong tách tếbào Ưu điểm của các enzyme này là chúng có nguồn gốc không phải từ động vật và cóthể sử dụng chúng với sự hiện diện của huyết thanh Nhưng chúng lại không bị bất hoạtbởi huyết thanh, dẫn đến phải loại bỏ chúng thông qua việc rửa tế bào sau khi tách –quá trình này có thể làm tổn thương tế bào

Trypsin là enzyme có thể khắc phục được các nhược điểm kể trên do sau khi sửdụng nó có thể bị bất hoạt dễ dàng bằng huyết thanh Phương pháp trypsin hóa đượcLitwin (1971) tiêu chuẩn hóa trong sự tách tế bào và nuôi cấy fibroblast lưỡng bội ởngười

1.2.4.1 Cấu trúc của enzyme trypsin

Trypsin là một serine protease gồm một chuỗi polypeptide gồm 249 acid amin,trọng lượng phân tử khoảng 22 680 – 23 400 Dalton Serine protease thuộc họ enzymeproteolyse, sử dụng cơ chế phản ứng xúc tác nucleophile (ưa hạt nhân), với gốc serinenhư là nucleophile phản ứng

Trang 25

Hình 1.2.4.1 Cấu trúc không gian của enzyme trypsin

Các thành viên của họ này được biết đến nhiều nhất là ba enzyme trypsin,chymotrypsin và elastase Chúng tạo thành một nhóm thực hiện nhiệm vụ tiêu hóatrong cơ thể động vật

Môi trường thích hợp cho hoạt động của trypsin là môi trường acid yếu, có pH từ6,9; tối ưu ở 8,9 Hoạt tính của trypsin bị kiềm hãm bằng huyết thanh thai bò hoặc di –isopropyl fluoro phosphate (DFP) Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạttính xúc tác của trypsin giảm 50% khi thiếu Ca2+

1.2.4.2 Cơ chế tác động của trypsin trong quá trình tách tế bào

Vị trí tác động của enzyme trên phân tử protein

Trypsin, chymotrypsin và elastase đều là các endopeptidase, cắt chuỗi protein tạicác nối peptide bên trong mạch

Mỗi enzyme có vị trí cắt ưa thích tại mạch nối kề cận với kiểu gốc amino acid đặctrưng Trypsin cắt nối peptide ngay tại các nhóm carbonyl của gốc amino acid base(lysine hay arginine)

Tác động của enzyme tách tế bào lên tế bào nuôi cấy

Trypsin không tách tế bào từ bề mặt nhưng dẫn đến sự cuộn tròn tế bào Nó khởiđầu hoạt động trên khung tế bào cũng như trên các thành phần bề mặt của phức màngtế bào – khung tế bào

Các nghiên cứu của Bailey và cộng sự (1980) cho thấy trypsin làm phân tán các sợicăng nhằm thay đổi hình dạng tế bào Khi tế bào co lại, màng tế bào trở nên bị nhúmlại với nhiều lỗ rỗng và vi sợi Quá trình này dần dần làm tế bào cuộn tròn Trong quátrình cuộn tròn, vị trí và sự hợp nhất của các vị trí dính được duy trì Bề mặt chất nềnđược bao phủ bởi các chất còn lại của các sợi co lại và các cấu trúc giống như tấm nhỏ

Trang 26

Các tế bào được làm tròn này được gắn kết rất lỏng lẻo và cuối cùng có thể dễ dàngtách ra bằng các biện pháp cơ học.

Tuy nhiên sự kéo dài xử lí trypsin sẽ tạo tổn thương cho tế bào Ngoài tổn thươngbề mặt, trypsin còn tạo sự tổn thương bên trong chẳng hạn như sự thủy phânpolyribosome Các nghiên cứu của Hodges và cộng sự (1973) trên tế bào Hela và tếbào thận CBM17 ở chuột cho thấy trypsin đánh dấu có thể tìm thấy bên trong tế bàochất, nhân và hạch nhân của tế bào nuôi cấy Để giảm tiềm năng gây tổn thương tế bàocủa trypsin, McKeehan (1977) đã nghiên cứu và đề ra biện pháp giảm nhiệt độ trongquá trình trypsin hóa Nói chung, trypsin được sử dụng ở khoảng nồng độ từ 0,01% -0,5% Thường nồng độ sử dụng là 0,25% trong thời gian là 5 – 15 phút

Quá trình trypsin hóa cũng chịu ảnh hưởng của pH, pH thuận lợi cho hoạt động củatrypsin trong quá trình tách tế bào ở khoảng 7,4 – 8,0

Tế bào bị tổn thương do quá trình trypsin hóa có thể phục hồi sau khi bất hoạttrypsin Tuy nhiên, khi sử dụng môi trường không huyết thanh việc bất hoạt trypsin cóthể được thực hiện bằng việc sử dụng chất ức chế trypsin hoặc rửa tế bào nhiều lần

1.2.5 K ỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật [17]

Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩmsinh - dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men Từ lâu, hệ lênmen đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men Đầu tiên, sự lên men làthuật ngữ dùng cho sản xuất cồn Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyêntắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… Kết quả dẫn đến

sự phát triển nhanh chóng các phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau

Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế bào độngvật và thực vật Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơnnhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế bào nàydiễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào Các tế bàođộng vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúngkhông có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ Do đó, các hệ thốngkhuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn Mặc dù có một số điểmkhông thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vậtít nhất cũng vài chục năm trước đây Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, cáctế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấychìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác

Trang 27

Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằng cáchđưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo Việc cung cấp khí trực tiếp có thể tạo

ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông quaống silicone Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra hiện tượngtạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêmoxygen Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo rabọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng

Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng để nuôi cấysinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù Nếu muốn nuôi cấymột dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mang như là microcarrier.Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy là CHO4,NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người

Người ta có thể sử dụng tế bào tự do (bạch cầu, limpho,…) hoặc tế bào của mô đểnuôi cấy Mô được phẫu thuật trong môi trường vô trùng, cắt thành mảnh nhỏ và được

xử lý bằng enzyme kết hợp với kỹ thuật nghiền mô để tách thành tế bào riêng biệt ởdạng huyền phù Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào tự do thường ở dạng huyềnphù, còn tế bào mô thường bám vào đáy bình thành lớp Người ta sử dụng buồng đếmhoặc máy đếm tự động để tính toán số lượng tế bào theo từng giai đoạn phát triển.Người ta có thể thực hiện các mẻ cấy liên tục bằng cách trích một phần mẻ cấytrước để cấy chuyền vào môi trường mới, nếu là mẻ bám thì phải sử dụng enzyme đểtách riêng tế bào và phải làm rất nhanh trong vòng 15 phút vì enzyme có thể gây hạicho tế bào

Nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyềnđầu tiên (subculture)

Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng tế bàokhác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm vànhững tế bào khác (được gọi là tế bào nhiễm) Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơhọc hay enzyme khi tách mô hay bằng cách duy trì các điều kiện chọn lọc dương tínhcho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận

Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm:

- Bước 1: Thu nhận mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống

- Bước 2: Phẫu tích và (hoặc) tách rời tế bào, xác định nồng độ

- Bước 3: Nuôi cấy tế bào

Trang 28

Sơ đồ 1.2.5 Quy trình nuôi cấy sơ cấp

Thu nhận mẫu mô

Cắt nhỏ (Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Trang 29

Thu nhận mẫu và xử lí sơ bộ

Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ mô nào của cơ thể, trước khi lấy phải làmsạch mô tại vị trí lấy, đưa mô vào bảo quản trong dung dịch DPBS, nhanh chóngchuyển về phòng thí nghiệm

Xử lí mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh,kháng nấm, sau đó cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa,… mẫu mô cần được cắt nhỏthành từng mảnh 2-3 mm2

Tách rời các tế bào

Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như:

- Tách tế bào bằng cơ học: nghiền, ép

- Tách tế bào bằng cách ủ với enzyme trypsin hay collagenase

- Tách tế bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng

- Tách tế bào bằng phương pháp dựa vào marker bề mặt

Kết quả của giai đoạn này thu được dịch tách tế bào

Nuôi cấy

- Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào

- Li tâm 1000 vòng/ph trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

- Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng vortex

- Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào một bình nuôi cấy (bìnhRoux) và bổ sung 1ml môi trường

- Ủ ở 37,50C trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ

Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp Đối với trường hợp lượngmẫu mô quá ít, người ta nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào sơ cấp

Đời sống tế bào động vật trong nuôi cấy

Tế bào mô động vật, đặc biệt là động vật có vú có đặc điểm là khi nuôi cấy, dù làcấy chuyền chỉ qua được 50 thế hệ, sau đó chúng thoái hóa và chết Số thế hệ tế bàotùy thuộc vào độ biệt hóa của mô mà ta lấy tế bào Đối với tế bào gốc thì khả năng sinhtrưởng sẽ dài hơn so với tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trưởng dàihơn tế bào gốc cơ thể trưởng thành Tuy vậy, người ta đã tạo ra được các dòng tế bào

“bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trưởng liên tục trong môi trường cấy chuyền Đóchính là các tế bào ung thư của cơ thể hoặc là dạng tế bào được làm chuyển dạng “ungthư hóa” với những biến đổi di truyền Sự chuyển dạng thường được thực hiện nhờ tácnhân gây đột biến, nhờ virut, nhờ gen ung thư,… Ngày nay, người ta đã nuôi cấy và cất

Trang 30

giữ nhiều dòng tế bào “bất tử” nhân tạo như các dòng tế bào chuột, chuột Hamster TQ,khỉ,… hoặc lấy từ cơ thể từ các mô ung thư tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung) haytế bào Namalwa (tế bào ung thư limphoma của một phụ nữ có tên là Namalwa).

Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy

Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 3 pha:

- Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôicấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển Thời gian này dài hay ngắn tùythuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được trích tế bào

- Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăngnhanh số lượng tế bào trong khoảng thời gian từ 15 – 25 giờ với số lượng tếbào đạt 1-2 x 106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ

- Pha dừng (Stationary phase) là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó sốlượng tế bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dưỡng nghèo dần vàbắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại Bắt đầu xuất hiện tự hoạitế bào thể hiện ở chỗ nhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành cácmảnh khối có thể quan sát được dưới kính hiển vi Muốn cho tế bào tiếp tụcsinh trưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào [19, 15]

1.2.6.1 Môi trường và các yếu tố bổ sung

Ảnh hưởng của môi trường bên ngoài lên quá trình nuôi cấy tế bào biểu hiện qua 4con đường:

1 Tính tự nhiên của giá thể rất có ý nghĩa trong quá trình nuôi cấy, nơi tế bào

sẽ gắn bám và tăng trưởng Giá thể phù hợp thì tế bào tăng trưởng mạnh –điều này tạo ra tính đồng nhất trong tăng trưởng, có thể nuôi cấy lớp đơn trênnhiều giá thể khác nhau như: trên đĩa plastic, giá thể bán rắn (trong một loạigel, collagen, ager hoặc trong dung dịch nuôi cấy dịch treo)

2 Sự cấu thành của các yếu tố lý hóa và sinh lý của môi trường

3 Sự thiết lập về giai đoạn pha khí

4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ

Việc nuôi những tế bào từ những mảnh mô có thể được cấy chuyền và tăng sinh in

vitro dẫn đến việc thử nghiệm tạo ra nhiều môi trường hơn để duy trì sự tăng trưởng

của dòng tế bào liên tục và thay thế môi trường tự nhiên như: dịch chiết phôi, dịch thủyphân protein, lympho…

Trang 31

Sự tiếp cận để phát triển một môi trường mới bắt đầu với một môi trường giàu chấtdinh dưỡng như: Ham’s F12 hoặc môi trường 199 được bổ sung với nồng độ cao củahuyết thanh (20%) và dần dần thử nghiệm giảm bớt huyết thanh bởi sự thay đổi nồng

độ của các thành phần tồn tại trong môi trường và thêm vào các yếu tố mới

1.2.6.2 Yếu tố bề mặt của chai nuôi – giá thể

Phần lớn tế bào động vật có xương sống có khả năng tăng trưởng thành từng lớp

đơn trên bề mặt nhân tạo trong điều kiện nuôi in vitro Từ những cố gắng sớm nhất,

thủy tinh đã được sử dụng như là giá thể, khởi đầu do đặc tính quang học của nó,nhưng do tế bào cần dàn trải, gắn bám lên trên một bề mặt giá thể thích hợp cho sựtăng trưởng nên để khắc phục tình trạng này người ta đã dùng nhựa plastic do chúng cóđặc tính quang học tốt và bề mặt tăng trưởng bằng phẳng, tạo ra được các đơn vị tăngtrưởng tế bào và sự tái tạo trong nuôi cấy

Hiện nay, đa số người ta thích dùng polystyrene Ngoài ra còn có các loại giá thểbán thấm, các loại vi giá thể và các giá thể nhân tạo khác Sự lựa chọn giá thể đượcquyết định dựa vào:

- Khả năng sinh sản của tế bào

- Sự tăng của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn

- Việc nuôi nên để thông khí hay bịt kín

- Mẫu chuẩn và mẫu thí nghiệm được thực hiện hay không

- Giá cả hợp lí

1.2.6.3 Yếu tố vật lý

Áp suất thẩm thấu

Hầu hết tế bào được nuôi có một giới hạn chịu đựng khá rộng về áp suất thẩm thấu.Trong thực tế, áp suất thẩm thấu giữa 260 mOsm/kg và 320 mOsm/kg thường đượcchấp nhận cho hầu hết những tế bào, nhưng nên có một sự chọn lựa và nên giữ ở mứcsai số ±10 mOsm/kg

Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào vì nó làm ảnh hưởng đến

pH do sự thay đổi về ion và pKa của dung dịch đệm pH nên được điều chỉnh thấp hơn0,2 đơn vị ở nhiệt độ phòng hơn là ở 36,50C

Nhiệt độ tối ưu cho tế bào nuôi phụ thuộc vào:

- Nhiệt độ cơ thể của động vật nơi tế bào được thu nhận

- Tùy thuộc vào các vùng khác nhau về nhiệt độ cơ thể (như da và tinh hoàn

có nhiệt độ thấp hơn các vùng khác trong cơ thể)

Trang 32

Tất cả yếu tố an toàn theo sau trong điều kiện nuôi cấy:

- Nhiệt độ được quan tâm đối với người và dòng tế bào động vật máu nóng tốtnhất là 36,50C Gần với nhiệt độ cơ thể nhưng thấp hơn để đảm bảo an toàn,nhiệt độ quá cao ảnh hưởng nghiêm trọng hơn nhiệt độ thấp

- Tế bào nuôi có thể dừng tăng trưởng dựa vào điều khiển nhiệt độ, có thể tồntại một vài ngày ở 40C và có thể bị đông lạnh, ngừng hoạt động sinh lý ởnhiệt độ lạnh sâu -1960C, nhưng không thể tồn tại ở nhiệt độ 20C trong điềukiện bình thường khoảng một vài tiếng và chết khá nhanh ở nhiệt độ 400C vàcao hơn

Tính nhớt

Tính nhớt của môi trường bị ảnh hưởng bởi các thành phần của huyết thanh vàtrong một số trường hợp, ảnh hưởng một ít lên sự tăng trưởng tế bào Tính nhớt trở nênđặc biệt quan trọng khi mà nuôi dịch treo được lắc hoặc khi dịch nuôi cấy được khuấyhoặc khi tế bào được tách ra sau khi bị trypsin hóa

Áp lực sức căng bề mặt và sự tạo bọt

Áp lực sức căng bề mặt được sử dụng để kiểm soát sự bám dính của mảnh mô đượccấy nguyên phát với giá thể Trong nuôi cấy dịch treo với 5% CO2 trong không khí thìbọt được tạo ra trong môi trường chứa huyết thanh Sự thêm vào của một Siliconekháng bọt (Dow chemical) hoặc Plunoric F68 (Wyandotte) giúp cải thiện điều này bởilàm giảm áp lực sức căng bề mặt

Ảnh hưởng của sự tạo bọt đến sự biến tính protein và nguy cơ của việc nhiễm giatăng vẫn chưa được xác định rõ ràng, nếu sự tạo bọt gia tăng đến cổ của lọ nuôi, tốtnhất là nên tránh

Yếu tố hóa học

- Oxygen: Phần quan trọng trong cấu tạo của pha khí là O2 và CO2 Áp lực O2 phùhợp với hầu hết các loại tế bào nuôi, cơ quan, đặc biệt là gia đoạn muộn củaphôi, cá thể mới sinh hoặc trưởng thành đều cần đến 95% O2 trong pha khí.Chiều sâu của môi trường có ảnh hưởng đến tỉ lệ khuếch tán oxy hòa tan của tếbào, thích hợp nhất nên giữ độ sâu của môi trường trong khoảng 2 – 5mm

- Dioxide carbon (CO2): CO2 có nhiều vai trò quan trọng như: ảnh hưởng đếnnồng độ CO2 hòa tan, pH và nồng độ HCO3- Rất khó để xác định chính xác áplực CO2 không khí để kiểm soát nồng độ CO2 hòa tan

Đây là một phản ứng thuận nghịch diễn ra:

H O+C O ↔ H C O ↔ H+ ¿ +HC O3

−¿ ¿

Trang 33

Kết quả của việc gia tăng CO2 không khí là làm giảm pH Vì thế, hiệu quả củaviệc gia tăng áp lực CO2 được trung hòa bởi sự gia tăng nồng độ bicarbonate:

độ tế bào rất thấp cần thêm CO2 vào pha khí của bình khí kín đối với hầu hếtviệc nuôi Khi nồng độ tế bào cao, không cần thiết để thêm CO2 vào pha khítrong chai kín và cũng không cần đối với chai mở

- pH: Hầu hết các dòng tế bào đều tăng trưởng tốt ở pH 7.4 Mặc dù điều kiệnthuận lợi về pH đối với sự phát triển của tế bào sẽ thay đổi liên quan đến cáckiểu tế bào khác nhau Phenol red thường được sử dụng như là một chất chỉ thị

- Dung dịch đệm: Môi trường nuôi phải được đệm bởi hai lý do:

+ Đĩa, chai thường xuyên được mở ra, nơi tạo điều kiện cho CO2 xâm nhập vàlàm gia tăng pH

+ Sự sản sinh quá nhiều CO2 và acid lactic trong dòng tế bào bị biến đổi ở mật

độ tế bào cao, khi đó pH sẽ giảm xuống Một loại dung dịch đệm phải được sửdụng để kết hợp chặt chẽ trong moi trường để giữ pH không thay đổi nhưngtrong phản ứng (1), sản phẩm CO2 ngoại sinh có lẽ cần cho vài dòng tế bào, đặcbiệt ở nồng độ tế bào thấp, việc ngăn chặn tổng lượng CO2 hòa tan mất đi là cầnthiết nếu không sẽ khiến Bicarbonate trong môi trường bị thất thoát

Dung dịch đệm Bicarbonate được sử dụng thường xuyên hơn các dung dịch đệmkhác do chúng có khả năng đệm ở mức thấp hơn pH sinh lý, tạo ra ít độc tố, giáthành thấp và giá trị kinh tế cho việc nuôi cấy tế bào

Môi trường tủ nuôi

Cần hạn chế mở cửa tủ cấy nhất là trong trường hợp phòng vô trùng thí nghiệmkhông đạt chuẩn yêu cầu

Tránh chồng các đĩa, chai tủ cấy, dễ ngã đổ môi trường lên nắp trong miệng chaicấy, nếu không có thể làm tăng nguy cơ gây nhiễm và gây nhiễm cả môi trường bêntrong tủ cấy Tránh sự rung lắc, dao động tủ cấy làm ảnh hưởng đến kết quả thínghiệm

Nhiệt độ tủ cấy nên ổn định không đổi trong khoảng 36,5 ± 0,50C

Trang 34

1.2.7 Tỉ lệ môi trường với mật độ tế bào đem nuôi, lượng mô đem cấy [19]

Đối với cách tách tế bào bằng trypsin, người ta thường sử dụng: 5ml môi trường/chai cấy loại 25cm2 và mật độ tế bào từ 106 – 107 tế bào/ml

- Với môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung sẵn chất bổ trợ nhưAMNIOMAXTM – C100 20% FBS thì thường sử dụng 1ml ứng với 1 ngày sauthay, 5ml ứng với 5 ngày thay

- Với môi trường nghèo dinh dưỡng như: DMEM 20% AHS, EMEM 20% AHSthì thường sử dụng 5ml tương ứng với 2 ngày sau thay

Đối với cách tách bằng cơ học, nuôi cấy nguyên phát, người ta thường sử dụng cáchthay và liều lượng thay môi trường như sau:

+ 1ml môi trường/ chai cấy (1 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2

1.2.8 Môi trường nuôi cấy [8]

1.2.8.1 Môi trường

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môitrường nuôi cấy vi sinh vật và tế bào thực vật Trong các công trình đầu tiên về nuôicấy tế bào động vật người ta thường dùng hỗn hợp dung dịch muối sinh lý, huyết thanh

và chiết phẩm phôi gà làm môi trường nuôi cấy Do thành phần huyết thanh và chiếtphẩm phôi gà rất phức tạp, khó ổn định nên người ta dần quan tâm đến việc nghiên cứuchế tạo các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnhthành phần môi trường và ổn định môi trường trong những lần nuôi cấy khác nhau.Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập được thuần hóa với môi trường tổnghợp hoàn toàn, đa số các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp có bổsung 5 – 10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh) Thôngthường huyết thanh bê được sử dụng phổ biến hơn cả, nhưng có một số loại tế bào cầnphải sử dụng huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum: FBS)

1.2.8.2 Một vài loại môi trường thông thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào

Trang 35

Môi trường E’MEM (Eagle Minimun Essential Medium): còn gọi là môi trường tốithiểu, do H Eagle thiết lập Đây là môi trường BM có chứa nồng độ cao hơn các aminoacid và vitamin, cũng cần bổ sung 5 – 10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào.

Môi trường D’MEM (Dulbecco – Modifiled Eagle Medium) là môi trường E’MEM

do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp 2 lần và một số vitamincao gấp 4 lần so với môi trường khác để nuôi được nhiều loại tế bào hơn

Môi trường F10, F12: do R.G Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong môitrường này huyết thanh được thay bằng 20µg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3.10-7

+ Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

+ Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi cấy nhờ các yếu tố làmtăng độ dính của tế bào lên giá đỡ

+ Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tínhcủa oxy

Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làmtăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của môi trường nuôi cấy).Ngoài ra huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma và khó ổn định chất lượng

Trang 36

của những lô môi trường khác nhau cũng như còn chứa những thành phần gây ức chế

sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợpkhông chứ yếu tố ức chế đối với dòng tế bào nuôi cấy) Vì các lý do đó mà nhiều nhànghiên cứu đã xây dựng môi trường nuôi cấy tế bào động vật không dùng huyết thanhhay dùng với lượng thấp

Có 2 phương pháp điều chế môi trường không có huyết thanh là phương pháp của

G Sato và phương pháp của R.G Ham Cả 2 phương pháp này đều thay huyết thanhbằng những yếu tố khác như: kích thích tố, nhân tố tăng trưởng, protein vận chuyển,nhân tố kết dính và kéo dài, các chất dinh dưỡng, khoáng…

1.2.9 Ðánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy [11]

Ước lượng trạng thái sức khỏe nói chung hay sự “happy” của tế bào nuôi cấythường dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phủ và biểu hiệnchức năng đặc biệt

- Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) là dễ xác định nhất nhưng thường ítđược sử dụng nhất Tuy đặc điểm này được theo dõi thường xuyên khi nuôi cấynhưng rất khó đưa ra kết luận dựa vào những quan sát này Ngoài ra, đặc điểmnày không thể hiện một số lượng hay đo lường chính xác nào Phương pháp nàythỉnh thoảng sai khi quan sát tế bào bằng kính hiển vi và vi trường quan sát xấuhay có biểu hiện bất thường Khi nghi ngờ, có thể nhuộm những tế bào đó vớicrystal violet hoặc các chất nhuộm mô khác để xác định vấn đề bất thường

- Đếm tế bào để ước lượng số lượng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển – tỷ

lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy Dựa vào đó

để thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trường, chất nền, huyếtthanh…) tốt hơn cho tế bào

- Năng suất che phủ là phương pháp kiểm tra dựa trên số lượng nhỏ tế bào (từ 20– 200) bám trên bình nuôi cấy và số lượng các cụm tế bào đặc trưng được xácđịnh Phần trăm các cụm tế bào đặc trưng biểu hiện cho khả năng tồn tại, trongkhi kích thước cụm tế bào đặc trưng cho tỷ lệ phát triển Phương pháp nàytương tự phương pháp phân tích tỷ lệ phát triển, nhưng nhạy cảm hơn với sựkhác biệt nhỏ của điều kiện nuôi cấy

- Đặc điểm cuối cùng là sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thường khó quan sát và

đo lường nhất, được xác định bằng các xét nghiệm hóa sinh và miễn dịch

1.3 Đại cương về nguyên bào sợi

1.3.1 Nguồn gốc [2, 13, 14]

Trang 37

Nguyên bào sợi có nguồn gốc từ trung mô, tồn tại hai dạng là nguyên bào sợi(fibroblast) và tế bào sợi (fibrocyte).

Tế bào sợi: khi chúng ở trạng thái nghỉ thì nhân có màu đậm, ít bào tương, có kíchthước nhỏ hơn so với nguyên bào sợi

Nguyên bào sợi: chúng sẽ ở trạng thái hoạt động trong suốt quá trình làm lành vết

thương Nguyên bào sợi có thể tồn tại 6 – 7 tháng trong quá trình nghiên cứu in vitro.

Vòng đời tăng trưởng của các dòng nguyên bào sợi phụ thuộc vào các cơ quan khácnhau trên cơ thể

1.3.2 Đặc điểm của nguyên bào sợi [2, 13]

Hình dạng của tế bào có thể bị thay đổi do những yếu tố vật lý (bề mặt) nơi màchúng gắn bám Dưới kính hiển vi điện tử, nguyên bào sợi là những tế bào non, ít biệthóa Nguyên bào sợi thường có dạng hình thoi, ít nhánh và ngắn, kích thước không quá

20 – 25µm, nhân bầu dục hoặc hình cầu có một hoặc vài hạt nhân Nhân của nguyênbào sợi cô đặc được kéo dài ra Bào tương của base hạt, lưới nội bào, ti thể phát triển.Nguyên bào sợi có khả năng phân chia mạnh, tế bào có thể di động yếu nhờ siêu sợiactin và myosin ở ngoại vi bào tương Tế bào có những nhánh là chân giả dạng sợi

Hình 1.3.2 Cấu trúc nguyên bào sợi

1.3.3 Chức năng của nguyên bào sợi [6, 13, 15]

Hình dáng cấu trúc vật lý của tế bào đem lại những chức năng đặc biệt đối với việctổng hợp và tiết ra các đại phân tử, đảm nhận nhiều chức năng quan trọng trong cơ thểnhư:

Trang 38

- Tổng hợp các chất như phân tử collagen, proteoglycans, glycoprotein và sợielastin bằng quá trình ngoại tiết để tạo sợi liên kết, tổng hợpglycosaminoglycan, tổng hợp một phần glycoprotein.

- Tham gia vào quá trình tái tạo

- Tạo tế bào sợi trưởng thành, tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào xương

- Khả năng thực bào của nguyên bào sợi rất thấp

Tầm quan trọng của nguyên bào sợi chưa thể đánh giá hết được Chúng hiện diệnngay trong trạng thái phát triển bình thường, và ngay cả lúc hàn gắn và sửa chữa vếtthương Ngày ngày, chúng tham gia hoạt động sinh lý của các mô và các cơ quan trong

cơ thẻ Nguyên bào sợi đảm nhiệm nhiều chức năng Nó có thể khử biệt hóa để trở vềtrạng thái ở giai đoạn sớm trong tiến trình phát triển và sau đó lặp lại sự biệt hóa đó (táibiệt hóa) để tạo ra một số loại tế bào khác

1.3.4 Sơ lược về kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sợi trên thế giới [19]

Ngoài môi trường dinh dưỡng cơ bản, nhu cầu chính yếu của tế bào dạng nguyênbào sợi cũng như nguyên bào sợi là cần giá bám để mọc lan ra, những tế bào này cótính linh động yếu và tính độc lập khi mật độ tế bào còn thấp Để hiện diện được, nócũng như những tế bào biểu mô cần có sự cảm ứng trực tiếp giữa tế bào với tế bào mớisống sót và phát triển được tối ưu để tạo thành cụm tế bào

Ba nhóm protein chuyển biến màng chính yếu được thể hiện liên quan đến tính cảmứng giữa tế bào với tế bào, giữa tế bào với giá thể:

+ Phân tử cảm ứng gắn bám giữa tế bào với tế bào là: CAMs (độc lập với Ca2+) vàCadherins (phụ thuộc vào Ca2+) – nó thể hiện tương tác cơ bản giữa các tế bào đồngloại Tính tự cảm ứng như: những phân tử giống nhau thì mọc đối xứng tương tác lẫnnhau Điều này được phát hiện bởi: Edelman, 1986, 1988; bởi Roseman và Gallatin,1991

+ Mối tương tác giữa tế bào và giá thể trong môi trường nuôi cấy được thể hiện quađoạn dính gắn (integrins) của tế bào, thụ thể của tế bào gắn bám với những phân tửchất nền như là: fibronectin, laminin, collagen, những sợi này sẽ liên kết với các tế bàotạo ra đường nối rõ ràng đặc hiệu, thường chứa đựng trong những sợi này gồm có:RGD (arginine, glycine, aspartic acid) Điều này được phát hiện bởi: Yamada, 1991.Mỗi đoạn đính (integrins) gồm có: tiểu đơn vị α và tiểu đơn vị β Cả hai sợi này đều cótính đa dạng cao, được sinh ra nhiều đáng kể, tạo ra sự đa dạng giữa các đoạn dính gắn(integrins)

Trang 39

+ Nhóm thứ ba của phân tử gắn bám tế bào là: sự chuyển biến những proteoglycansmàng, cũng như dựa trên sự tương tác giữa các thành tố chất nền với nhau, như là:tương tác với những proteoglycans khác hoặc collagen nhưng không gắn kết đặc hiệuvới sợi RGD.

Có một số sự kiện chuyển biến proteoglycans màng có chức năng hoạt động như là:

cơ quan cảm thụ nhân tố tăng trưởng với ái lực yếu Điều này được phát hiện bởi:Klagsbrun và Baird, 1991

Sự kiện không kết tụ của mô có nghĩa là: thể hiện một sự gắn bám thành lớp đơntrong nuôi cấy Do trong quá trình tăng sinh có sự hiện diện của protease tiêu hủy một

số chất nền ngoại bào, thậm chí có lẽ làm suy thoái sự chuyển biến protein màng, màprotein màng đó sẽ cảm ứng với chất nền ngoại bào Khi đó, nó sẽ cho phép các tế bàotách biệt thành mỗi cái riêng rẽ

Những tế bào ngoại bì và nội bì thường đề kháng với sự không kết tụ hơn, có nghĩalà: chúng có khuynh hướng mọc chồng chéo lên nhau, tạo ra dạng tế bào phức hợphoặc chèn lấp lẫn nhau thành đám

Trong khi những tế bào trung bì thì phụ thuộc vào sự tương tác với chất nền hơn là

sự liên kết gian bào Vì lý do đó nên dễ dàng mọc tách riêng biệt ra thành lớp đơn.Chính vì lí do này mà tế bào phải tái tổng hợp protein chất nền trước khi chúng gắnbán, hoặc là phải được cung cấp một giá thể có chất nền được lót bọc sợi liên kết.Trong nuôi cấy sơ cấp, quan sát những tế bào lớp đơn, Hence đã lập ra sự liên hệgiữa tỉ lệ mật độ và sự chuyển đổi của tế bào, liên quan đến cách sử dụng chất nền đểbám

Trong nuôi cấy lớp đơn, nếu tế bào còn môi trường sử dụng và giá thể để bám thìchúng sẽ không khép kín sự tiếp xúc với những tế bào khác Khi môi trường và khônggian nuôi cấy đã hết, nếu để lâu hơn vài giờ thì những bước chọn lọc khuynh hướngphát triển khác nhau sẽ xảy ra:

+ Những tế bào mà nó nhạy cảm với giới hạn, mật độ phát triển thì sẽ ngừng phânchia

+ Những tế bào nào bị chuyển dạng thì sẽ không cảm nhận được giới hạn mật độphát triển Chúng sẽ có khuynh hướng phát triển vượt bậc, phát triển quá giới hạn.+ Khi giữ mật độ tế bào ở mức thấp, bằng cách tạo ra sự cấy chuyền thường xuyên

sẽ giúp ích cho việc giữ ổn định kiểu hình bình thường của tế bào trong môi trườngnuôi cấy, như là trường hợp nuôi nguyên bào sợi chuột nếu cấy chuyền thường xuyên

sẽ giúp không rơi vào trạng thái dễ dàng chuyển dạng Khi mà mật độ tế bào ở mức độ

Trang 40

quá cao thì tại thời điểm đó, ở nơi đó, sự chuyển dạng tự phát sẽ làm cho tế bào cókhuynh hướng phát triển quá giới hạn.

Một vài diễn biến chức năng chuyên biệt được hiểu rõ ràng trong nuôi cấy sơ cấp,đặc điểm này thể hiện khi nuôi cấy trở nên nhập dòng (các dòng tế bào khác nhau hòahợp cùng phát triển trên cùng môi trường nuôi cấy) Ở giai đoạn này, nuôi cấy sẽ thểhiện trạng thái khép kín dày đặc nhất và vẫn còn tình trạng đa dạng về thể loại tế bào.Sau lần đầu tiên cấy chuyền, nuôi cấy nguyên phát trở nên - được biết gần như làmột dòng tế bào và có lẽ sẽ được nhân lên sau vài lần cấy chuyền nữa Sau mỗi lần cấychuyền thành công, thành phần của quần thể sẽ có khả năng tăng sinh mạnh mẽ hơn,hầu như nhanh hơn và tăng dần đến một mức độ tối ưu nào đó và rồi không tăng sinhnữa; hoặc các tế bào tăng sinh chậm chạp lại, trong trường hợp này mật độ tế bào sẽ bịloãng ra và thưa đi Điều này là sự kiện nổi bật nhất sau lần đầu tiên cấy chuyền Ởnhững vùng khác nhau sẽ cho khả năng tăng sinh khác nhau Và xu hướng là: những tếbào bị tổn thương bởi trypsin sẽ có khuynh hướng chuyển dạng tế bào

Mặc dù vậy, một sự chọn lọc dòng về kiểu hình và kiểu gen tiếp tục được thực hiệntrong môi trường nuôi Bởi lẽ, sau lần cấy chuyền thứ ba, chỉ các loại tế bào điển hình

có khả năng chịu đựng cao thì mới tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ Trong trườnghợp có sự hiện diện của huyết thanh mà không có điều kiện chọn lọc chuyên biệt thìnhững dòng tế bào trung mô được dẫn xuất từ mô liên kết như nguyên bào sợi vànhững nhân tố thuộc mạch máu thường phát triển mạnh mẽ, tăng lên quá mức trongmôi trường nuôi cấy Từ những nghiên cứu này đã đưa ra một số dòng tế bào rất hữudụng:

+ W138: Nguyên bào sợi từ phổi phôi người

+ BHK21: Nguyên bào sợi chuột đồng con

Phần lớn các dòng tế bào có thể nhân lên không làm thay đổi hiện trạng của tế bào,

do có sự giới hạn số lượng thế hệ tế bào Bên cạnh đó, chúng có thể chết hoặc nhân lênthành dòng tế bào liên tục Khả năng một dòng nào đó phát triển thành dòng tế bào liêntục có thể phản ánh khả năng biến đổi di truyền của nó Qua đó cho phép ta chọn lọcdòng tế bào theo trình tự cấy chuyền nối tiếp nhau

Nguyên bào sợi người duy trì số lượng thể bội chỉnh áp đảo, đánh giá thông quatuổi đời nuôi cấy của chúng và không bao giờ cho ra dòng tế bào liên tục Trong khi

đó, nguyên bào sợi của chuột và những tế bào nuôi cấy từ những mô bướu của người

và những động vật khác thì thường cho ra thể bội không chỉnh; song song đó, cho radòng tế bào liên tục trong nuôi cấy với tần số hoàn toàn cao Sự biến đổi trong nuôi cấy

Định dạng
Số trang	80
Dung lượng	19,9 MB