tiểu luận công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng

• Tại vị trí mô nằm ở gốc thân trong nhiều giống kháng đã sinh ra các lớp suberin ức chế sự tăng trưởng sợi nấm.• Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD phân tích bộ gen từ 9 cây layơn lựa chọn là

bai bao fusarium.pdf

Sinh viên: Nông thị Quỳnh Anh

Lớp: CNSH K52

Mục lục

References

Results and Discussion

Materials and Methods

Introduction

Abstract

ít nhất với tác nhân gây bệnh.

• Tại vị trí mô nằm ở gốc thân trong nhiều giống kháng đã sinh ra các lớp suberin ức chế sự tăng trưởng sợi nấm.

• Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD phân tích bộ gen từ 9 cây layơn lựa chọn là kháng và

nhạy cảm với FOG, tiến hành xác minh mức

độ đa hình DNA.

• Nucleic acid tổng số khai thác được thực hiện với phương pháp sử dụng DNA chiết tách từ mô cây theo phương pháp

chloroform-phenol ở 3 giai đoạn sinh trưởng.

• thực hiện thí nghiệm bằng cách sử dụng 14 mồi với Taq polymerase và nồng độ mồi

khác nhau.

• 5 trong những đoạn mồi được thử nghiệm không cho đa hình, 5 mồi cho đa hình Thông qua đó xac định đươc một hoăc nhiều tính kháng

Các test cho kết quả lặp lai ở cả 3 giai đoan sinh trưởng

• Nhân dòng các đoạn DNA đa hình quan tâm sẽ cho thấy sự hiện diện khác nhau của các gen đặc trưng liên quan đến tính kháng FOG ở cây lay ơn

Introduction

Introduction

• Cây lay ơn là một hoa kinh tế quan trọng, canh tác trên toàn thế giới như là một cây trồng trong vườn hoặc cho sản xuất hoa cắt Các loại nấm soilborne, Fusarium oxysporum Schlecht: Fr F sp gladioli (Massey) Snyd Và Hans (FOG) (Massey, 1926; Nelson và cộng sự, 1981), gây

vàng và thối thân và củ, là chính Nó làm giảm chất lượng cành và hoa thương

phẩm Nấm này được tìm thấy trên toàn thế giới và được lan truyền qua vật liệu nhân giống, (et al Garcia-Jimenez, 1986.)

Introduction

• Để kiểm soát và sự lây lan của loại nấm này, các giống cây ít nhạy cảm với tác nhân gây bệnh,

và các hóa chất được đưa vào thí nghiệm

• Điều quan trọng là tìm được những giống cây phù hợp nhạy cảm hay kháng để xác định sự hiện diện của gen liên quan đến

sự biểu hiện tính kháng.

Introduction

• Một loạt các xét nghiệm kháng FOG, chủ yếu dựa vào xét nghiệm sinh học đã được báo cáo bởi (Palmer và Pryor, 1958; Jones và Jenkins, 1975; Dallavalle và Zechini D'Aulerio năm

1994; Löffler và cộng sự, 1997; Straathof et al, 1998) Tuy nhiên, các cơ chế kháng vẫn

chưa được hiểu rõ

• (Remotti và Loffler, 1996) đã quan sát cơ chế xâm nhập của sợi nấm FOG vào cây và mô

chỉ qua các chu bì thân , chủ yếu là ở gốc qua các đốt thân, và vết thương (Dallavalle và Pisi, 1993).

• Các mô của nhiều mẫu cây đem thí nghiệm thể hiện kháng qua việc phản ứng với

suberization tế bào, tạo thành rào cản ngăn chặn các tác nhân nấm.

Introduction

• Dùng chỉ thị RAPD phân tích bộ gen của 9 mẫu giống cây lay

ơn với mức độ kháng, mẫn cảm khác nhau với FOG đã được thực hiện để xác định khả năng áp dụng phương pháp

sàng lọc ADN phân biệt mức

độ nhạy cảm và kháng ở cây lay ơn.

Materials and Methods

• Sử dụng mô cây lay ơn ở đỉnh ngọn lấy mắt ngủ hay chồi 3 khoảng cm, lá từ cây cao 30 cm

• Cây mẹ được trồng trong một nhà kính chống côn trùng

trong đất tiệt trùng

Materials and Methods

• Tách chiết DNA

Acid nucleic tổng số được chiết xuất từ 1 g

mô tươi trong nitơ lỏng theo phương pháp chloroform-phenol được mô tả bởi Prince et

al (1993), ngâm trong 100 μLof1XTEbuffer Lof1XTEbuffer (10 mM Tris Cl [pH 8], 1 mM EDTA [pH 8]) và pha loãng tới 20 ng / μLof1XTEbuffer L Cuối cùng tập trung trong nước deionized ( nước khử ion) vô

trùng

1 μLof1XTEbuffer L DNA tổng số pha loãng này đã được

sử dụng trong các xét nghiệm khuyếch đại mô

tả dưới đây và được lưu trữ ở

1XTEbufferat-20 ° C

Materials and Methods

• Phân tích RAPD

• RAPD được tạo ra bằng cách sử dụng

12 mồi khác nhau dài 10-Mers được thiết kế từ operon của (Alameda, CA, USA): AD14, AD18, AF07, AF13,

AG12, AL07, AL16, AM14, AM19, M18, S05, và C08

• Ngoài ra, hai mồi dài 11-mer, AL16 +

và + AM14 cũng được sử dụng Tất cả các mồi ở nồng độ của 20 μLof1XTEbuffer M

Materials and Methods

Bảng 1 RAPD hỗn hợp sử dụng.

Thành phần Mix A Mix B Mix C Buffer (10X) (µL) 2.50 2.00 2.50 MgCl2 2mM(µL) 3.00 3.00 0.50 d-NTP 50 µM(µL) 0.50 0.50 2.00 Primer 0.2 nM (µL) 2.00 2.00 0.50 Taq 5U/µL(µL) 0.125 0.125 0.20

Materials and Methods

Thí nghiệm RAPD được lặp lại 2-4 lần của mỗi giống mẫu trong 25 μLof1XTEbuffer L

Thử nghiệm riêng rẽ với 2 nồng độ dNTP và taq polymerase (Bảng 1)

Bảng 1 RAPD hỗn hợp sử dụng.

Thành phần Mix A Mix B Mix C Buffer (10X) (µL) 2.50 2.00 2.50 MgCl2 2mM(µL) 3.00 3.00 0.50 d-NTP 50 µM(µL) 0.50 0.50 2.00 Primer 0.2 nM (µL) 2.00 2.00 0.50 Taq 5U/µL(µL) 0.125 0.125 0.20

Materials and Methods

• Một loạt các nhiệt độ gắn mồi (36-45 °C)

đã được thử nghiệm trước khi thiết lập các điều kiện phản ứng tối ưu Các điều kiện tiêu chuẩn được sử dụng trong 45 chu kỳ như sau:

Results and Discussion

• Sau các thí nghiệm trên, các xét nghiệm được thường xuyên thực hiện với tất cả các mồi bằng cách sử dụng nồng độ các thành phần khác nhau (Bảng 1C)

• phân tích bằng điện di trong gel agarose 2% với 1 bộ đệm X TBE (0.09 M Tris-borat, 0,002 M EDTA, 1 M EDTA [pH 8]),

• Sau đó nhuộm gel với ethidium bromide

và chụp ảnh

Results and Discussion

• Các thí nghiệm so sánh 2 Taq

polymerase (Bảng 1 A-B, Hình 1

a-b) cho thấy các băng DNA thu

được với những mảnh Stoffel

ngắn hơn (hình 1b, mồi AL16) và

nhiều hơn (hình 1b, mồi AL16 +)

hơn so với thu được với cùng

một mồi và Polymed Taq (Hình

1a)

• Đoạn Stoffel thường sản xuất

một lượng nhỏ đa hình đáng tin

cậy

• Bởi vì điều này, chỉ sử dụng Taq

polymerase với mix A Kết quả

thu được nhóm các vach băng

ko phân biệt rõ ràng (hình 2a)

Results and Discussion

• Thí nghiệm được thực hiện vớiMix C sản xuất các mẫu cũng

đã được xác định với đa hình phân biệt rõ ràng (Hình 2b).

• Sử dụng hỗn hợp C: 5 mồi (C08, S05, AD18, AM19, AM14 +) không

có các cấu hình đa hình cho giống mẫu và giai đoạn tăng trưởng khác nhau

• Bốn mồi (AL7, AF07, M18, AF13) sản xuất băng đa hình không

tương quan với mức độ nhạy cảm FOG của mẫu thử nghiệm.

Results and Discussion

• Năm mồi cho các cấu hình

tiêu biểu cho một hoặc

nhiều giống mẫu kháng

Đặc biệt, các mồi AG12 đã

không tạo ra một đoạn

0,5-kbp trong giống WP nhưng

đã tạo ra một dải chênh

lệch ở mức 2 kbp (hình 3)

Results and Discussion

• Các đa hình hiển thị khác không liên quan tới độ nhạy cảm của các giống thử

nghiệm Primer AD14 (hình 4a)

Results and Discussion

• Hình 1 hình ảnh rapd với 3 mồi thử ngiệm dài 10-mers thử nghiệm

bằng cách sử dụng Polymed Taqpolymerase với mix A (a) và mix B ở (b)

• Một mẫu không có (H2O),1 mẫu có (H2O) đại diện đối chứng âm

• 1-kbp DNA ladder

Results and Discussion

Hình 2 Đa

hình cấu hình

thu được từ 6

giống cây lai ơn

sau khi khuếch

đại với mồi

AL16, AL16 +,

và AM14 (a) Sử

dụng mix B (b)

Sử dụng mix C

Results and Discussion

RAPD với mồi AD14(4a) , DNA của cvs WP và NL Kết quả cho thấy một

nhóm 1.1 kb Nhóm này cũng thấy khi chạy rapd sử dụng DNA chiết tách từ 2 giai đoạn sinh trưởng của cv WP Trong khi giống NL hiển diện nhóm 0.9kbp

Sử dụng mồi AL16 (hình 4b), mẫu WP thiếu một đoạn 0,7-kbp hiện diện trong tất cả các giai đoạn của các mẫu khác Băng 0.5-kbp chỉ xuất hiện trong tất cả các giai đoạn của mẫu WP và trong thể không hoạt động của mẫu NL

Results and Discussion

• Hình 3 Đa hình liên

quan đến tính kháng

FOG thu được từ 5 cvs

cây lai ơn sau khi

khuếch đại với mồi

AG12 trong mix C

(Bảng 1) Một mẫu

không (H2O) là đối

chứng âm

Hình 4 hình ảnh RAPD với 2 mồi AD14 ở (a) và mồi AL16 ở (b) cho thấy kết quả cơ bản giống hệt nhau được thể hiện cho tất

cả ở cả 3 giai đoạn sinh trưởng trong điều kiện C (bảng 1).

Đa hình liên quan đến nhiều tính kháng của WP

và NL Đối chúng âm là H2O, và lader.

Results and Discussion

Đa hình đã được quan sát trong tất cả các giai

đoạn sinh trưởng của mẫu NL với 2 mồi (AL16 + và AM14) thấy rằng các nhóm khác biệt được hiện diện đoạn 0,7 và 1 kbp, tương ứng (Hình 2b )

Đối chứng không có mẫu có hoặc không có sự

khuếch đại các cấu hình khác biệt rõ ràng từ những mẫu cây lay ơn với tất cả các mồi sử dụng

Results and Discussion

Results and Discussion

• Đây là báo cáo đầu tiên RAPD sử dụng trên cây lay ơn để phát hiện đa hình liên quan đến tính kháng FOG.

• Các kết quả cho phép xác định các cấu hình

đa hình cụ thể với mẫu 2 kháng nhất trong số những mẫu được thử nghiệm với FOG

(Dallavalle và Zechini D'Aulerio, 1994)

• RAPD đánh dấu liên quan đến sự nhạy cảm khác nhau với FOG đã được phát hiện trong lily (al Straathof và cộng sự, 1996.)

Results and Discussion

• Đánh dấu RAPD cũng đã được báo cáo để giải thích 85% số này không

có khả năng kháng (Jansen, 1996)

• Để xác nhận mối quan hệ giữa những kết quả này và đề tạo ra tính kháng với FOG, nhân bản các trình

tự của đoạn RAPD thể hiện kháng tốt nhất là cần thiết để xác định trình

tự DNA tương đồng với gen có thể tham gia vào con đường trao đổi chất phenol hoặc suberin

• Dallavalle E and Pisi A (1993) Fusariosi del

gladiolo: penetrazione e colonizzazione del

patogeno osservate al SEM Micologia italiana

3: 91-99.

• Dallavalle E and Zechini D’Aulerio A

(1994) Resistenza varietale del gladiolo al

• Fusarium oxysporum f sp Gladioli Italus

Hortus 4: 19-26.

• Garcia-Jimenez J, Piera VJ, and Alfaro A (1986)

Mycological prospection of the gladiolus corm

imports in Spain Acta Horticulturae 177:

537-540.

• Jansen RC (1996) A general Monte Carlo

Method for mapping quantitative trait loci Ge-

netics 142: 305-311.

• Jones RK and Jenkins JM Jr (1975) Evaluation

of resistance in Gladiolus sp to Fusarium

oxysporum f sp Gladioli Phytopathol 65:

481-484.

• Löffler HJM, Straathof TP, Van Rijbroek, and

Roebroek EJA (1997) Fusarium resistance

• in Gladiolus: The development of a screening

Assay J Phytopathology 145: 465-468 Massey

LM (1926) Fusarium rot of Gladiolus corms

Phytopathol 52: 567-572.

• Nelson PE, Horst RK, and Woltz SS (1981)

Fusarium disease of ornamental plants In:

Nelson PE, Tousson TA and Cook RJ (eds),

Fusarium: disease, biology and taxonomy, pp

121-128 Pennsylvania State University Press.

• Palmer JG and Pryor RL (1958) Evaluation of

160 varieties of Gladiolus for resistance to

• Fusarium yellow Plant Dis Reptr 42:

1405-1407.

• Prince JP, Davis RE, Wolf TK, Lee I-M, Mogen

BD, Dally EL, Bertaccini A, Credi R, and Barba

M (1993) Molecular detection of diverse mycoplasmalike organisms (MLOs) associated with grapevine yellows and their

classification with aster yellows,

• X-disease, and elm yellows MLOs Phytopathol 83: 1130-1137.

• Remotti PC and Löffler HJM (1996) The involvement of Fusaric Acid in the Bulb-rot of

• netic analysis of inheritance of partial resistance

to Fusarium oxysporum in Asiatic

hy-• brid lily using RAPD markers Acta Horticulturae 414: 209-218.

• Straathof TP, Roebroek EJA, and Löffler HJM

(1998) Studies on Fusarium-Gladiolus In-

teractions: The Development of a screening Assay J Phytopathology 146: 83-88.

bai bao fusarium.pdf

Tha n k y o u !