tiểu luận công nghệ sinh học động vật

NỘI DUNG2.3.4 Chuyển gen qua con đường tế bào Để tránh khó khăn trong quá trình vi tiêm, phương pháp này có thể được dùng để chuyển gen vào các tế bào và sử dụng chúng để tạo phôi.. 2.3.



ĐỀ TÀI

Công nghệ sinh học động vật

Giáo viên hướng dẫn : Ths Quan Quốc Đăng

Sinh viên thực hiện :

LỜI CẢM ƠN

Với nhu cầu tìm tòi, học hỏi và trao đổi kinh nghiệm, nhóm chúng em đã cùng nhau thảo luận và hình thành nên một bài tiểu luận về đề tài thuộc Công nghệ sinh học động vật Nhóm sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ cũng như sự hướng dẫn tận tình của thầy Quan Quốc Đăng – Thạc sĩ và cũng là giáo viên phụ trách bộ môn Công nghệ sinh học động vật Đồng thời toàn thể nhóm cũng muốn gửi lời cảm

ơn về phía trường Đại học Công nghiệp TpHCM đã hỗ trợ cho chúng em trong quá trình hoàn thành bài tiểu luận bằng cách cung cấp những kiến thức cơ bản thông qua

sự trao đổi trực tiếp giúp chúng em định hướng được mình nên làm những gì

Tuy nhiên đây là lần đầu tiên chúng em được tiếp cận với môn học này cho nên việc mắc phải sai sót là không sao tránh khỏi Vì vậy chúng em mong nhận được những ý kiến đóng góp để dần hoàn thiện hơn những kiến thức của mình đã có

Xin chân thành cảm ơn!

Đại diện nhóm Ngọc Hương

NỘI DUNG

2.3.4 Chuyển gen qua con đường tế bào

2.3.4.1 Việc sử dụng tế bào tế bào toàn năng và thế hệ của chimaerae

2.3.4.2 Cách sử dụng tế bào đã được biệt hóa và những dòng động vật vô tính

2.3.5 Vectơ dùng bổ sung gen

2.3.5.1 Những đoạn vectơ ngắn nhất

2.3.5.2 Những vectơ mang trình tự gen được lặp đi lặp lại

2.3.5.3 Vector transposon

2.3.5.4 Vectơ Retroviral

2.3.5.5 Vectơ bổ sung

NỘI DUNG

2.3.4 Chuyển gen qua con đường tế bào

Để tránh khó khăn trong quá trình vi tiêm, phương pháp này có thể được dùng

để chuyển gen vào các tế bào và sử dụng chúng để tạo phôi Phương pháp này được sử dụng khi thay thế gen bằng gen tương đồng tái kết hợp Quá trình này rất hiếm và đòi hỏi sự lựa chọn chính xác các dòng tế bào xảy ra quá trình tái kết hợp tương đồng Điều này gián tiếp tạo ra các dòng tế bào vô tính Các tế bào này phải được giữ lại các đặc tính để tham gia vào sự phát triển của phôi Hiện nay có hai hướng nghiên cứu chính

2.3.4.1 Việc sử dụng các tế bào tế bào toàn năng(pluripoten) và thế hệ của chimaerae

Các tế bào tế bào toàn năng có thể tạo ra tất cả các bộ phận cơ thể của một sinh vật (Hình 2,1).Phương pháp thu nhận các tế bào tế bào toàn năng đang được sử dụng là đưa nó vào phôi sớm khi đang ở giai đoạn cầu morula hoặc phôi nang, sau đó sẽ phát triển tới chimaeric Cần nhớ lại rằng một Chimaera được hình thành bởi các tế bào hỗn hợp từ động vật khác nhau Mỗi tế bào Chimaera, bao gồm các giao tử, bắt nguồn từ người cho hoặc người nhận phôi Đây là những khác biệt cơ bản của cơ thể lai, do bộ gen từ hai sinh vật đang ở trong cùng một tế bào sau quá trình thụ tinh

Dòng tế bào tế bào toàn năng đã được thiết lập ở chuột Các dòng tế bào có nguồn gốc từ phôi sớm được gọi là tế bào ES (tế bào gốc phôi thai)

Các tế bào tế bào toàn năng thu được từ tuyến sinh dục của bào thai được gọi là các tế bào EG (tế bào phôi mầm) Các tế bào toàn năng là dòng tế bào đầu tiên được bắt nguồn từ một teratocarcinoma (một dạng u ác tính ở tinh hoàn) và do đó được gọi là

EC (tế bào phôi ung thư biểu mô) Các tế bào EC có thể tham gia vào sự phát triển của phôi chimaeric nhưng không tham gia sự hình thành giao tử

Chỉ có một số lượng nhỏ dòng tế bào ES có thể sử dụng Tất cả đều là tế bào gốc thu được từ một hay hai dòng chuột Pluripotency có thời gian tồn tại rất ngắn Các tế bào Tế bào toàn năng có công suất cao để nhân giống in vitro nhưng chúng tự phát sinh những điểm khác biệt và trở thành các tế bào multipotent (tế bào đa chức năng) Điểm khác biệt của các tế bào tế bào toàn năng lá ở chỗ có thể tham gia vào sự

phát triển của phôi ở một mức độ nào đó nhưng không thể trở thành giao tử Do đó các

tế bào ES phải được duy trì ở trạng thái tế bào toàn năng trong suốt toàn bộ quá trình nhằm tạo ra các động vật chimaeric có khả năng di truyền gen của chúng cho con cháu

Các pluripotency của các tế bào ES được duy trì bằng cách thêm vào những nhân tố của môi trường tự nhiên Đã có rất nhiều nỗ lực nhằm tạo ra dòng tế bào ES từ dòng chuột khác và từ các loài khác nhưng không thành công Tốt nhất, nên thu nhận

từ những động vật không phát sinh phôi Hiện chưa rõ tại sao dòng tế bào ES chỉ có thể được bắt nguồn từ hai dòng chuột Bất kỳ nguyên nhân nào, những dòng này xuất hiện hiếm khi xuất hiện những trường hợp ngoại lệ và thực tế là tế bào toàn năng tế bào không thể được duy trì trong quá trình này được coi là bình thường.Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy những quan điểm này cần phải xem xét lại Những

tế bào Tế bào toàn năng có khả năng truyền các gen của chúng cho con cháu đã được

mô tả trên gà và medaka Vẫn còn quá sớm để khẳng định các tế bào này tương đương với dòng tế bào ES ở chuột

DNA bên ngoài có thể được bổ sung vào các tế bào ES và quá trình nuôi dưỡng các gen này có thể được thiết lập bằng cách sử dụng một gen lựa chọn Các tế bào này có thể được được sử dụng để tạo ra chuột biến đổi gen chimaeric

Phương pháp này ít hơn nhiều khó khăn và kém hiệu quả hơn vi tiêm Đó là lý

do nó chỉ được sử dụng để thay thế bằng các gen tương đồng tái tổ hợp (hình 2,10)

Hình 2.10

2.3.4.2 Cách sử dụng tế bào đã được biệt hóa và những dòng động vật vô tính

Những DNA ngoại sẽ được thêm vào những tế bào khác bằng phương pháp chuyển vị Những tế bào chứa gen cần quan tâm có thể được nhân giống vô tính bởi một gen được chọn Những tế bào này sau đó có thể là nguồn nhân cho những dòng động vật vô tính sẽ được chuyển gen ( Hình 2.11)

Quá trình sinh sản của Dolly được theo dõi sớm bởi phương pháp chuyển gen vô tính trên cừu tên là Polly ( Schnieke và cộng sự, 1997 )

Hình 2.11

Ưu điểm của phương pháp nối gen là nó

dễ dàng được nhân rộng Có thể sử dụng số lượng cừu ít hơn từ 2 đến 5 lần

so với phương pháp vi

tiêm để tạo ra số lượng cừu chuyển gen tương ứng Gen hợp nhất có thể được khảo sát trong tế bào trước khi chuyển nhân vào Những tế bào có gen ngoại bị thay đổi hoặc

có nhiều bản sao sẽ bị loại bỏ Giới tính động vật hoặc kiểu hình của gen cho sẽ được chọn ra Những động vật không thích hợp sẽ không được sử dụng cho quá trình chuyển gen Mặc dù nhân dòng vô tính là kỹ thuật khó, nhưng nó đem đến tính linh hoạt trong các thí nghiệm Những tế bào cho nhân có thể được làm đông và được sử dụng trong chuyển gen vô tính ở động vật

Đoạn gen thay thế được thu nhận từ cừu (McCreath và cộng sự, 2000) trên chuột (Rideout và cộng sự, 2000) và trên heo (Lai và cộng sự, 2002; Butler, 2002) Phương pháp này rất phức tạp và khó kiểm soát Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng sự tái tổ hợp của hai gen đồng chức năng có thể được thu nhận từ tế bào cừu nhưng những động vật được sinh sản vô tính này thường bị chết (Denning và cộng sự, 2001) Sự thất bại của việc này có thể là do quá trình nuôi dưỡng và vì vậy cần có sự lựa chọn thích hợp hơn để quá trình tái tổ hợp tương đồng có thể xảy ra Điều kiện môi trường nuôi dưỡng làm thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào từ đó làm giảm khả năng sống của các dòng tế bào động vật mà vẫn chưa hiểu được nguyên nhân Một sự hiểu biết tốt hơn về hiện tượng này là cần thiết trước khi có thể chuyển gen vào các động vật lớn với tỷ lệ thành công cao

Điều này cũng đúng với chuột Mặc dù sự thay thế gen bởi chimaeric vẫn còn khó khăn nhưng nó vẫn còn đơn giản hơn phương pháp tạo dòng vô tính

2.3.5 Vectơ dùng bổ sung gen

2.3.5.1 Những đoạn vectơ ngắn nhất

Trong hầu hết các trường hợp, các nhà nghiên cứu sử dụng những mảnh vụn vectơ có chứa khoảng 1 hay 2 gen, hoặc chuẩn bị những gen chức năng được cấu tạo

từ các thành tố khác nhau Mảnh vụn của các vectơ mang trên mình những vùng được sao lại đúng thứ tự sau khi tách ra từ đoạn sớm Thật vậy, cả 1 vòng vectơ kết hợp chậm hơn là 1 đoạn ngắn, không những thế, cả 1 chuỗi plasmid thường gây cản trở hoặc thậm chí là tiêu hủy quá trình kết hợp chuyển gen Điều này đúng với cả 5 loại vectơ: plasmid, cosmid, thể thực khuẩn, BAC và YAC Tuy nhiên, một số nghiên cứu của sinh viên lại cho kết quả trái ngược với BAC, loại vectơ mà cả vòng có khả năng kết hợp tốt hơn 1 mảnh thuộc vòng Nói cách khác, vectơ tồn trữ 1 đoạn gen dài ít bị

phá vỡ bởi các tác động tĩnh của chuỗi tế bào prokaryote Điều này dễ dẫn tới việc xuất hiện các tác nhân cô lập trong những đoạn gen dài hoặc xảy ra các hiệu ứng khoảng cách

Những đoạn DNA không chứa các chuỗi vòng thực hiện liên kết tương đối chậm Và vì một số nguyên nhân chưa được làm rõ, một số DNA được thêm vào mang đến cho chúng ta 1 số lượng lớn những loài động vật chuyển gen hơn là những DNA cùng loại khác Một mặt, những DNA này có thể được sinh ra bởi sự xuất hiện của những chuỗi có khả năng nhận dạng các đoạn gen thường gặp trong đoạn thêm vào Mặt khác, vài đoạn được nối có thể chứa những chuỗi thiên về sao chép, và sự hiện diện của chúng trong phôi hỗ trợ đáng kể cho quá trình liên kết

2.3.5.2 Những vectơ mang trình tự gen được lặp đi lặp lại

Cơ chế của quá trình tích hợp được mô tả ở mục 2.3 dẫn đến phát hiện sự lien quan giữa những trình tự của đoạn chêm vào và trong bộ gen Sự kết hợp này thường nên được tối ưu hóa bằng sự có mặt của cả 2 bộ ba kết thúc, mà 1 nằm trong đoạn chêm được sao chép 1 cách gần như hoàn chỉnh từ bộ gen ban đầu, ngay cả khi chúng

bị làm cho kém đi hoặc thoái hóa hơn.Từ một số thí nghiệm, ta thấy điều này là đúng

Ở bò, 1 trình tự xuất hiện nhiều lần tại trung đoạn và được gắn vào trung đoạn để thúc đẩy cho quá trình liên kết Trong trường hợp cá biệt này, hoạt động chuyển gen vẫn ở dạng tĩnh Điều này dẫn đến việc trung đoạn – vùng không xảy ra quá trình sao chép – cũng xuất hiện sự chuyển gen Một số thử nghiệm đã được tiến hành trên chuột, nơi đoạn Alu được sử dụng làm vật chất sao chép Đoạn Alu, chứa khoảng 200 – 300 nucleotide, có số lượng khá dồi dào trong bộ gien của động vật có vú, đặc biệt trong những khu vực hiếm hoặc không xảy ra sự sao chép Một số đoạn Alu được sao mã bởi RNA polymerase III, làm tăng hoạt độ của những ARN có chức năng chưa rõ ràng hoặc vô hiệu Nhiều thí nghiệm với sự tham gia của một nhóm các nhà nghiên cứu cho thấy rằng tần suất liên kết được gia tăng khi ta gắn vào đó trình tự có chứa đoạn Alu Tuy nhiên, kết luận này lại không được một nhóm khác chấp nhận, vì họ cho rằng, hiệu quả trên có thể yếu đi phụ thuộc đoạn gắn vào

2.3.5.3 Vector transposon

Transposons là những đoạn gen dài dưói 2 kb, mà nhiều bản sao của nó sẽ xuất hiện trong bộ gen ở những vị trí tùy ý Những đoạn Transposon đựoc phiên mã thành

RNAs, sau đó nó sẽ được phiên mã ngược để tạo thành mạch đôi DNAs rồi hòa nhập vào bộ gen với hiệu quả cao Sự hòa nhập đó được điều khiển bởi một transpoase ( nó

là 1 enzyme được đính vào cuối transposon và xúc tác sự di chuyển của transposon tới các phần khác của bộ gen bằng 1 quy trình cắt và dán hay là sự sao chép chuyển đổi) được mã hóa bởi transposon và còn được bằng ITRs( hình 2.12) Quy trình này cho phép transposon trải ra nhanh chóng và tỏa khắp bộ gen, nhưng đôi khi lại gây hiện tượng bất hoạt gen trong một số trưòng hợp Sự lan tỏa của gen còn bị giới hạn bởi các quá trình của tế bào mà làm ức chế sự phiên mã của transposon

Hình 2.12 Transposon là vector có khả năng chuyển 1 gen lạ vào trong bộ gen Để làm việc đó thì một phần lớn của vùng phiên mã của transposon được xóa đi Việc này tạo

ra 1 khoảng trống cho 1 gen lạ thay vào và đồng thời cũng ngăn cản được quá trình tự điều khiển trong việc gắn vào bộ gen của transposon

DNA tái tổ hợp chứa một gen lạ với dung lượng không xác định và có thể tự gắn vào bộ gen vật chủ Sự hiện diện của transposase là cần thiết cho việc này.Sự đồng tiêm của transposon chứa một gen lạ và 1 phần của vòng plasmid có thể biểu hiện gen transposase cho phép transposon hòa nhập với hiệu suất cao, 1 – 5 % của phôi

Quá trình này,ban đầu được xác định cho ruồi dấm bằng cách sử dụng transposon P,và được sử dụng rộng rãi để tạo ra gen chuyển Còn đối với các loài khác

thì người ta vẫn chưa có nhiều hiểu biết rõ ràng Các mariner transposon đã chứng minh được hiệu quả trong tế bào cá medaka, tế bào gà , và những tế bào của động vật

có vú Những cách thiết kế khác nhau của transposon có thể thu được những vector an toàn và hiệu quả để sử dụng trong liệu pháp gen (Hackett et al., 2001)

Còn có các vector khác để tạo ra gen chuyển trong côn trùng như là Aedes, Aegypti hay con tằm (Tamura et al., 1999)

Trong tất cả các trưòng hợp thì transposon và plasmid mã hóa cho transposase phải được tiêm vào phôi dưới các điều kiện lệ thuộc vào từng loại sinh vật Trong mối liên hệ này thì phôi gà được xem là khác biệt nhất so với các dạng sinh vật khác Thật

sự thì việc tiêm có thể thực hiện trong 1 phôi chỉ mới ở giai đoạn 1 tế bào mà không thể thực hiện được khi phôi đang phát triển như là ở các dộng vật có vú

Phôi đã được tiêm phải ở giai đoạn còn là lòng đỏ trứng và phải chưa có dự làm tổ Sau vài tuần ủ trứng dưới các điều kiện thích hợp thì gà chuyển gen sẽ được ra đời với tỷ lệ thành công chấp nhận được

Do đó các vector transposon có thể cho phép tạo ra các gen chuyển đổi trong các sinh vật mà thường thì kĩ thuật vi tiêm không đạt được kết quả Phương pháp này tương đối an toàn, bởi vì ngay cả khi thiếu gen transposase thì vector transposon vẫn

có khả năng sao mã và hòa nhập vào bộ gen của tế bào chủ dù là với hiệu suất thấp , việc này có liên quan đến sự hiện diện của transposase nội sinh trong tế bào chủ và nó

có thể hạn chế công dụng của transposon trong một số trường hợp Trong khi đó transposon B A C ở lợn được dùng để tạo ra con tằm chuyển gen nhằm duy trì chất lượng ổn định qua nhiều thế hệ

Transposon chỉ có thể mang 1 mảnh DNA lạ với một độ dài nhất định Điều này rõ ràng là một giới hạn nếu cấu trúc tinh vi được dùng để thể hiện cho 1 gen lạ Hơn nữa cơ chế của tế bào để làm lu mờ transposons có thể làm ức chế sự biểu hiện của gen chuyển trong một số trường hợp

2.3.5.4 Vector Retroviral

Là những vector được sử dụng cho liệu pháp gen Những vectơ virus retro khác nhau được thiết kế nhằm tạo ra động vật biến đổi gen và đặc biệt là gà (Ronfort, Legras và Verdier, 1997) Những vectơ này có lớp màng có khả năng nhận biết các tế bào phôi thai gà Những vectơ có thể được đưa vào trứng mới đẻ Ở giai đoạn này, các

tế bào vẫn còn tế bào toàn năng và có thể tham gia trong một thế hệ giao tử, nhờ đó bộ gen của chúng có thể được chuyển cho các thế hệ con cháu Cách tiếp cận này tỏ ra hiệu quả cao Thật vậy, phôi ở giai đoạn này chứa khoảng 60.000 tế bào Chỉ có một tỷ

lệ nhỏ của các tế bào này có một cơ hội bị nhiễm bệnh do vectơ retroviral Những con

gà thu được từ thử nghiệm này có một tỉ lệ gen chuyển tương đối cao Một sự thay thế được chứng minh là hiệu quả hơn Những vector được thực hiện ở giai đoạn 16 của sự phát triển phôi trong vùng lân cận của các tế bào mầm nguyên thủy Các tế bào này được ưu tiên để tiêm vào, cho các loài động vật có cơ hội được chấp nhận của sự truyền gene của họ cho con cháu (Hình 2,13)

Hình 2.13 Vectơ retroviral cũng được sử dụng để chuyển gen vào bò và noãn bào khỉ (Long et al, 1998, 2001.) Để làm điều này, hai trạng thái đặc biệt đã được yêu cầu.Lớp màng của véctơ là protein G của VSV (vesicular somatitis virus), được biết để nhận ra màng tế bào phospholipids và do đó cho phép sự nhiễm trùng ở nhiều loại tế bào Các hạt siêu vi khuẩn đã được tiêm giữa vùng pellucida và màng noãn bào tại thời điểm các màng tế bào hạt nhân bị thiếu, bộ gen của virus là tốt nhất để có thể tìm gen vật chủ (Hình 2.13)

Vectơ retroviral cũng đã được sử dụng để chuyển gen sinh sản ở thú Gene của virus chứa gene lạ được nhập vào tế bào theo con đường vận chuyển bổ sung, tổng hợp