Biến dị dòng vô tính (biến dị soma) trong nuôi cấy invitro.A. ĐẶT VẤN ĐỀ. Trong quá trình nuôi cấy invitro, sự xuất hiện các biến dị soma là một hiệntượng thường gặp, đôi khi là sự tác động nhân tạo (cố tình) để tạo nên cáctính trạng mong muốn. Vậy, biến dị soma là gì? Cơ chế tác động ra sao? Khả năng ứng dụng của biếndị soma là gì?... Chúng ta cùng tìm hiểu ?B. NỘI DUNGI. Khái niệm về biến dị soma.1. Biến dị là gì? Biến dị là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do tác động của cácyếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền. Biến dị tạo nên sự đa dạng vô cùng lớn ở các cá thể sinh vật, là nguyên nhân cơbản của tiến hoá và là nguồn nguyên liệu quan trọng cho chọn giống.2. Biến dị dòng vô tính (biến dị soma). Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả cácbiến dị thể hiện ở các tế bào thực vật, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôicấy mô thực vật (Larkin vs Scowcropt , 1981). Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính. Biến dị dòng soma là kiểu mẫu của tính toàn thể , có thể khảo sát toàn bộ tiếntrình biệt hoá của tế bào cũng như cơ chế thể hiện tính toàn năng của tế bào thựcvật Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá , khoai tây ,cà chua, mía ,các cây họ cải …. Bao gồm đầy đủ các tính trọng nông học nhưchiều cao cây , số nhánh , thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hoá sinhkhác.3. Phân biệt biến dị và đột biến. Biến dị: được dùng để mô tả những thay đổi cụ thể và thường không tuân theo quyluật Mendel trong quá trình di truyền của chúng. Đột biến: chỉ dùng cho các trường hợp khi mà có các bằng chứng rõ ràng thể hiện cácbiến đổi di truyền.4. Phân loại các biến dị dòng soma.a. Các biến dị kiểu gen (genetic variation).
Trang 1Biến dị dòng vô tính (biến dị soma) trong nuôi cấy invitro.
A ĐẶT VẤN ĐỀ.
- Trong quá trình nuôi cấy invitro, sự xuất hiện các biến dị soma là một hiện tượng thường gặp, đôi khi là sự tác động nhân tạo (cố tình) để tạo nên các tính trạng mong muốn
- Vậy, biến dị soma là gì? Cơ chế tác động ra sao? Khả năng ứng dụng của biến
dị soma là gì?
- Chúng ta cùng tìm hiểu ?
B NỘI DUNG
I Khái niệm về biến dị soma.
1 Biến dị là gì?
- Biến dị là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do tác động của các yếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền
- Biến dị tạo nên sự đa dạng vô cùng lớn ở các cá thể sinh vật, là nguyên nhân cơ bản của tiến hoá và là nguồn nguyên liệu quan trọng cho chọn giống
2 Biến dị dòng vô tính (biến dị soma).
- Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các
biến dị thể hiện ở các tế bào thực vật, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi
cấy mô thực vật (Larkin vs Scowcropt , 1981)
- Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính
- Biến dị dòng soma là kiểu mẫu của tính toàn thể , có thể khảo sát toàn bộ tiến
trình biệt hoá của tế bào cũng như cơ chế thể hiện tính toàn năng của tế bào thực vật
- Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá , khoai tây ,
cà chua, mía ,các cây họ cải … Bao gồm đầy đủ các tính trọng nông học như
chiều cao cây , số nhánh , thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hoá sinh khác
3 Phân biệt biến dị và đột biến.
- Biến dị: được dùng để mô tả những thay đổi cụ thể và thường không tuân theo quy
luật Mendel trong quá trình di truyền của chúng
- Đột biến: chỉ dùng cho các trường hợp khi mà có các bằng chứng rõ ràng thể hiện các
biến đổi di truyền
4 Phân loại các biến dị dòng soma.
a Các biến dị kiểu gen (genetic variation).
Trang 2- Là các biến dị có khả năng di truyền, xảy ra với tỉ lệ rất thấp (10-5 – 10-10) và không có tính thuận nghịch
- Các loại biến dị kiểu gen
Các đột biến hệ gen Các đột biến nhiễm sắc
thể
Các đột biến gen hay đột biến điểm
Là các biến đổi về số
lượng nhiễm sắc thể
Nguyên nhân: sự sai
khác về số lượng nhiễm
sắc thể như đa bội,
dị bội hay thể khảm
Các loài có độ bội cao
và nhiều về số lượng
nhiễm sắc thể thường
dễ bị biến đổi hơn
những loài có mức bội
thể thấp và ít nhiễm sắc
thể
Là các biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể
Nguyên nhân: các hiện tượng như mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (tạo ra các nhiễm sắc thể lớn hơn), chuyển đoạn và những biến đổi trong quá trình giảm phân
Là các biến đổi ở mức phân tử
Nguyên nhân: sự thay đổi của 1 cặp bazo, thay đổi về số lượng bản sao của 1 trình tự đặc thù, sự thay đổi trong biểu hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của các gen nhảy (transposable elements)
b Các biến dị kiểu hình (epigenetic variation).
- Là loại biến dị mà sự thay đổi kiểu hình không liên quan đến sự thay đổi về trình tự của DNA mà liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện của 1 gen nhất định, điển hình là quá trình khuếch đại và methyl hóa gen
- Các thay đổi về kiểu hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền, có thể phục hồi trạng thái ban đầu và có tỉ lệ cao (10-3) Tuy nhiên chúng có thể duy trì trong suốt chu kì sống của cấy tái sinh
II Các nguyên nhân dẫn đến xuất hiện và làm gia tăng biến dị soma.
2 nguyên nhân chính gây lên biến dị soma là: tính không đồng nhất di truyền của các tế bào soma mẫu cấy ban đầu và sự tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy invitro
Trang 31 Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế nào nuôi cấy.
- Các mẫu cấy có nguồn gốc từ 1 dòng đơn tính, từ hạt hay là cây con thì được coi như là đồng nhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có kiểu hình giống nhau Trên thực tế, các mẫu cấy này lại có nhiều loại tế bào khác nhau như phloem, xylem, nhu mô, mô vỏ… chúng có mức đa bội thể khác nhau Nói cách khác có
sự đa dạng giữa các tế bào trong cùng mẫu cấy Sự đa dạng này được gọi là đa bội vô tính (polysomatic) (lúa mì, thuốc lá…)
- Ngoài ra, nhiều loại tế bào chúng tồn tại ở dạng thể khảm, chứa những lớp tế bào hoặc mô có cấu trúc di truyền khác nhau được phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến, đặc biệt phổ biến ở cây thân gỗ
2 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy.
- Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng: các mô nuôi cấy dài
ngày trong môi trường chứa các auxin mạnh như 2,4 D hoặc 2,4,5 T thường gây
ra các sai khác trong cây tái sinh Ví dụ: cây dầu dừa tái sinh từ callus nuôi cấy dài ngày trên môi trường có chứa 2,4 D có tỉ lệ rất lớn các biến dị khi trồng trên đồng ruộng
- Phương thức nhân giống ivitro: các phương thức nhân giống khác nhau sẽ cho
tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau Nhìn chung, nếu chồi bất định được tái sinh từ 1 tế bào thì cơ hội để xuất hiện biến dị soma thường là lớn hơn rất nhiều từ các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào Các quá trình nuôi cấy callus, huyền phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều biến dị soma
- Loại mẫu cấy: các loại mẫu cấy khác nhau sẽ có những thể hiện mức độ biến dị
khác nhau: Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức biến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy
có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng như lá, rễ hay protoplast Khả năng xảy ra còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổi cây mẹ Các dòng già hơn thì thường ẩn các biến dị sẵn có ở mức đọ cao hơn các dòng trẻ hơn Các loài có độ bội càng cao và số lượng NST càng nhiều thì có tính biến dị càng cao
- Thời gian nuôi và số lần cấy chuyển: việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện
invitro cũng như tăng số lần cấy chuyển cũng sẽ làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị soma Nguyên nhân: do sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của DNA genome
III Cơ chế tạo biến dị soma.
Trang 41 Sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của DNA genome.
- Quá trình methyl hóa là quá trình mà 1 nucleotide cụ thể, thường là adenine hay cytosine-có 1 nhóm methyl gắn liền với nó Khi quá trình methyl hóa xảy ra như vậy trong 1 vùng mã hóa DNA cho 1 gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và
gen bị bất hoạt Việc bất hoạt gen do quá trình này có thể không được nhận biết
về mặt hiện tượng, mặc dù quá trình này đã được tìm thấy trong nuôi cấy mô ở
1 số loài như ngô, khoai tây và nho
2 Sự sắp xếp lại của NST.
- Sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là các nguồn chính của biến dị di truyền
thể hiện ở các dòng soma
- Ví dụ: khi nghiên cứu về cơ chế dẫn đến sự thay đổi trong NST, 1 số ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị nhiễm sắc là nguyên nhân chính dẫn đến các
biến dị dòng vô tính ở ngô và đậu lớn
3 Sự hoạt hóa các nhân tố chuyển vị.
- Sự tách ra hay xen vào của các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc
các gen cấu trúc ở gần nó Hơn thế, sự tách ra không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo ra sự tái sắp xếp của các trình tự nucleotide phụ Chúng là
nguyên nhân của các biến đổi trong biểu hiện gen cấu trúc NST
4 Đột biến điểm.
- Có thể là đột biến lặn hay trội Các đột biến điểm đã được tìm thấy ở cây cà
chua, lúa mì, thuốc lá
IV Ưu nhược điểm của biến dị soma.
1 Ưu điểm.
- Trong khuôn khổ tạo ra giống cây trồng, biến dị dòng soma có thể được sử dụng
để khám phá ra các thể biến dị mới duy trì tất cả các đặc tính tốt và có bổ sung tính trạng hữu ích, như kháng các bệnh hoặc chất diệt cỏ ( vd như cây thuốc lá chống chịu với độc tố methionin sulfoximi, chống chịu Pseudomonas syrigae, màu lá, đốm lá…, ngô chống chịu Helmithosporum, màu quả, chống chịu CMV, lúa
mỳ chống chịu hạn, chống chịu mặn…)
- Các kỹ thuật ứng dụng cho việc cảm ứng biến dị dòng soma dễ dàng hơn công nghệ DNA tái tổ hợp Đặc biệt cải thiện cây trồng mang các tính trạng đa gen (polygenic traits) bằng các phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống hay không truyền thống đã được chứng minh là rất khó khăn Biến dị dòng soma có thể là một kỹ thuật thích hợp cho công nghệ di truyền các cây này
- Các thay đổi có thể xảy ra ở các tính trạng nông học có ích
- Các thay đổi có thể xảy ra với tần suất cao
Trang 5- Có thể chọn lọc từ lượng rất lớn các vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng trong một vài đĩa petri hay bình nuôi cấy
2 Nhược điểm.
- Không phải tất cả các đặc tính của cây trồng đều biến đổi
- Nhiều đặc điểm biến đổi không theo ý muốn
- Không phải tất cả các biến dị đều ổn định bền vững
- Vẫn yêu cầu đánh giá trên đồng ruộng (để xác định chắc chắn sự ổn định di truyền của chúng)
V Khả năng ứng dụng của biến dị soma trong công tác giống cây trồng.
- Trong cải tiến giống cây trồng truyền thống, nhà chọn tạo giống phải trồng một số lượng lớn các cây trong nhà kính hay trên đồng nếu như muốn chọn lọc một đặc tính
cụ thể nào đó Nếu làm như vậy,số nguyên liệu sử dụng sẽ bị giới hạn bởi diện tích có sẵn và thời gian Ngoài ra các yếu tố di truyền cũng cản trở đến quá trình chọn lọc
- Các hệ thống nuôi cấy tế bào cùng với quá trình chọn lọc biến dị soma giúp cho các nhà chọn tạo giống có môi trường được xác định rõ ràng, nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng ngàn các tế bào đơn và có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Như vậy có thể chọn lọc từ lượng rất nhỏ các vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền
và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng trong một vài đĩa petri hay bình nuôi cấy
- Từ hiểu biết về biến dị soma kết hợp với các biện pháp gây đột biến nhân tạo các nhà chọn giống có thể:
1 Có thể nghiên cứu 1 loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môi trường đặc thù là có thể tạo ra bất cứ ở đâu
2 Tạo ra các dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất cao
3 Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý
4 Phân lập tính trạng bổ sung cho kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một số tính trạng mong muốn
5 Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp
Thực vật bậc cao là một nguồn cung cấp các hợp chất hóa học và dược liệu rất quan trọng Tuy nhiên trong những năm gần đây sản lượng các thực vật đó rất khó đảm bảo ở mức ổn định do hậu quả của một số yếu tố như:
+ Điều kiện tự nhiên không thuận lợi
+ Chi phí lao động ngày càng tăng
+ Khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong trồng trọt
Nuôi cấy mô tế bào thực vật và chọn lọc các dòng tế bào biến dị soma cho năng suất các hợp chất tự nhiên cao là một trong những hướng khắc phục khó khăn trên
+ Ví dụ ứng dụng cụ thể: Thí dụ điển hình trong công nghệ sản xuất shikonin, một loại sắc
tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây của Lithospermum erythrorhizon.Bình thường
shikonin tích lũy không nhiều trong rễ cây Tuy nhiên các nhà khoa học Nhật Bản tạo được
Trang 6dòng tế bào rễ cây Lithospermun có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin
6 Tạo những biến dị cho khả năng kháng bệnh, chống chịu stress tốt hơn
+ Ví dụ ở cây mía đường (Saccharum officinarum)
Cây biến dị phân lập từ nuôi cấy mô và tế bào được xác nhận đầu tiên ở mía Công việc bắt đầu ở đảo Fiji (Nhật), phân lập các dòng phụ (subclones) ở giống mía Pindar để
kháng bệnh Fiji (do virus aphid-transmitted) và bệnh mốc sương (downey mildew) (do Scelerospora sacchari) Tính kháng được duy trì ở các dòng soma qua một vài thế hệ
trồng trên đồng ruộng Ở Australia, Larkin và Scowcroft (1981), đã khai thác khả năng tạo các biến dị của nuôi cấy mô để cải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q101
kháng bệnh đốm mắt (do Helminthosporium sacchari) Tương tự, Liu (1981) đã xác định
các dòng callus mía cho cây ưu thế hơn giống (thứ) địa phương tốt nhất (F-160, Taiwan)
về năng suất, hàm lượng đường và khả năng kháng bệnh than (do Ustilago scitaminea)
+ Chống chịu các stress của môi trường
Stress của môi trường do nồng độ muối cao ở trong đất là nhân tố chính kìm hãm phát
triển nông nghiệp Từ kết quả đầu tiên là tái sinh cây thuốc lá invitro chống chịu NaCl
(Nabors 1980), đến nay người ta đã phát triển một số lượng lớn các dòng tế bào và cây trồng có thể chống chịu nồng độ muối cao (Nguyễn Hoàng Lộc 1992) Dix (1977) đã phát triển các
dòng chống chịu lạnh bằng cách nuôi cấy tế bào của Nicotiana sylvestris ở điều kiện nhiệt
độ thấp Tuy nhiên, phenotype của các cây tái sinh từ những dòng này không được chuyển sang thế hệ sau bằng phương thức hữu tính Lê Trần Bình (1992) cũng đã thu được các dòng lúa chịu nhiệt độ thấp thông qua nuôi cấy mô callus Các kết quả tương tự theo hướng biến dị dòng soma mang tính trạng chống chịu stress nước được cảm ứng bằng PEG hoặc mannitol (mannitol or PEG-induced water stress) trong nuôi cấy mô callus thuốc lá, mía và lúa cũng đã được thông báo (Nguyễn Hoàng Lộc 1992, 2003; Razdan 1994; Trương Thị Bích Phượng 2004)
7 Một số biến dị cho các kiểu hình mới mà không thể tạo được bằng công nghệ truyền thống
+ Cây phong lữ (geranium)
Skirvin và Janick (1976) đã phát triển một loài geranium (Pelargonium) từ các biến
dị soma có mùi hương được cải thiện và đặt tên là “Velvet Rose” Điều này cho thấy giống cây trồng thương mại (commercial crop plants) đầu tiên bắt nguồn từ các biến dị dòng soma Giống mới này có hoa đối xứng mang các nhị hữu thụ lớn, núm nhụy chẻ 5, trồng bằng hạt Trong khi ở giống bố mẹ thì ngược lại, hoa bất đối xứng mang các bao phấn bé và bất thụ, núm nhụy chẻ 2, và không bao giờ trồng bằng hạt
Trang 7- Để có thể ứng dụng thành công các phương pháp gây biến dị soma vào trong công tác chọn giống mới trước khi áp dụng cần chú ý:
+ Đối tượng cây phải nuôi cấy mô được dễ dàng và cho tỉ lệ thành cây cao
+ Gen cần bổ khuyết đã có sẵn trong tập đoàn gen hay chưa Nếu có rồi thì đó phải là gen
mà biện pháp lai truyền thống không thực hiện được, còn nếu chưa có thì liệu có thể gây đột biến nhân tạo được không
+ Phải có hoặc đã xác định được phương pháp chọn lọc đánh giá chính xác các tính trạng đột biến cần bổ khuyết
+ Các cây tái sinh đột biến phải di truyền ổn định cho các đời sau, có như vậy mới có ý nghĩa trong chọn giống
Chính vì vậy, biến dị dòng soma thường được dùng trong trường hợp khi muốn cải lương một tính trạng đặc biệt nào đó mà giống tốt bị thiếu, người ta nuôi cấy mô và sau đó chọn lọc các dạng đột biến mong muốn cần sửa chữa
VI Chọn lọc dòng biến dị soma: hướng chọn lọc, kĩ thuật chọn lọc.
1 Nguyên tắc chọn lọc dòng tế bào soma.
- Chọn trực tiếp:
+ Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc có thể chọn lọc được từ quần thể tế bào
+ Hệ thống tế bào được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù, hoặc các tế bào callus + Điều kiện chọn lọc: các độc tố với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào Thông thường người ta trộn tế bào và môi trường thạch chứa dược tố và chọn những tế bào sống sót, phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo hoặc cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa độc tố
- Chọn gián tiếp:
+ Đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào Thí dụ điển hình là tổng hợp enzym nitrate reductase (NR) Trên môi trường chứa Clo3- những tế bào có NR sử dụng clo3- như NO3- và khử thành clo2-, clo2- tác dụng như một độc tố cho nên chỉ có những tế bào không có NR mới sống sót trên môi trường chọn lọc
+ Chọn tổng thể Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn bằng phương thức
xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến VD: đột biến lặn chịu được S-2-aminoethyi cysteine xuất hiện sau khi xử lý phôi nuôi cấy
2 Cách chọn dòng tế bào:
Trang 8- Không có tác nhân chọn lọc: Các tế bào và callus không xử lý sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro ở các thời kỳ khác nhau trên môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức chế),được cảm ứng để phân hóa các cây hoàn chỉnh Các cây tái sinh sẽ được trồng trên đồng ruộng để chọn lọc các biến dị Bằng phương thức này người ta đã thu được các biến dị dòng soma của các cây trồng khác nhau
- Ví dụ:
+ Với Cây mía đường (Saccharum officinarum) người ta đã chọn được các cây kháng bệnh mốc sương (downey mildew), bệnh Fiji (do virus apid – transmitted) trên giống mía Pindar, hoặc cải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q10 kháng bệnh dốm mắt (Do Helminthosporium sacchari)
+ Với cây khoai tây Shepard và cộng sự (1980) đã tái sinh một số lớn cây từ
protoplast tế bào thịt lá của giống “Russet burbank” và thông báo các biến dị thu được trong quần thể protoclones Một trong số chúng kháng được bệnh thối sớm (early bright do Alternaria solani) hoặc thối muộn (late bright do phytophthora infestans)
+ Với cây cà chua Evan và cộng sự đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dị hình thái là các đột biến lặn của tính bất dục kháng nấm Fusarium
oxysporium ở mắt cuống lá, khả năng lục hóa của lá, màu sặc của quả và hoa
- Có nhân tố chọn lọc:
+ Theo phương pháp này các dòng tế bào biến dị được sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vào khả năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố/chất ức chế trong môi trường dinh dưỡng, hoặc dưới các điều kiện stress của môi trường Các biến dị có thể thu được bằng cách chọn lọc trực tiếp, gián tiếp Sự phân lập được tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền phù hoặc bằng cách dàn trải tế bào đơn/protoplast
3 Các hướng chọn lọc.
- Kháng amino acid và các đồng đẳng của amino acid
- Kháng bệnh
- Kháng thuốc diệt cỏ
- Chống chịu với các stress của môi trường
- Kháng kháng sinh
- Kháng các đồng đẳng base của DNA
4 Tập trung chọn lọc:
- Biến dị dòng soma chống chịu các stress sinh học (nấm, khuẩn, virus…)
- Biến dị dòng soma chống chịu các stress phi sinh học (muối, kim loại nặng, hạn, lạnh )
VII Ví dụ về công trình nghiên cứu cụ thể.
Chọn lọc dòng tế bào soma ở chuối
Trang 9(Musa Acuminata cv Grande Naine)
1 Giới thiệu về cây chuối
- Cây chuối thuộc họ chuối Musaceae
- Cây chuối trồng là những dòng có nguồn gốc tự nhiên từ những trung tâm khởi nguyên của
họ Musaceae là ở vùng Châu Á – Thái Bình Dương Những loài có thể ăn được bao gồm trong phạm vi con lai tự nhiên giữa hai loài Musa acuminata (A genome) và Musa balbistana (B genome), thường là những giống đa bội (AAA, AAB, hoặc ABB genomes)
- Một trong những bệnh quan trọng trong ngành sản xuất chuối là bênh “Panama” gây ra bởi nấm Fusarium wilt Bệnh này ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất chuối cũng như chất lượng chuối hàng năm Hơn thế, sự xuất hiện của những chủng tác nhân gây bệnh mới có thể gây nguy hiểm đối với sự tồn tại của toàn bộ nền công nghiệp sản xuất chuối và có thể làm hạn chế nguồn gen cho việc chọn lọc vô tính, đặc biệt là sự bùng nổ nạn dịch virus đã gây ra hậu quả nghiêm trọng không chỉ đối với ngành sản xuất chuối mà còn ở các ngành sản xuất khác
2 Chọn tạo giống chuối
- Tuy trung tâm khởi nguyên của chuối là ở vùng nhiệt đới nhưng sản lượng chuối hàng năm không cao Ở Philippin số buồng/ bụi cố định là 1 Trong khi đó một sôc nước có khí hậu ôn đới như Israeli lại có thể cho năng suất 1-3 buồng/ bụi
- Từ thực tế trên, các nhà chọn tạo giống đã tìm cách chọn tạo những giống cho năng suất cao
và chất lượng quả tốt và một trong những phương pháp chọn lọc hiện nay là việc chọn lọc dòng biến dị soma
Cụ thể là ở Western Galille phía Bắc Israeli, những nhà chọn giống ở đây đã tiến hành việc chọn giống chuối thông qua chọn lọc dòng biến dị soma Họ tạo ra những biến dị bằng việc nuôi cấy meristem chuối trong một thời gian dài với nhiều lần cấy chuyển và cảm ứng auxin bằng việc nuôi cấy trong môi trường giàu auxin
3 Vật liệu và phương pháp
a Sự đánh giá ban đầu
- Vật liệu ban đầu: 300 bụi cây của giống chuối Grande Naine (đã được nhân nhanh bằng nuôi cấy meristem)
- Huấn luyện cây 3 tháng trong nhà kính sau đó chúng được đưa tới trồng ở trạm trồng chuối
ở Western Galille
- Cách bố trí trồng:
+ Với khoảng cách 3x6x2.7
+ Theo mật độ 832 cây/ha
Trang 10+ Có hệ thống tưới nhỏ giọt, bón phân và những biện pháp canh tác khác đạt tiêu chuẩn ở Western Galille
- Thu thập dữ liệu của từng bụi cây để đánh giá trong hơn 6 năm Năng suất được xác định bằng việc tăng trọng lượn của mỗi buồng/ bụi
- 4 dòng ‘5-1’, ‘6-6’, ’37-5’, ’42-5’ thể hiện đặc biệt tốt và đã được chọn lọc để đánh giá tiếp
và dòng ’17-1’ thể hiện những đặc điểm chống chịu lạnh cũng được chọn
b Đánh giá dòng vô tính
Việc đánh giá dòng vô tính được thực hiện ở hai nơi
+) Tại Israeli
- Dựa vào kết quả thí nghiệm trên, những dòng tốt nhất được nhân nhanh bằng nuôi cấy meristem
- 70 cây của mỗi dòng được chọn và đại diện đối chứng có giá trị trung bình của 300 cây gốc ban đầu
- Vật liệu gồm những cây vi nhân giống đã cứng cáp, 3 tháng sau khi huấn luyện Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên với khoảng cách trồng như đã nói ở trên Số buồng/cây và trọng lượng mỗi buồng được ghi lại ở 10 cây đối với mỗi lần nhắc lại (trừ những cây ở đầu và cuối hàng)
- Cả thảy 20-30 buồng/lần nhắc và hơn 120 buồng/dòng được đánh giá hằng năm
+) Tại Philippine
- Ở đây hệ thống cây được trồng theo kiểu “hang rào cây” phạm vi 4,5m
- Cây được sắp xếp theo hàng hình tam giác với khoảng cách 1.25m
- Mật độ: 1973 cây/ha
- Cây ở đây cũng được tưới nhỏ giọt và bón phân tùy theo điều kiện của Philippine
- Thí nghiệm được chia ra làm ở 3 khu đất, mỗi khu đất trồng cả dòng của Israeli và giống đối chứng là dòng từ Ecuado với tỉ lệ 1:1 Mỗi mảnh đất này rộng 50ha
4 Cảm ứng biến dị bằng việc nuôi cấy trong thời gian dài meristem trong điều kiện invitro
- Nuôi cấy meristem được thực hiện trên dòng “Grande Naine” sử dụng phương pháp Rahan Meristem
- Meristem được cấy chuyển nhiều lần (23 lần) để gây ra những dòng biến dị soma
- Những cây con trong ống nghiệm được chuyển vào môi trường giàu GA (10ppm GA3)
- Phân tích sự cảm ứng của GA được kiểm tra bằng việc đo sự kéo dài và khoảng cách giữa các lóng của cây invitro sau 4 tuần nuôi cây trong môi trường có bổ sung GA
- Những thí nghiệm đánh giá tiếp những dòng biến dị soma được thực hiện ở điều kiện bên ngoài Theo dõi sự thích nghi của cây với khí hậu bằng cách trồng cây trong chậu và đặt chúng trong nhà kính trong khoảng 16 tuần trước khi chọn lọc “off-types”
5 Kết quả