Xác định môi trường cảm ứng tạo phôi thích hợp và cải thiện khả năng tạo dòng đơn bội kép bằng Colchicine trong nuôi cấy bao phấn bắp

Tuy nhiên có nhi u tr ng h p phôi không tái sinh thƠnh cơy con bình th ng... Tính theo công th c:.

TRONG NUÔI C Y BAO PH N B P

Khoa: Công ngh sinh h c

Chuyên ngành: Nông nghi p

CBHD 1: TS Lê Th Kính CBHD 2: CN Ph m Ng c H i SVTH: Nguy n Th Thu MSSV: 1053010750 Khóa: 2010

Tp H Chí Minh, tháng 5 n m 2014

i

L I C M N

m t sinh viên có đ c ch ng đ ng h c t p trên gi ng đ ng đ i h c nói chung và kho ng th i gian th c t p và làm khóa lu n t t nghi p nói riêng thành công, không th không k đ n s quan tơm giúp đ và ch d y t n tình c a quý th y cô, cha

m và b n bè

Em xin g i l i c m n sơu s c đ n quý th y cô khoa Công ngh sinh h c tr ng

i h c M Thành ph H Chí Minh luôn h t lòng truy n đ t nh ng ki n th c và kinh nghi m quý báu trong su t th i gian chúng em h c t p t i tr ng Nh ng đi u h c t p

t quý th y cô s là hành trang v ng ch c cho chúng em khi b c qua cánh c a đ i

ii

DANH M C B NG

Trang

B ng 2.1: Các hóa ch t đ c s d ng trong đ tài 17

B ng 2.2: Các nghi m th c thí nghi m 1 19

B ng 2.3: Các nghi m th c thí nghi m 2 20

B ng 2.4: Các nghi m th c thí nghi m 3 21

B ng 3.1: T l phôi t o thành t bao ph n b p trên ba môi tr ng MS, N6, YP 29

B ng 3.2: nh h ng c a myo-inositol và n ng đ sucrose lên s t o phôi c a bao ph n b p NK67 34

B ng 3.3: nh h ng c a myo-inositol và n ng đ sucrose lên s t o phôi c a bao ph n b p HN88 35

B ng 3.4: nh h ng c a colchicine lên kh n ng c m ng t o phôi c a bao ph n b p NK67 ngƠy th 30 sau nuôi c y 39

B ng 3.5: nh h ng c a colchine lên kh n ng tái sinh cơy trong nuôi c y bao ph n b p 41

iii

DANH M C HÌNH

Trang

Hình 1.1: S phát tri n in vitro c a h t ph n b p 7 Hình 1.2: C u t o c a c b p và bông b p 11 Hình 3.1: B p ngu n HN88 vƠ NK67 đ c tr ng vƠ ch m sóc trong nhƠ l i

sau 30 ngày gieo h t 24 Hình 3.2: M t s giai đo n phát tri n in vivo c a h t ph n b p

đ phóng đ i 40X 25 Hình 3.3: S t ng quan gi a các giai đo n phát tri n c a h t ph n

v i hình thái c b p, bông b p và bao ph n 26Hình 3.4: Nuôi c y bao ph n b p NK67 trên môi tr ng

c m ng t o phôi N6 27 Hình 3.5: C u trúc phôi hình thành t nuôi c y bao ph n b p HN88 trên môi

tr ng YP sau 34 ngày nuôi c y 28 Hình 3.6: Phôi phát sinh t bao ph n b p NK67 trên môi tr ng YP

sau 34 ngày nuôi c y 32 Hình 3.7: Bao ph n b p NK67 hóa nâu trên môi tr ng N6

sau 34 ngày nuôi c y 33 Hình 3.8: Phôi phát sinh t bao ph n b p HN88 nghi m th c S12M0

sau 34 ngày nuôi c y 38 Hình 3.9: Cây b p NK67 trên môi tr ng tái sinh sau 10 ngày nuôi c y 42 Hình 3.10: Cơy b p in vitro t nuôi c y bao ph n b p NK67 sau 55 ngƠy

chuy n ra nhƠ l i 45

iv

Bi u đ 3.1: nh h ng c a cochicine đ n kh n ng t o dòng đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n b p 43

vi

M C L C

T V N 1

Ph n 1: T NG QUAN TÀI LI U 3

1.1.T ng quan v cây b p 3

1.1.1 Phân lo i 3

1.1.2 Ngu n g c và phân b 3

1.1.3 Tình hình s n xu t b p trên th gi i và Vi t Nam 3

1.1.4 Vai trò c a b p trong n n kinh t 4

1.1.5 Gi ng b p lai đ n F1 NK67 vƠ HN88 5

1.2 T ng quan v nuôi c y bao ph n b p 6

1.2.1 Các giai đo n phát tri n in vivo c a h t ph n b p 6

1.2.2 S phát tri n c a h t ph n b p trong đi u ki n in vitro 7

1.2.3 Các nghiên c u v nuôi c y bao ph n trong vƠ ngoƠi n c 8

1.2.4 Các nhân t nh h ng đ n nuôi c y bao ph n b p 9

1.2.5 C i thi n kh n ng t o dòng đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n b p b ng colchicine 14

Ph n 2: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 17

2.1 V t li u 17

2.1.1 a đi m và th i gian thí nghi m 17

2.1.2 V t li u 17

2.2 Ph ng pháp nghiên c u 18

2.2.1 Xác đ nh giai đo n phát tri n c a h t ph n b p in vivo 18

vii

2.2.2 Thí nghi m 1: Xác đ nh môi tr ng c m ng t o phôi thích h p cho

nuôi c y bao ph n b p 182.2.3 Thí nghi m 2: Nghiên c u nh h ng c a myo-inositol và n ng đ

sucrose lên s t o phôi c a bao ph n b p 202.2.4 Thí nghi m 3: C i thi n kh n ng t o dòng đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n b p b ng colchicine 21

Ph n 3: K T QU VÀ TH O LU N 243.1 Xác đ nh giai đo n phát tri n c a h t ph n b p in vivo 243.2 Thí nghi m 1: Xác đ nh môi tr ng c m ng t o phôi thích h p cho

nuôi c y bao ph n b p 283.3 Thí nghi m 2: Nghiên c u nh h ng c a myo-inositol và n ng đ sucrose lên s t o phôi c a bao ph n b p 333.4 Thí nghi m 3: C i thi n kh n ng t o dòng đ n b i kép trong nuôi c y

bao ph n b p b ng colchicine 383.4.1 nh h ng c a colchicine lên kh n ng c m ng t o phôi c a

bao ph n b p 393.4.2 nh h ng c a colchicine lên kh n ng tái sinh cơy trong nuôi c y

bao ph n b p 413.4.3 nh h ng c a cochicine đ n kh n ng t o dòng đ n b i kép trong

nuôi c y bao ph n b p 43

Ph n 4: K T LU N VÀ KI N NGH 48TÀI LI U THAM KH O 49

ra dòng có đ thu n đ tiêu chu n dùng cho lai t o Tuy nhiên v i s phát tri n c a công ngh sinh h c hi n đ i, b ng ph ng pháp nuôi c y các t bƠo đ n b i (giao t ),

đ c bi t lƠ giao t đ c, ng i ta có th t o ra dòng thu n ch trong vòng vƠi tháng T

đó ti t ki m ngu n l c vƠ rút ng n th i gian c n thi t đ t o gi ng m i

Nuôi c y bao ph n lƠ k thu t nuôi c y in vitro các bao ph n ch a h t ph n ch a thƠnh th c trên môi tr ng dinh d ng thích h p đ t o ra cơy đ n b i (haploid) và

đ n b i kép Môi tr ng c m ng t o phôi nh h ng l n đ n t l cơy tái sinh t bao

ph n b p Tuy nhiên, kh n ng c m ng vƠ tái sinh c a bao ph n in vitro còn th p vƠ

ph thu c nhi u vƠo ki u gen Vì v y đ xác đ nh môi tr ng t i u cho m i ki u gen

c n ph i qua th c nghi m M t s môi tr ng c m ng th ng đ c s d ng trong các nghiên c u tr c đơy nh MS (Murashige and Skoog, 1962), N6 (Chu, 1975), YP (Genovesi and Collins, 1982), Nitsch (Nitsch, 1969) Trong đó N6 vƠ YP đƣ đ c

ch ng minh lƠ t t trong nuôi c y bao ph n b p khi so sánh v i m t s môi tr ng c m

ng t o phôi khác (Armstrong và cs, 1985; Mohammadi và cs, 2007)

Trong nuôi c y bao ph n b p, cây tái sinh ph n l n có b nhi m s c th đ n b i Trong quá trình nuôi c y, phôi phát sinh t bao ph n có th t đa b i hóa m t cách

ng u nhiên đ t o thƠnh cơy đ n b i kép (DH: double haploid) Cơy đ n b i kép tái sinh t nuôi c y bao ph n có s đ ng nh t v ki u gen vƠ có kh n ng sinh s n bình

th ng, vì v y nuôi c y bao ph n đ c coi nh ph ng pháp rút dòng thu n h u hi u

Theo nhi u nghiên c u tr c đơy, t l cây t đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n b p dao đ ng t 4,5% đ n 22%, trung bình lƠ 10% (Buter, 1997) Trong khi đó, t l này là 50% lúa m ch (Lyne và cs, 1986) vƠ lúa n c (Rania, 1989) N n nông nghi p hi n

2

đ i đang phát tri n v i nhu c u v gi ng ngƠy cƠng cao c v s l ng vƠ ch t l ng,

do đó rút ng n th i gian ch n t o nh ng gi ng m i u tú lƠ r t c n thi t S t đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n b p x y ra theo ki u ng u nhiên v i t n s th p, vì v y tìm ra ph ng pháp kích thích t đa b i trong nuôi c y bao ph n b p nh m t ng s

l ng vƠ rút ng n th i gian t o dòng thu n lƠ m t đóng góp tích c c cho công tác lai

vƠ ch n t o gi ng b p m i

Có nhi u ph ng pháp gơy đ t bi n đa b i trên th c v t nh ch n th ng c gi i,

s c nhi t, dùng tia r nghen nh ng ph ng pháp hóa h c lƠ đ n gi n vƠ nhanh nh t Cochicine là tác nhơn gơy đa b i đ c s d ng ph bi n nh t trong ph ng pháp t o cơy đa b i cùng ngu n

Do đó, đ tƠi “Xác đ nh môi tr ng c m ng t o phôi thích h p và c i thi n kh

n ng t o dòng đ n b i kép b ng colchicine trong nuôi c y bao ph n b p” đ c th c

hi n nh m m c đích xác đ nh môi tr ng c m ng t o phôi thích h p trong nuôi c y bao ph n b p, đ ng th i t o ra cơy đ n b i kép v i t l cao T đó có th s n xu t nhi u dòng b p thu n trong th i gian ng n v i chi phí hóa ch t vƠ công lao đ ng th p,

đ ng th i ti t ki m nguyên li u nuôi c y

3

Ph n 1: T NG QUAN TÀI LI U 1.1 T ng quan v cây b p

du nh p vào Vi t Nam kho ng 300 n m tr c vƠ lƠ cơy l ng th c quan tr ng đ ng

th hai sau lúa ( ng H ng D t, 2004)

1.1.3 Tình hình s n xu t b p trên trên th gi i và Vi t Nam

1.1.3.1 Tình hình s n xu t b p trên th gi i

Cùng v i lúa n c và lúa m , b p lƠ cơy l ng th c quan tr ng đ i v i các n c trên th gi i B p đ ng th 3 v di n tích, đ ng th hai v s n l ng vƠ đ ng th nh t

v n ng su t N m 1985, di n tích tr ng b p trên toàn th gi i là 126,706 tri u ha và

n m 2005 lƠ 145,499 tri u ha, n ng su t b p trung bình là 4,9 t n/ha và cho t ng s n

l ng 712,87 tri u t n, trong khi lúa m di n tích là 215,9 tri u ha, n ng su t 2,9

t n/ha và s n l ng 625,10 tri u t n vƠ lúa n c t ng ng 151,7 tri u ha, 4,1 t n/ha

và s n l ng 629,90 tri u t n (Ngô H u Tình, 2009)

M luôn lƠ c ng qu c s m t v b p N m 2006 có di n tích 28,6 tri u ha, n ng

su t bình quân 9,36 t n/ha và t ng s n l ng là 267,6 tri u t n, chi m 39% s n l ng

b p th gi i

4

Trung Qu c lƠ n c có n n s n xu t b p phát tri n và có s t ng tr ng r t nhanh, hi n lƠ n c có di n tích và s n l ng b p đ ng th hai th gi i N m 2006 Trung Qu c s n xu t 27,1 tri u ha b p v i n ng su t bình quân là 5,4 t n/ha và t ng

s n l ng là 145,6 tri u t n (FAOSTAT, 2007)

1.1.3.2 Tình hình s n xu t b p Vi t Nam

Cây b p đ c đ a vƠo Vi t Nam vào kho ng th k XVII, cách đơy kho ng 300

n m n c ta b p là cơy l ng th c quan tr ng đ ng th 2 sau lúa, v i di n tích

tr ng đang t ng d n qua các n m, n m 2000 lƠ 700 ngƠn ha vƠ n m 2006 lƠ 1,032 tri u ha

Tr c n m 1981 h u h t di n tích tr ng b p đ u đ c gieo tr ng gi ng b p đ a

ph ng nên n ng su t r t th p, ch đ t kho ng 1,47 ậ 1,56 t n/ha/v N ng su t này vào lo i th p nh t th gi i, th p h n n ng su t trung bình c a các n c đang phát tri n (2,4 t n/ha/v ) Trong nh ng n m v a qua n c ta đƣ có nh ng chuy n bi n quan

tr ng trong ngh tr ng b p Nông dân đƣ chuy n d n t các gi ng đ a ph ng sang các

gi ng b p th ph n ch n l c T n m 1990 các gi ng b p lai đ c đ a vƠo tr ng và

t ng nhanh qua các n m N m 1990 có 5 ha tr ng b p lai, đ n n m 1991 t ng lên 500

ha, n m 1993 lƠ 50 ngƠn ha vƠ n m 2000 lƠ 450 ngƠn ha ( ng H ng D t, 2004) Cây b p đ c tr ng t t c các vùng và các t nh Vi t Nam, song do y u t đ t đai vƠ khí h u nên n ng su t có s khác bi t rõ r t M t s t nh có di n tích tr ng b p

l n n c ta nh : S n La 82,4 ngƠn ha, Ngh An 67,1 ngƠn ha, ng Nai 56,8 ngàn

ha, HƠ Giang 43,3 ngƠn ha,… M t s t nh có n ng su t b p cao: An Giang 75,8 t /ha,

ng Tháp 65,5 t /ha, k Nông 58,9 t /ha,… (Ngô H u Tình, 2009)

1.1.4 Vai trò c a b p trong n n kinh t

H t b p có giá tr dinh d ng cao, trong h t b p ch a t ng đ i đ y đ các ch t dinh d ng c n thi t cho ng i và gia súc V i t l tinh b t cao (65 ậ 83%), b p đ c dùng là nguyên li u quan tr ng trong công nghi p ch bi n b t nhi u n c, ng i

ta đƣ ch bi n b p thành nhi u lo i bánh k o, đ h p Hi n nay đƣ có hƠng tr m m t hàng khác nhau t h t b p trong ngƠnh l ng th c, công ngh th c ph m, công

5

nghi p d c và công ngh ch bi n H ng n m trên th gi i l ng b p xu t nh p

kh u lên đ n kho ng 70 tri u t n Các n c xu t kh u ch y u là M , Pháp, Achentina, Mexico…

T t c các n c tr ng b p nói chung đ u n b p v i m c đ khác nhau Toàn th

gi i (giai đo n 1995 ậ 1997) s d ng 17% s n l ng b p lƠm l ng th c cho ng i, trong đó các n c đang phát tri n lƠ 30%, các n c phát tri n kho ng 4%, các n c Trung M , Nam Á và châu Phi s d ng b p lƠm l ng th c chính

Có th nói b p là cây th c n ch n nuôi quan tr ng nh t hi n nay Ngoài vi c cung

c p ch t tinh t h t, thơn cơy vƠ lá c ng đ c s d ng làm th c n xanh vƠ chua cho gia súc, đ c bi t là bò s a Theo th ng kê c a CIMMYT, giai đo n 1997 ậ 1999, th

gi i dùng b p làm th c n ch n nuôi lƠ 60% - kho ng 400 tri u t n/n m Các n c phát tri n có t l dùng b p làm th c n ch n nuôi th ng trên 70% M t s n c có t

l này r t cao nh M 76%, B Ơo Nha 91%, Malaysia 91%, (CIMMYT, 2001)

Hi n nay, Vi t Nam dùng b p làm th c n ch n nuôi lƠ chính Kho ng 70% ch t tinh trong th c n gia súc có ngu n g c t b p Ngoài ra, thân b p t i c ng đ c đ làm th c n cho gia súc (Cao c i m, 1998) Nhu c u th c n ch n nuôi n c ta

là r t l n, c n kho ng 4 tri u t n b p m i n m Nhu c u b p s ngƠy cƠng gia t ng vì ngƠnh ch n nuôi đang phát tri n r t m nh, k t h p v i ngành th y s n c ng tiêu th

m t l ng b p r t l n làm th c n cho tôm, cá

Ngoài ra, b t b p còn đ c dùng đ n u c n, s n xu t đ ng glucose làm môi

tr ng nuôi c y n m Pennicilin, Streptomicin, s n xu t acid acetic Lõi b p đ c dùng làm nguyên li u s n xu t nhi u h p ch t hóa h c nh aceton, nh a hóa h c Phôi b p

ch a 17,2 ậ 56,8% lipid nên có th dùng đ ép d u D u b p đ c s d ng r ng rãi trong công nghi p th c ph m và công nghi p d c ( ng H ng D t, 2004)

1.1.5 Gi ng b p lai đ n ạ1 NK67 và ảN88

Gi ng b p t NK67 và b p n p NH88 là hai gi ng b p lai đ n F1 đ c tr ng ph

bi n t i Vi t Nam Trong đó b p lai F1 NK67 có ngu n g c t Syngenta, là gi ng b p

đá, trái to, dƠi, cùi nh , đ c bi t có kh n ng ch u h n khá và kháng b nh r s t, đ m lá

N ng su t v hè thu kho ng 7 ậ 8 t n/ha (www.agpps.com.vn) Gi ng b p HN88 do

6

công ty c ph n Gi ng cây tr ng Trung ng tuy n ch n, là gi ng b p n p ng n ngày,

n ng su t cao, ch t l ng ngon, có v đ m, th m đ c tr ng Sinh tr ng kh e, ch u

h n và ch u rét t t, ch ng ch u t t v i sâu b nh, b p to dài, kín lá bi N ng su t b p

t i đ t 18-20 t n/ha (www.vinaseed.com.vn) C hai gi ng b p đ u có th tr ng quanh n m, tuy nhiên gieo tr ng c n tránh b p tr c phun râu vào các tháng quá khô, quá nóng, quá l nh đ đ m b o n ng su t

1.2 T ng quan v nuôi c y bao ph n b p

1.2.1 Các giai đo n phát tri n in vivo c a h t ph n b p

m c đ in vivo, ti p theo sau quá trình phân chia gi m nhi m c a t bào, các

h t ph n đ n b i đ n nhơn đ c gi i phóng ra kh i t t r i tr i qua hai l n nguyên phân đ thu đ c m t h t ph n ba nhân Giai đo n đ n nhơn s m có đ c đi m kích

th c nhơn t ng đ i l n chi m 1/3 đ n 1/2 th tích t bƠo n gi a giai đo n đ n nhân các h t ph n có kích th c l n h n, nhơn nh h n v i s hình thành c a không bào trung tâm l n, nhân b đ y v phía đ i di n v i l h t ph n (pollen pore) n cu i giai đo n đ n nhơn t bào h t ph n có th tích t ng lên vƠ tr i qua l n phân bào nguyên phân l n th nh t n đ u giai đo n hai nhân, các nhân gi ng nhau v kích th c

nh ng ngay sau đó b t đ u bi t hoá, nhơn sinh d ng có kích th c l n h n T i cu i giai đo n hai nhơn, nhơn nƠy di trú đ n phía đ i di n và n m g n l h t ph n, nhân sinh s n di trú v phía l h t ph n r i tr i qua s phân bào nguyên phân l n th hai đ thu đ c m t h t ph n ba nhân (Pescitelli và Petolino, 1988)

7

(Ngu n: Pescitelli và Petolino, 1988)

Hình 1.1: S phát tri n in vivo c a h t ph n b p

A T t B n nhơn s m C n nhơn gi a D n nhơn mu n: nhơn đ i

di n v i l h t ph n (m i tên) E Nguyên phân l n 1 F Hai nhân s m G Hai nhân gi a v i nhơn sinh d ng l n (v) H-I Hai nhân mu n J Nhân sinh d c (g)

di trú v l h t ph n K H t ph n ba nhân L H t ph n b t th ng (m i tên)

1.2.2 S phát tri n c a h t ph n b p trong đi u ki n in vitro

Trong quá trình nuôi c y bao ph n in vitro, ch m t t l nh các h t ph n tr i qua quá trình phát tri n th giao t in vivo bình th ng Trong nh ng gi đ u tiên c a nuôi c y bao ph n, các h t ph n b t đ u tr ng lên, sau đó m t ph n l n h t ph n b t

đ u ch t Trong tu n đ u tiên, t l h t ph n s ng sót gi m đi t 80 - 90% xu ng 10%

ho c th p h n Trong s các h t ph n s ng sót, m t s h t b t đ u tr i qua quá trình nguyên phân Sau nhi u l n nguyên phân liên ti p, các h t ph n phát tri n thành các

c u trúc đa bƠo mƠ v n n m trong v h t ph n, nh ng c u trúc nƠy đ c g i là "nh ng

h t ph n phát sinh phôi thu n tuý" Sau giai đo n này các c u trúc t bƠo đa nhơn t ng

tr ng v kích th c và tách kh i v h t ph n Các c u trúc phát sinh phôi đ c tách

8

ra hoƠn toƠn vƠ đ c bao b c b i l p t bào ngo i vi Cu i cùng là các c u trúc t ng

t phôi (embryo like structure) đa bƠo hình thƠnh (Pescitelli vƠ cs, 1988)

1.2.3 Các nghiên c u v nuôi c y bao ph n trong và ngoài n c

N m 1921, Bergner phát hi n ra cơy đ n b i đ u tiên trong t nhiên cƠ đ c

d c Datura stramonium L vƠ đ c báo cáo b i Blakeslee vƠ cs (1922) T i th i đi m

đó, vai trò quan tr ng c a th đ n b i đ i v i công tác lai t o vƠ nghiên c u di truy n

th c v t đƣ nhanh chóng đ c công nh n S l ng loƠi có kh n ng t đ n b i đ c phát hi n ngƠy m t nhi u n n m 2010, danh sách nh ng loƠi th ng x y ra s t

đ n b i m i đ c công b b i Dunwell Tuy v y, cơy đ n b i trong t nhiên xu t hi n

m t cách ng u nhiên v i t n su t r t th p không th đáp ng yêu c u nghiên c u vƠ

ch n t o gi ng

Kho ng 40 n m sau khi cơy đ n b i t nhiên đ u tiên đ c phát hi n, hai nhà khoa h c Guha vƠ Maheshwari (1964) đƣ ch ng minh có th nuôi c y bao ph n ch a

tr ng thƠnh trong đi u ki n in vitro nh m ng n c n s phát tri n bình th ng c a h t

ph n, làm cho phôi t o ra có b nhi m s c th đ n b i, t phôi này có th t o ra cây tái sinh đ n b i Phát hi n nƠy đƣ t o ti n đ cho hàng lo t nghiên c u sơu h n trong

t ng lai Lúa m ch (Hordeum vulgare L.), c i d u (Brassica napus L.), khoai tây (Nicotiana spp.) vƠ lúa n c (Triticum aestivum L.) th ng đ c dùng đ nghiên c u sâu v s t o phôi t h t ph n b i chúng có kh n ng tái sinh cao (Forster vƠ cs, 2007)

Tuy nhiên, không ph i giao t đ c c a t t c các lo i cây tr ng đ u có kh n ng

c m ng t t trên môi tr ng t o phôi M t s loài quan tr ng v m t khoa h c và kinh

t nh nh ng cây thu c h th p t , cây thân g hay m t s loài thu c h đ u v n còn

g p nhi u khó kh n trong vi c phát sinh hình thái in vitro (Bajaj, 1990; Germanà, 2009)

Cùng v i các cơy l ng th c khác, nuôi c y bao ph n b p c ng đƣ đ c nhi u nhà khoa h c quan tâm nghiên c u N m 1975, bao ph n b p đ c nuôi c y thành công trên môi tr ng MS (Anonymuos, 1975) Sau đó bao ph n b p đ c nuôi c y thành công trên nhi u môi tr ng khác nhau Nhìn chung nuôi c y bao ph n b p còn

9

g p nhi u khó kh n vƠ h n ch trong vi c ng d ng vào th c ti n M c dù v y, k thu t nuôi c y bao ph n đ thu nh n các dòng b p đ n b i kép đƣ đ c ng d ng thành công m t s n c Trung Qu c, h n 100 dòng thu n đƣ thu đ c t 30 t

h p lai khác nhau, m t s gi ng đ c áp d ng trong ch n t o gi ng lai vƠ đƣ đ c s

d ng trong s n xu t nh AC 4115, Elite DK 524… (Wu và cs, 1983)

Vi c nghiên c u và ng d ng k thu t nuôi c y bao ph n b p c ng đƣ thu hút

đ c m i quan tâm c a các nhà khoa h c trong n c Trên c s đó, vi c nghiên c u

t i u hoá các đi u ki n nuôi c y là c n thi t đ i v i ch ng trình nghiên c u ch n và

c i t o gi ng, nghiên c u di truy n và k thu t gen đ i v i cây b p Vi t Nam trong

th i gian t i, ph c v đ c l c cho vi c t o gi ng b p m i, đ c bi t là b p lai

VƠo n m 1998, trên c s các gi ng b p CM2, CM8, Vi n Di truy n Nông nghi p đƣ hoƠn thi n quy trình nuôi c y bao ph n v i t n s tái sinh cao (30-80%) V i quy trình này, th i gian t o dòng thu n rút ng n t 5 - 8 th h ngoƠi đ ng ru ng

xu ng còn 8 tháng trong phòng thí nghi m Vi n đƣ ti p t c nghiên c u áp d ng quy trình nƠy đ s n xu t các dòng thu n cho s n xu t Các nghiên c u t p đoƠn ngô Vi t Nam đƣ ch ra r ng: các gi ng b p Vi t Nam nhìn chung có ph n ng th p trong nuôi

c y bao ph n, do đó c n ph i c i ti n quy trình và nâng cao ph n ng c a các gi ng ngô Vi t Nam (Lê Huy Hàm, và cs, 1990, 1998)

1.2.4 Các nhân t nh h ng đ n nuôi c y bao ph n b p

1.2.4.1 Ki u gen c a c cho bao ph n

T n s phôi t o thành trong nuôi c y bao ph n b p ph thu c vào ki u gen c a cây cho bao ph n (Genovesi và cs, 1990) i v i nuôi c y bao ph n b p, ch m t t l

nh ki u gen c a bao ph n nuôi c y có kh n ng c m ng t o phôi (Miao và cs, 1978) Kh n ng c m ng t o phôi là khái ni m ch t l phôi t o thành t nuôi c y bao ph n c a m t ki u gen, m t ki u gen có kh n ng c m ng t o phôi cao khi t l phôi t o thành t nuôi c y bao ph n c a ki u gen đó cao Miao và cs (1978) báo cáo

r ng ch có 9 trong t ng s 159 (kho ng 5,6%) ki u gen b p trong nghiên c u có kh

n ng c m ng Trong khi đó, Petalino vƠ Jones (1986) ch quan sát đ c hi n t ng

10

c m ng t o phôi 12 trong s 39 ki u gen (30,8%) l y t United States Corn Belt, trong đó bao ph n c a nh ng cây lai cho t l ph n ng cao h n NgoƠi ra, nh ng ki u gen d h p t th ng c m ng t t h n nh ng ki u gen đ ng h p t (Genovesi và Collins, 1982)

1.2.4.2 Tr ng thái sinh lý c a cây cho bao ph n

Tr ng thái sinh lý c a cây m nh h ng đ n kh n ng c m ng t o phôi trong nuôi c y bao ph n b p (Nitsch và cs, 1982) Bao ph n trên nh ng cây kh e m nh có t

l c m ng t o phôi cao h n h n bao ph n trên nh ng cây y u, ngay c nh ng ki u gen đƣ đ c cho là c m ng t t Genovesi (1990) quan sát th y ch m t vài phôi ho c

mô s o in vitro đ c t o thành t nh ng cây m sinh tr ng y u, đơy lƠ m t nhân t

r t quan tr ng nh h ng tr c ti p đ n s c m ng t o phôi trong nuôi c y bao ph n Ông còn nh n m nh s quan tr ng c a y u t môi tr ng, bao g m nh h ng c a chu k chi u sáng, c ng đ và ch t l ng ánh sáng, nhi t đ và ch đ dinh d ng cho cây b p kh e m nh Das vƠ cs (2002) thu đ c l ng phôi cao g p đôi khi nuôi

c y bao ph n c a cơy sinh tr ng trong đi u ki n nhi u ánh sáng khi so sánh v i cây sinh tr ng trong môi tr ng râm mát M t khác, phôi t bao ph n c a cây sinh

tr ng trong môi tr ng rơm mát c ng phát tri n ch m và y u h n Cơy m sinh

tr ng và phát tri n trong đi u ki n nhi t đ ban ngày t 25 ậ 30o

C và nhi t đ ban đêm t 18 ậ 20o

C, th i gian chi u sáng 16 ậ 18 gi là nh ng đi u ki n thu n l i cho

s c m ng t o ph i c a bao ph n b p (Buter, 1997)

Mùa v c ng nh h ng đ n kh n ng t o phôi c a bao ph n nuôi c y Cây b p sinh tr ng trong nhƠ l i vƠo mùa đông th ng không t o phôi (Dieu và Beckert, 1986; Petalino và Thompson, 1987)

1.2.4.3 Ảiai đo n c a h t ph n và s phát tri n c a bao ph n nuôi c y

Có nhi u báo cáo cho r ng l a ch n bao ph n khi h t ph n giai đo n đ n nhơn

tr c khi ti n x lý l nh lƠm t ng kh n ng c m ng c a bao ph n nuôi c y (Nitsch

vƠ cs, 1982) Ku vƠ cs (1981) vƠ Brettel vƠ cs (1981) đ u báo cáo r ng bao ph n s

c m ng t t nh t khi h t ph n giai đo n không bƠo vƠ giai đo n đ n nhân mu n

11

Trái ng c v i các nghiên c u k trên, Satorova (1994) l i quan sát th y h t ph n

đ u giai đo n hai nhân c m ng t o phôi t t nh t Das vƠ cs (2002) đƣ so sánh kh

n ng c m ng c a h t ph n các giai đo n đ n nhơn s m, gi a, mu n và hai nhân

s m K t qu cho th y phôi thu đ c nhi u nh t gi a giai đo n đ n nhơn (8,54%),

ti p theo lƠ giai đo n đ n nhơn mu n (7,27%) và th p nh t giai đo n đ n nhơn s m

(Ngu n: Tr n V n D vƠ cs, 2011)

Hình 1.2: C u t o c a c b p và bông b p

1.2.4.4 Ti n x lý và c

X lý l nh c b p ngay sau khi thu đƣ đ c ch ng minh là r t quan tr ng, bao

ph n đ c ti n x lý l nh c m ng cao h n khi không đ c x lý vì nhi t đ th p giúp ng n c n s phát tri n c a giao t (Pace và cs, 1987) Tuy nhiên, Pescitelli và Petolino (1988) ch ng minh r ng h t ph n v n ti p t c quá trình phát tri n c a chúng

12

trong th i gian x lý l nh H t ph n giai đo n gi a đ n cu i đ n nhơn sau khi x lý

l nh 10 ậ 14 ngày 8o

C s phát tri n t i giai đo n đ n nhơn mu n đ n hai nhân gi a

ƣ có nhi u nghiên c u v nhi t đ c ng nh th i gian x lý l nh khác nhau Dieu vƠ Beckert (1986) thu đ c k t qu nuôi c y t t nh t khi ti n x lý c b p 7 ngày 7°C và ti p t c 7 ngày 14°C Genovesi (1990) và Choi và cs (1995) x lý 10°C và 9°C trong 14 ngày Yuan và cs (2001) báo cáo r ng x lý c 5°C t 15

đ n 21 ngày cho hi u qu t o thành phôi l n nh t Ti p theo, gi bao ph n nhi t đ 33°C giúp t o ra phôi s m, nhi u và ch t l ng h n Das vƠ cs (2002) thu đ c t l bao ph n c m ng cao nh t (8,54%) 8 - 10°C trong 14 ngày và 27 ± 2°C trong

14 ngày T l c m ng th p nh t khi 25 ± 2°C và 30°C

1.2.4.5 Môi tr ng nuôi c y

Môi tr ng đ u tiên nuôi c y thành công bao ph n b p là MS (Murashige và Skoog, 1962) ch a 12 - 24% sucrose, k t qu thu đ c 1% phôi đ c t o thành (Anonymous, 1975) Môi tr ng N6 (Chu vƠ cs, 1975) đƣ đ c s d ng đ nuôi c y thành công bao ph n b p (Brettell, 1980) Bên c nh MS vƠ N6, môi tr ng YP (Ku

vƠ cs, 1978) c ng đ c s d ng thành công trong nuôi c y bao ph n b p (Genovesi

và Collins, 1982; Petalino và Jones, 1986)

Beaumont (1997) đƣ nghiên c u nh h ng c a các ngu n đ ng khác nhau lên

s c m ng c a bao ph n b p K t qu cho th y phôi không đ c t o thành trên môi

tr ng có b sung manitol, starch, trihalose và maltotriose Trên môi tr ng ch a sucrose, bao ph n b p c m ng t t nh t Tr c đó, Brettell (1980) đƣ s d ng môi

tr ng N6 + 12% sucrose + 500 mg/l casein hydrolysate + 0,35 mg/l TIBA và t o

đ c n m cơy con in vitro hoàn ch nh, vào th i đi m đó k t qu nƠy đ c coi là m t thành công l n trong nuôi c y bao ph n b p vƠ lƠ b c đ m cho nhi u nghiên c u v sau T ng t , Sheridan và cs (1980) báo cáo r ng t l c m ng đ c c i thi n trên 7

ki u gen khác nhau khi nuôi c y trên môi tr ng N6 ch a 12% sucrose và 0,5% than

ho t tính M t nghiên c u khác c a Kuo và cs (1988) cho r ng môi tr ng N6 b sung casein hydrolysate, 0,5% than ho t tính và 15% sucrose là t i u nh t cho nuôi

b p C n b sung cytokinin n ng đ cao vƠo môi tr ng nuôi c y, t t nh t nên s

d ng TIBA và không b sung thêm b t k hormone sinh tr ng nƠo trong môi tr ng nuôi c y T ng t , Genovesi và Collins (1982) c ng thu đ c t l c m ng cao nhi u ki u gen nh t khi s d ng môi tr ng YP + 0,1 mg/l TIBA Lo i pyridoxine và pantothenate kh i môi tr ng nuôi c y không nh ng không gây h i mà còn có th c i thi n t l bao ph n c m ng

Theo Zheng và cs (1983), bao ph n b p không c m ng khi b sung auxin D) vƠo môi tr ng và c m ng không n đ nh v i antiauxin (TIBA) T l t o phôi

(2,4-t ng khi b sung TIBA vƠo môi (2,4-tr ng YP nh ng l i không có hi u qu (2,4-trên môi

tr ng N6 T l phôi t ng khi gi m n ng đ auxin vƠ t ng n ng đ cytokinin trong môi tr ng Hongchang và cs (1991) báo cáo r ng mô s o t o đ c nhi u nh t trên môi tr ng YP b sung 2mg/l 2,4-D và 1,5 mg/l kinetin

Myo-inositol là m t trong nh ng ch t đ c s d ng nhi u nh t trong nuôi c y mô cùng v i thiamine (B1), acid nicotinic (PP) và pyridoxine (B6) M c dù đơy lƠ m t carbohydrate ch không ph i là vitamin, nó c ng đ c ch ng minh kích thích cho s

t ng tr ng c a t bƠo đa s loài th c v t Ng i ta cho r ng myo-inositol đ c phân tách ra thành acid ascorbic và peptine vƠ đ c đ ng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol có vai trò quan tr ng trong s phân chia t bào Myo-inositol có vai trò trong sinh t ng h p thành t bào, c th là sinh t ng h p acid polygalacturonic

và pectine

Trong nuôi c y bao ph n, myo-inositol th ng đ c b sung vƠo môi tr ng nuôi c y m t s loƠi nh lúa n c v i n ng đ 100 mg/l (Niroula và cs, 2005), 100 mg/l lúa m ch (Asakaviciute và cs, 2008) và 50 mg/l lúa m (Last vƠ cs, 1990)…

v n ch a đ c th nghi m

1.2.4.6 Môi tr ng tái sinh

Phôi đ c t o thành t bao ph n b p s tái sinh thành cây hoàn ch nh trên môi

tr ng tái sinh Ch t l ng c a phôi là y u t đ c quan tâm nhi u b i nó nh h ng

đ n s tái sinh cây trong nuôi c y bao ph n b p (Dieu và Beckert, 1986) Nh ng phôi

có r có t l tái sinh th p nh t trong khi phôi d ng c u tái sinh t t nh t

Phôi đ c chuy n vào kho ng 20 ngày sau khi nuôi c y Tuy nhiên có nhi u

tr ng h p phôi không tái sinh thƠnh cơy con bình th ng Có nhi u phôi t o ra r

nh ng không t o ch i, s khác l i ra ch i nh ng không có r và m t s tr ng h p

b t th ng khác Môi tr ng tái sinh N6 b sung 2,4-D (2mg/l) và kinetin (1,5mg/l)

có th ki m soát đ c tình tr ng này (Hassan và cs, 2001)

Nitsch vƠ cs (1982) thu đ c t l tái sinh l n nh t trên môi tr ng YP b sung 0,1 mg/l TIBA Barnabás (1999) đƣ s d ng môi tr ng MS b sung 100 mg/l myo-inositol +150 mg/l L-asparagine + 0,5 mg/l thiamine HCl + 1 mg/l kinetine + 0,05 mg/l NAA + 2 g/l sucrose + 7 g/l agar pH 5,8 K t qu thu đ c 22,2% cây tái sinh

l ng loài có th t o ra cơy đ n b i vƠ đ n b i kép ngày càng nhi u Cơy đ n b i và

đ n b i kép là công c đ c l c ph c v nh ng nghiên c u v t bào h c, nghiên c u

v đ t bi n và di truy n vƠ đ c bi t là ch n t o gi ng cây tr ng n nay, kho ng 300

S t đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n đƣ đ c báo cáo m t s loài quan

tr ng nh lúa m ch (Subrahmanyam and Kasha, 1975), thu c lá (Burk và cs, 1972), lúa mì (Hu vƠ cs, 1978), lúa n c (Chen và Li, 1978), b p (Ku và cs, 1981), b p c i (Charne và cs, 1988) T l cây t đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n b p dao đ ng

t 4,5% đ n 22%, trung bình là 10% (Buter, 1997) Trong khi đó, t l này là 50% lúa m ch (Lyne vƠ cs, 1986) vƠ lúa n c (Raina, 1989)

G n đơy, m t s nhà khoa h c đƣ nghiên c u v nh ng nh h ng c a colchicine lên s t o thƠnh cơy đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n trên m t s loƠi ng c c: lúa

mì (Redha và cs, 1998; Zamani và cs, 2000), b p (Saisingtong và cs, 1996; Barnabás

vƠ cs, 1999), lúa n c (Chen vƠ cs, 2001) Colchicne đ c dùng làm tác nhân gây

l ng b i t bào th c v t trong đi u ki n in situ và in vitro Colchicine có kh n ng liên k t v i tubulin, m t protein c u t o nên các s i vi ng Liên k t này c n tr s hình thành các s i vi ng khi n nhi m s c th không th di chuy n v hai c c t bào

d n đ n b nhi m s c th c a t bƠo đ c g p đôi sau m i chu k nguyên phân

Ph ng pháp x lý colchicine đ c s d ng ph bi n nh t là ngâm r cây vào dung

d ch colchicine (Levan, 1938) m t s loƠi, đ nh sinh tr ng, ch i nách, ch i r

c ng đ c dùng đ x lý colchicine (Mathias và Robbelen, 1991) Nh ng ph ng pháp này cho k t qu kho ng 50% cây ph n ng l i tác đ ng c a colchicine, tuy nhiên t l cây ch t ho c b t th ng v m c b i th cao (Wenzel và cs, 1977; Banabás

và cs, 1990) b p, vi c x lý colchicine trên cây con có th làm g p đôi b nhi m

s c th c ho c trái, nh ng hi m khi c hai i u này gây tr ng i l n cho vi c t

th đ t o ra dòng thu n (Wan vƠ cs, 1989) Nh v y, ph n l n cây ch t ho c phát tri n b t th ng đ c quan sát sau khi x lý colchicine giai đo n cây con, ch ng t

vi c t o th đ n b i kép giai đo n cây tái sinh trong nuôi c y bao ph n b p không

có hi u qu cao

t ng t l cây b t th ng (Mohammadi và cs, 2007) Trong m t s nghiên c u, x lý colchicine k t h p s c nhi t l nh trong 7 ngƠy lƠm t ng t l cơy đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n b p (Saisingtong và cs, 1996; Antoine Michard và Beckert, 1997)

17

2.1 V t li u

2.1.1 a đi m và th i gian thí nghi m

a đi m: PTN Nuôi c y mô, Trung tâm nghiên c u Gi ng cây tr ng Mi n Nam,

p Tân Hi p, huy n Phú Giáo, t nh Bình D ng

ng sucrose CTCP ng Biên

Hòa

Hi Media Laboratories,

n

- Thi t b , d ng c : Kính hi n vi, t l nh, máy c t n c, n i h p kh trùng, bình nuôi

c y, t c y, g ng tay, kh u trang…

18

2.2 Ph ng pháp nghiên c u

2.2.1 Xác đ nh giai đo n phát tri n c a h t ph n b p in vivo

M c đích

Xác đ nh s t ng quan gi a s phát tri n c a h t ph n b p theo t ng giai đo n

v i đ c đi m hình thái c a c b p, bông b p và bao ph n T đó d dàng l a ch n giai

đo n phát tri n c a h t ph n thích h p cho nuôi c y bao ph n d a vào hình thái c a c

và bông b p

Ph ng pháp

C b p đ c thu khi ch a nhú ra kh i b lá, sau đó c đ c 14 ngày 9o

C (Genovesi, 1990) Sau khi x lý l nh, ti n hƠnh xác đ nh giai đo n phát tri n c a h t

ph n d i kính hi n vi v t kính 40X Bao ph n đ c l y t nh ng bông trên tr c chính c a c b p, nhu m h t ph n b ng acetocarmine ho c soi t i h t ph n d i kính

hi n vi đ xác đ nh giai đo n phát tri n i chi u s phát tri n c a h t ph n v i đ c

đi m c a c b p, bông b p và bao ph n đ rút ra k t lu n

2.2.2 Thí nghi m 1: Xác đ nh môi tr ng c m ng t o phôi thích h p cho nuôi c y

bao ph n b p

M c đích

Kh o sát kh n ng t o phôi c a bao ph n b p trên ba môi tr ng MS, N6 và YP

T đó tìm ra môi tr ng c m ng t o phôi thích h p: t l phôi t o ra nhi u

Ph ng pháp

Thí nghi m đ c th c hi n t tháng 11/2013 đ n tháng 1/2014

Thí nghi m đ c b trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên v i 6 nghi m th c, 4 l n

l p l i, 5 bình nuôi c y/ l p l i/ nghi m th c, c y 50 bao ph n/ bình nuôi c y Các nghi m th c đ c b trí giai đo n c m ng t o phôi trong quy trình nuôi c y bao

ph n b p

19

B ng 2.2: Các nghi m th c thí nghi m 1

1 MS-T ( C1) Nuôi c y bao ph n ki u gen NK67 trên môi tr ng MS

2 MS-N ( C2) Nuôi c y bao ph n ki u gen HN88 trên môi tr ng MS

3 N6-T Nuôi c y bao ph n ki u gen NK67 trên môi tr ng N6

4 N6-N Nuôi c y bao ph n ki u gen HN88 trên môi tr ng N6

5 YP-T Nuôi c y bao ph n ki u gen NK trên môi tr ng YP

6 YP-N Nuôi c y bao ph n ki u gen NH88 trên môi tr ng YP Môi tr ng MS b sung: 500mg/l casein hydrolysate + 0,5 g/l than ho t tính +

12 g/l sucrose + 2 mg/l 2,4 ậ D

Môi tr ng N6 b sung: 500mg/l casein hydrolysate + 0,5 g/l than ho t tính +

12 g/l sucrose + 2 mg/l 2,4 ậ D (Xu Jia, 1998)

Môi tr ng YP b sung: 500mg/l casein hydrolysate + 0,5 g/l than ho t tính +

12 g/l sucrose + 0,1 mg/l TIBA (Genovesi và Collins, 1982)

pH môi tr ng tr c khi kh trùng: pH = 5,8

Ch tiêu theo dõi vƠ ph ng pháp l y ch tiêu

- T l c u trúc d ng phôi đ c t o thành: ti n hành ki m tra phôi kho ng m t tháng sau khi nuôi c y bao ph n b p trên môi tr ng c m ng t o phôi Tính theo công

th c:

20

2.2.3 Thí nghi m 2: Nghiên c u nh h ng c a myo-inositol và n ng đ sucrose lên

s t o phôi c a bao ph n b p

M c đích

Kh o sát nh h ng c a các n ng đ myo-inositol và sucrose lên kh n ng c m

ng t o phôi c a bao ph n b p T đó tìm ra n ng đ myo-inositol và sucrose thích

h p cho nuôi c y bao ph n b p

Ph ng pháp

Thí nghi m đ c th c hi n t tháng 12/2013 đ n 2/2014

Thí nghi m đ c b trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên, 6 nghi m th c, 4 l n l p

l i, 5 bình nuôi c y/ l p l i/ nghi m th c, c y 50 bao ph n/ bình nuôi c y Các nghi m

th c đ c b trí giai đo n c m ng t o phôi trong quy trình nuôi c y bao ph n b p,

2 T-S9M1 N-S9M1 Nuôi c y bao ph n b p trên môi tr ng b sung

5 T-S12M1 N-S12M1 Nuôi c y bao ph n b p trên môi tr ng b sung

12% sucrose + 50 mg/l myo-inositol

6 T-S12M2 N-S12M2 Nuôi c y bao ph n b p trên môi tr ng b sung

12% sucrose + 100 mg/l myo-inositol

21

Ch tiêu theo dõi vƠ ph ng pháp l y ch tiêu

- T l c u trúc d ng phôi đ c t o thành: ti n hành ki m tra phôi kho ng m t tháng sau khi nuôi c y bao ph n b p trên môi tr ng c m ng t o phôi Tính theo công

th c:

2.2.4 Thí nghi m 3: C i thi n kh n ng t o dòng đ n b i kép trong nuôi c y bao ph n

b p b ng colchicine

M c đích

Kh o sát nh h ng c a các n ng đ colchicine lên kh n ng c m ng t o phôi và

t l cơy đ n b i kép t o thành t bao ph n b p, nh m c i thi n kh n ng t o dòng đ n

b i kép trong nuôi c y bao ph n b p

Ph ng pháp

Thí nghi m đ c th c hi n t tháng 1/2014 đ n 5/2014

Thí nghi m đ c b trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên v i 3 nghi m th c, 7 l n

l p l i, 5 bình nuôi c y/ l p l i/ nghi m th c, c y 50 bao ph n/ bình nuôi c y S

22

Ch tiêu theo dõi vƠ ph ng pháp l y ch tiêu

- Quan sát s c u trúc d ng phôi đ c t o thành

- T l cây tái sinh t phôi: tính theo công th c

T l cây tái sinh (%) = S cây tái sinh x 100%

S phôi nuôi c y

- T l cơy đ n b i kép: tính theo công th c:

T l cơy đ n b i kép (%) = S cơy đ n b i kép x 100%

S cây tái sinh

Ph ng pháp x lý s li u: S li u đ c x lý th ng kê theo ph n m m Statgraphics

- Giai đo n c m ng t o phôi

Nh ng đo n c mang h t ph n trong giai đo n đ n nhơn gi a đ n hai nhân s m

đ c l a ch n và kh trùng b m t v i dung d ch clorine 7% trong 10 ậ 15 phút r i

r a l i 3 l n v i n c c t đƣ kh trùng Sau đó, bao ph n đ c nuôi c y trên môi

tr ng c m ng t o phôi Giai đo n này, bao ph n đ c nuôi c y trong phòng t i hoàn toàn nhi t đ 28oC

- Giai đo n tái sinh ch i

Sau kho ng 30 ngày nuôi c y bao ph n b p trên môi tr ng c m ng t o phôi, các phôi và mô s o hình thành t bao ph n đ c chuy n sang môi tr ng tái sinh MS b sung 1 mg/l kinetine + 30 g/l sucrose + 7g/l agar Nuôi c y trong đi u ki n chi u sáng

12 gi /ngày, nhi t đ 25oC

23

- Giai đo n tái sinh r

Khi cơy đ t chi u cao 3-4cm, chuy n cơy sang môi tr ng ra r MS 1 mg/l kinetine + 1 mg/l NAA + 20 g/l sucrose + 7g/l agar + 3 g/l than ho t tính Nuôi c y trong đi u ki n chi u sáng 12h/ngày, nhi t đ 25oC

- Ra ngôi: Cây tái sinh đ c tr ng trên giá th đ t s ch trong đi u ki n phòng 2 ngày Cu i cùng, cơy đ c chuy n ra các b u đ t trong nhƠ l i

Ph ng pháp x lý bao ph n b p b ng colchicine

Colchicine đ c kh trùng b ng màng l c vi khu n kích th c 0,02 µm, sau đó b sung vƠo môi tr ng c m ng t o phôi đƣ đ c kh trùng v i hai n ng đ là 0,02% và 0,03% môi tr ng đƣ đ c chu n b vƠo đ a Petri (15 ml/đ a) vƠ c y bao ph n b p trên môi tr ng v i m t đ 50 bao ph n/đ a Petri và nuôi c y trong phòng t i nhi t

đ 28oC Sau 3 ngày, chuy n bao ph n t môi tr ng b sung colchicine sang môi

tr ng không có colchicine, bao ph n m t đ a Petri chuy n sang m t bình nuôi c y

24

Ph n 3: K T QU VÀ TH O LU N 3.1 Xác đ nh giai đo n phát tri n c a h t ph n b p in vivo

H t gi ng b p NK67 và HN88 đ c tr ng vƠ ch m sóc trong nhƠ l i C b p

đ c thu ngày th 45 sau khi gieo h t, lúc này c v n ch a nhú ra kh i b lá Theo Genovesi và cs (1990), nh ng c trong giai đo n này ch a ph n l n h t ph n giai

đo n đ n nhơn C b p đ c x lý l nh nhi t đ 9o

C trong 14 ngày (Genovesi, 1990) tr c khi nuôi c y bao ph n Nh ng bao ph n mang h t ph n t giai đo n đ n nhân gi a đ n hai nhân s m đ c c y trên môi tr ng c m ng t o phôi (Buter, 1997)

Hình 3.1: B p ngu n NK67 và HN88 đ c tr ng vƠ ch m sóc trong nhƠ l i

sau 30 ngày gieo h t

25

Hình 3.2: M t s giai đo n phát tri n in vivo c a h t ph n b p

đ phóng đ i 40X

A) H t ph n m i tách kh i th t t (x) và h t ph n giai đo n đ n nhơn (y)

B) n nhơn s m C) n nhân gi a D) n nhơn mu n E) Phân bào l n 1 F) Hai nhân s m

Chú thích:

M i tên: l h t ph n n1: nh n sinh d ng

n: nhân n2: nhân sinh s n

Các c b p thu đ c trong nghiên c u đ u ch a các h t ph n đƣ tr i qua giai

đo n t t Trong m t bao ph n có th ch a h t ph n đang m t ho c hai giai đo n phân chia sát g c c , m t ph n nh h t ph n đ c quan sát m i tách kh i th t t ,

nh ng h t ph n này có vách m ng vƠ kích th c nh h n so v i h t ph n các giai

đo n sau (Hình 3.2A) Sau giai đo n t t h t ph n giai đo n đ n nhơn s m có nhân

l n, chi m 1/3 đ n 1/2 th tích h t ph n (Hình 3.2B) Giai đo n đ n nhơn gi a, nhân

ti n l i g n l h t ph n vƠ có kích th c nh d n (Hình 3.2C) n giai đo n đ n

26

nhân cu i, không bƠo trung tơm có kích th c l n đ y nhân sát vào vách t bào, v phía đ i di n l h t ph n (Hình 3.2D) Sau đó, t bào h t ph n m t nhân b t đ u quá trình nguyên phân (Hình 3.2E) t o thành t bào h t ph n hai nhân (Hình 3.2F)

Hình 3.3: S t ng quan gi a các giai đo n phát tri n c a h t ph n

v i hình thái c b p, bông b p và bao ph n

A: S phân b các giai đo n phát tri n c a h t ph n trên c b p

B: Bông b p ch a h t ph n giai đo n đ n nhân s m

B: Bông b p ch a h t ph n giai đo n đ n nhơn gi a đ n đ n nhơn mu n C: Bông b p ch a h t ph n giai đo n hai nhân s m

Nhìn chung h t ph n giai đo n đ n nhơn s m phân b g c c b p, chi m kho ng 1/6 chi u dài c , lá bao ngoƠi đo n c này có đ c đi m m m, có màu tr ng

ho c ng sang xanh r t nh t (Hình 3.3A) Bông b p giai đo n này nh , mày ngoài

m ng và có màu tr ng s a, bao ph n màu vàng t i, bóng, m m (Hình 3.3B)

27

H t ph n giai đo n đ n nhơn gi a vƠ đ n nhơn mu n chi m kho ng 2/3 chi u dài c b p Lá bao ngoƠi đo n c này có màu xanh nh t và dai (Hình 3.3A) Bông b p

l n h n giai đo n đ n nhơn s m, mày ngoài có màu tr ng đ c g n cu ng và xanh

nh t chóp bông, bao ph n mƠu vƠng t i (Hình 3.3C)

H t ph n giai đo n hai nhân s m phân b ng n c , chi m kho ng 1/6 chi u dài

c , lá bao ngoƠi đo n c nƠy dai vƠ có mƠu xanh đ m (Hình 3.3A), bông l n, mày dai

và có màu xanh đ m chi m ph n l n di n tích, bao ph n c ng vƠ có mƠu vƠng t i (Hình 3.3D) T ng t k t qu trong nghiên c u c a Genovesi và cs (1990), c b p

đ c thu trong nghiên c u nƠy c ng ch a ph n l n h t ph n giai đo n đ n nhơn Sau khi đƣ l a ch n đ c nh ng đo n c giai đo n t đ n nhơn gi a đ n hai nhân s m, bao ph n b p đ c nuôi c y trên ba môi tr ng c m ng t o phôi MS, N6

vƠ YP đ nghiên c u các đ nh môi tr ng c m ng t o phôi thích h p cho nuôi c y bao ph n b p HN88 và NK67

Hình 3.4: Nuôi c y bao ph n b p NK67 trên môi tr ng

c m ng t o phôi N6

28

3.2 Thí nghi m 1: Xác đ nh môi tr ng c m ng t o phôi thích h p cho nuôi c y bao ph n b p

Môi tr ng c m ng t o phôi đóng vai trò quan tr ng trong nuôi c y bao ph n Vì

v y thí nghi m đ c 1 th c hi n nh m so sánh kh n ng c m ng t o phôi c a bao

ph n b p trên ba môi tr ng MS, N6, YP, t đó xác đ nh môi tr ng thích h p nh t cho nuôi c y bao ph n b p NK67 và HN88

Kho ng 20 ngày sau khi b t đ u nuôi c y, các c u trúc d ng phôi b t đ u xu t

hi n Hai d ng c u trúc đ c tr ng c a phôi là phôi phát tri n g n v i thành bao ph n và phôi phát tri n tách r i thành bao ph n Phôi g n v i thành bao ph n có nhi u hình

d ng vƠ kích th c khác nhau (Hình 3.5A), phôi phát tri n tách r i thành bao ph n

th ng có hình c u (Hình 3.5B) T l phôi t o thành trong nuôi c y bao ph n b p

đ c th hi n qua b ng 3.1

Hình 3.5: C u trúc phôi hình thành t nuôi c y bao ph n b p HN88 trên môi

tr ng YP sau 34 ngày nuôi c y

A1-A2: phôi dính vào bao ph n B1-B2: phôi tách kh i bao ph n

S li u trong ngo c đƣ đ c chuy n đ i sang (x+0,5)1/2 trong quá trình th ng kê

Chú thích:

N6-T: Nuôi c y bao ph n ki u gen NK67 trên môi tr ng N6

N6-N: Nuôi c y bao ph n ki u gen ảN88 trên môi tr ng N6

YP-T: Nuôi c y bao ph n ki u gen NK67 trên môi tr ng YP

YP-N: Nuôi c y bao ph n ki u gen Nả88 trên môi tr ng YP