Xác định môi trường cảm ứng tạo phôi thích hợp và cải thiện khả năng tạo dòng đơn bội kép bằng Colchicine trong nuôi cấy bao phấn bắp

TRNG I HC M THÀNH PH H CHÍ MINH BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài: XÁC NH MÔI TRNG CM NG TO PHÔI THÍCH HP VÀ CI THIN KH NNG TO DÒNG N BI KÉP BNG COLCHICINE TRONG NUÔI CY BAO PHN BP Khoa: Công ngh sinh hc Chuyên ngành: Nông nghip CBHD 1: TS. Lê Th Kính CBHD 2: CN. Phm Ngc Hi SVTH: Nguyn Th Thu MSSV: 1053010750 Khóa: 2010 Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014 i LI CM N  mt sinh viên có đc chng đng hc tp trên ging đng đi hc nói chung và khong thi gian thc tp và làm khóa lun tt nghip nói riêng thành công, không th không k đn s quan tơm giúp đ và ch dy tn tình ca quý thy cô, cha m và bn bè. Em xin gi li cm n sơu sc đn quý thy cô khoa Công ngh sinh hc trng i hc M Thành ph H Chí Minh luôn ht lòng truyn đt nhng kin thc và kinh nghim quý báu trong sut thi gian chúng em hc tp ti trng. Nhng điu hc tp t quý thy cô s là hành trang vng chc cho chúng em khi bc qua cánh ca đi hc. Em xin chân thành cm n cô Lê Th Kính đƣ hng dn chúng em trong sut quá trình thc hin đ tƠi cng nh dy bo chúng em qua các bui hc trên lp. Cm n ban Giám đc Trung tâm nghiên cu Ging cây trng Min Nam đƣ to điu kin thun li cho chúng em có c hi thc tp trong môi trng làm vic chuyên nghip và thân thin. Em cm n anh Phm Ngc Hi, anh Nguyn Duy Khánh cùng các anh ch t nuôi cy mô cng nh trong phòng công ngh sinh hc luôn quan tơm giúp đ và ch dy cho chúng em tn tình. Cui cùng, con xin t lòng bit n chơn thƠnh đn công lao dng dc và sinh thành ca cha m. Sinh viên Nguyn Th Thu ii DANH MC BNG Trang Bng 2.1: Các hóa cht đc s dng trong đ tài 17 Bng 2.2: Các nghim thc thí nghim 1 19 Bng 2.3: Các nghim thc thí nghim 2 20 Bng 2.4: Các nghim thc thí nghim 3 21 Bng 3.1: T l phôi to thành t bao phn bp trên ba môi trng MS, N6, YP 29 Bng 3.2: nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi ca bao phn bp NK67 34 Bng 3.3: nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi ca bao phn bp HN88 35 Bng 3.4: nh hng ca colchicine lên kh nng cm ng to phôi ca bao phn bp NK67  ngƠy th 30 sau nuôi cy 39 Bng 3.5: nh hng ca colchine lên kh nng tái sinh cơy trong nuôi cy bao phn bp 41 iii DANH MC HÌNH Trang Hình 1.1: S phát trin in vitro ca ht phn bp 7 Hình 1.2: Cu to ca c bp và bông bp 11 Hình 3.1: Bp ngun HN88 vƠ NK67 đc trng vƠ chm sóc trong nhƠ li sau 30 ngày gieo ht 24 Hình 3.2: Mt s giai đon phát trin in vivo ca ht phn bp  đ phóng đi 40X 25 Hình 3.3: S tng quan gia các giai đon phát trin ca ht phn vi hình thái c bp, bông bp và bao phn 26 Hình 3.4: Nuôi cy bao phn bp NK67 trên môi trng cm ng to phôi N6 27 Hình 3.5: Cu trúc phôi hình thành t nuôi cy bao phn bp HN88 trên môi trng YP sau 34 ngày nuôi cy 28 Hình 3.6: Phôi phát sinh t bao phn bp NK67 trên môi trng YP sau 34 ngày nuôi cy 32 Hình 3.7: Bao phn bp NK67 hóa nâu trên môi trng N6 sau 34 ngày nuôi cy 33 Hình 3.8: Phôi phát sinh t bao phn bp HN88  nghim thc S12M0 sau 34 ngày nuôi cy 38 Hình 3.9: Cây bp NK67 trên môi trng tái sinh sau 10 ngày nuôi cy 42 Hình 3.10: Cơy bp in vitro t nuôi cy bao phn bp NK67 sau 55 ngƠy chuyn ra nhƠ li 45 iv DANH MC BIU  Biu đ 3.1: nh hng ca cochicine đn kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp 43 v DANH MC NHNG T VIT TT 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid CTCP: Công ty c phn MS: Murashige and Skoog, 1962 PTN: Phòng thí nghim N6: Chu, 1975 TIBA: 2,3,5-Triiodobenzoic acid YP: Ku và cs, 1981 w/v: Phn trm khi lng/ th tích vi MC LC T VN  1 Phn 1: TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1.Tng quan v cây bp 3 1.1.1. Phân loi 3 1.1.2. Ngun gc và phân b 3 1.1.3. Tình hình sn xut bp trên th gii và Vit Nam 3 1.1.4. Vai trò ca bp trong nn kinh t 4 1.1.5. Ging bp lai đn F1 NK67 vƠ HN88 5 1.2. Tng quan v nuôi cy bao phn bp 6 1.2.1. Các giai đon phát trin in vivo ca ht phn bp 6 1.2.2. S phát trin ca ht phn bp trong điu kin in vitro 7 1.2.3. Các nghiên cu v nuôi cy bao phn trong vƠ ngoƠi nc 8 1.2.4. Các nhân t nh hng đn nuôi cy bao phn bp 9 1.2.5. Ci thin kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp bng colchicine 14 Phn 2: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 17 2.1. Vt liu 17 2.1.1. a đim và thi gian thí nghim 17 2.1.2. Vt liu 17 2.2. Phng pháp nghiên cu 18 2.2.1. Xác đnh giai đon phát trin ca ht phn bp in vivo 18 vii 2.2.2. Thí nghim 1: Xác đnh môi trng cm ng to phôi thích hp cho nuôi cy bao phn bp 18 2.2.3. Thí nghim 2: Nghiên cu nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi ca bao phn bp 20 2.2.4. Thí nghim 3: Ci thin kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp bng colchicine 21 Phn 3: KT QU VÀ THO LUN 24 3.1. Xác đnh giai đon phát trin ca ht phn bp in vivo 24 3.2. Thí nghim 1: Xác đnh môi trng cm ng to phôi thích hp cho nuôi cy bao phn bp 28 3.3. Thí nghim 2: Nghiên cu nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi ca bao phn bp 33 3.4. Thí nghim 3: Ci thin kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp bng colchicine 38 3.4.1. nh hng ca colchicine lên kh nng cm ng to phôi ca bao phn bp 39 3.4.2. nh hng ca colchicine lên kh nng tái sinh cơy trong nuôi cy bao phn bp 41 3.4.3. nh hng ca cochicine đn kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp 43 Phn 4: KT LUN VÀ KIN NGH 48 TÀI LIU THAM KHO 49 1 T VN  Các ging bp lai F1 hin đang chim gi th trng bp ging trên toƠn th gii bi u th vt tri v nng sut vƠ cht lng ca chúng so vi các ging th phn t do (OP: open pollinated).  to ra mt ging bp lai F1 có kh nng cnh tranh tt trên th trng, vic chn to các dòng cha m thun chng u vit là yu t tiên quyt. Phng pháp truyn thng thng đc s dng lƠ rút dòng t qun th phơn ly (F2, F3). T mt qun th lai F2 phi tri qua 6 ậ 8 v t th (khong 4 nm) mi to ra dòng có đ thun đ tiêu chun dùng cho lai to. Tuy nhiên vi s phát trin ca công ngh sinh hc hin đi, bng phng pháp nuôi cy các t bƠo đn bi (giao t), đc bit lƠ giao t đc, ngi ta có th to ra dòng thun ch trong vòng vƠi tháng. T đó tit kim ngun lc vƠ rút ngn thi gian cn thit đ to ging mi. Nuôi cy bao phn lƠ k thut nuôi cy in vitro các bao phn cha ht phn cha thƠnh thc trên môi trng dinh dng thích hp đ to ra cơy đn bi (haploid) và đn bi kép. Môi trng cm ng to phôi nh hng ln đn t l cơy tái sinh t bao phn bp. Tuy nhiên, kh nng cm ng vƠ tái sinh ca bao phn in vitro còn thp vƠ ph thuc nhiu vƠo kiu gen. Vì vy đ xác đnh môi trng ti u cho mi kiu gen cn phi qua thc nghim. Mt s môi trng cm ng thng đc s dng trong các nghiên cu trc đơy nh MS (Murashige and Skoog, 1962), N6 (Chu, 1975), YP (Genovesi and Collins, 1982), Nitsch (Nitsch, 1969). Trong đó N6 vƠ YP đƣ đc chng minh lƠ tt trong nuôi cy bao phn bp khi so sánh vi mt s môi trng cm ng to phôi khác (Armstrong và cs, 1985; Mohammadi và cs, 2007). Trong nuôi cy bao phn bp, cây tái sinh phn ln có b nhim sc th đn bi. Trong quá trình nuôi cy, phôi phát sinh t bao phn có th t đa bi hóa mt cách ngu nhiên đ to thƠnh cơy đn bi kép (DH: double haploid). Cơy đn bi kép tái sinh t nuôi cy bao phn có s đng nht v kiu gen vƠ có kh nng sinh sn bình thng, vì vy nuôi cy bao phn đc coi nh phng pháp rút dòng thun hu hiu. Theo nhiu nghiên cu trc đơy, t l cây t đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp dao đng t 4,5% đn 22%, trung bình lƠ 10% (Buter, 1997). Trong khi đó, t l này là 50%  lúa mch (Lyne và cs, 1986) vƠ lúa nc (Rania, 1989). Nn nông nghip hin 2 đi đang phát trin vi nhu cu v ging ngƠy cƠng cao c v s lng vƠ cht lng, do đó rút ngn thi gian chn to nhng ging mi u tú lƠ rt cn thit. S t đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp xy ra theo kiu ngu nhiên vi tn s thp, vì vy tìm ra phng pháp kích thích t đa bi trong nuôi cy bao phn bp nhm tng s lng vƠ rút ngn thi gian to dòng thun lƠ mt đóng góp tích cc cho công tác lai vƠ chn to ging bp mi. Có nhiu phng pháp gơy đt bin đa bi trên thc vt nh chn thng c gii, sc nhit, dùng tia rnghen nhng phng pháp hóa hc lƠ đn gin vƠ nhanh nht. Cochicine là tác nhơn gơy đa bi đc s dng ph bin nht trong phng pháp to cơy đa bi cùng ngun. Do đó, đ tƠi “ng cm ng to phôi thích hp và ci thin kh i kép bng colchicine trong nuôi cy bao phn bp” đc thc hin nhm mc đích xác đnh môi trng cm ng to phôi thích hp trong nuôi cy bao phn bp, đng thi to ra cơy đn bi kép vi t l cao. T đó có th sn xut nhiu dòng bp thun trong thi gian ngn vi chi phí hóa cht vƠ công lao đng thp, đng thi tit kim nguyên liu nuôi cy. [...]... b p T n s phôi t o thành trong nuôi c y bao ph n b p ph thu c vào ki u gen c a cây cho bao ph n (Genovesi và cs, 1990) i v i nuôi c y bao ph n b p, ch m t t l nh ki u gen c a bao ph n nuôi c y có kh 1978) Kh m ng t o phôi (Miao và cs, m ng t o phôi là khái ni m ch t l phôi t o thành t nuôi c y bao ph n c a m t ki u gen, m t ki u gen có kh m ng t o phôi cao khi t l phôi t o thành t nuôi c y bao ph n... ng trong nuôi c y bao ph n Vì c 1 th c hi n nh m so sánh kh ng MS, N6, YP, t m ng t o phôi c a bao ng thích h p nh t cho nuôi c y bao ph n b p NK67 và HN88 Kho ng 20 ngày sau khi b hi n Hai d ng c u nuôi c y, các c u trúc d ng phôi b u xu t a phôi là phôi phát tri n g n v i thành bao ph n và phôi phát tri n tách r i thành bao ph n Phôi g n v i thành bao ph n có nhi u hình d c khác nhau (Hình 3.5A), phôi. .. bông l n, mày dai k t qu trong nghiên c u c a Genovesi và cs (1990), c b p c thu trong nghiên c a ch nhân s m, bao ph n b a ph n l n h t ph n c nh nc c nuôi c nghiên c nt n hai ng c m ng t o phôi MS, N6 ng c m ng t o phôi thích h p cho nuôi c y bao ph n b p HN88 và NK67 Hình 3.4: Nuôi c y bao ph n b ng c m ng t o phôi N6 27 3.2 Thí nghi ng c m ng t o phôi thích h p cho nuôi c y bao ph n b p ng c m ng... i, 5 bình nuôi c y/ l p l i/ nghi m th c, c y 50 bao ph n/ bình nuôi c y Các nghi m th c b trí giai n c m ng t o phôi trong quy trình nuôi c y bao ph n b p 18 B ng 2.2: Các nghi m th c thí nghi m 1 STT Tên nghi m th c 1 MS- Nuôi c y bao ph n ki u gen ng MS 2 MS- Nuôi c y bao ph n ki u gen ng MS 3 N6-T Nuôi c y bao ph n ki u gen ng N6 4 N6-N Nuôi c y bao ph n ki u gen ng N6 5 YP-T Nuôi c y bao ph n ki... ch (Asakaviciute và cs, 2008) và 50 mg/l lúa m 13 Trong nuôi c y bao ph n b p, myoTuy nhiên, cb ng c a myo- ng c m ng t o phôi v ng tái sinh n s t o phôi c a bao ph n b p trên môi c nghiên c u và công b nhi u Genovesi và ng s d ng myo-inositol 100 mg/l không có tác d ng kích thích s t o phôi trong nuôi c y bao ph n b p Tuy nhiên nh ng n v khác c th nghi m ng tái sinh c t o thành t bao ph n b p s tái... a Wan và cs (1989, 1995) cho th y: khi x lý colchicine v i hai n 0,025% và 0,05% c y bao ph n 50% và hai n n phôi và mô s o, cây b p tái sinh t nuôi x lý không có s khác bi t, t l i kép kho ng nh v m t di truy n Banabás và cs (1999), Payam và cs (2007) l i báo cáo r ng s d ng colchicine u nuôi c y cho t l Nghiên c u c a Banabás và cs (1999) khi s d ng hai n 0,03% x lý bao ph n b p i kép cao colchicine. .. thu c lá (Burk và cs, 1972), c (Chen và Li, 1978), b p (Ku và cs, 1981), b p c i (Charne và cs, 1988) T l cây t t i kép trong nuôi c y bao ph n b n 22%, trung bình là 10% (Buter, 1997) T lúa m ng l này là 50% c (Raina, 1989) G t s nhà khoa h lên s t u v nh ng ng c a colchicine i kép trong nuôi c y bao ph n trên m t s c: lúa mì (Redha và cs, 1998; Zamani và cs, 2000), b p (Saisingtong và cs, 1996; Barnabás... m ng t o phôi Tính theo công th c: 2.2.4 Thí nghi m 3: C i thi n kh i kép trong nuôi c y bao ph n b p b ng colchicine M Kh o sát t l ng c a các n ng colchicine lên kh m ng t o phôi và i kép t o thành t bao ph n b p, nh m c i thi n kh b i kép trong nuôi c y bao ph n b p Thí nghi c th c hi n t n 5/2014 Thí nghi c b trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên v i 3 nghi m th c, 7 l n l p l i, 5 bình nuôi c y/... th c, c y 50 bao ph n/ bình nuôi c y S d ng bao ph n c a ki u gen NK67 B ng 2.4: Các nghi m th c thí nghi m 3 STT Tên nghi m th c Nuôi c y bao ph n b 1 ng YP, không x lý colchicine 2 C1 3 C2 X lý bao ph c khi nuôi c y trong 3 ngày b ng colchicine 0,02% X lý bao ph c khi nuôi c y trong 3 ngày b ng colchicine 0,03% 21 Ch y ch tiêu - Quan sát s c u trúc d c t o thành - T l cây tái sinh t phôi: tính theo... khu n ng c m ng t o phôi 0,03% c kh trùng v i hai n c chu n b ng v i m b là 0,02% và y bao ph n b p 50 bao ph etri và nuôi c y trong phòng t i 28oC Sau 3 ngày, chuy n bao ph n t ng không có colchicine, bao ph n c 0,02 µm, m nhi t ng b sung colchicine sang môi etri chuy n sang m t bình nuôi c y 23 Ph n 3: K T QU VÀ TH O LU N n phát tri n c a h t ph n b p in vivo H t gi ng b p NK67 và HN88 c thu c tr . LUN TT NGHIP Tên đ tài: XÁC NH MÔI TRNG CM NG TO PHÔI THÍCH HP VÀ CI THIN KH NNG TO DÒNG N BI KÉP BNG COLCHICINE TRONG NUÔI CY BAO PHN BP Khoa: Công ngh. 1969). Trong đó N6 vƠ YP đƣ đc chng minh lƠ tt trong nuôi cy bao phn bp khi so sánh vi mt s môi trng cm ng to phôi khác (Armstrong và cs, 1985; Mohammadi và cs, 2007). Trong nuôi. myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi ca bao phn bp 20 2.2.4. Thí nghim 3: Ci thin kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp bng colchicine 21 Phn 3: KT QU VÀ THO