nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép (dưa chuột, ớt) phục vụ chọn tạo giống ưu thế lai

Vì vậy, việc áp dụng biện pháp nuôi cấy in vitrro bao phấn sẽ rút ngắn được thời gian tạo dòng thuần mà các nghiên cứu trên một số cây lương thực đã khẳng định được tính hiệu quả của nó

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU RAU QUẢ

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020

-*** -

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG ĐƠN BỘI KÉP (DƯA CHUỘT, ỚT) PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ƯU THẾ LAI

Cơ quan chủ trì đề tài : Viện Nghiên cứu Rau quả

Chủ nhiệm đề tài : GS.TS Trần Khắc Thi

8827

HÀ NỘI, 6/2011

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu chung 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 3

1.3 Cách tiếp cận 3

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Vai trò của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng 4

2.2 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo cây đơn bội 5

2.2.1 Giới thiệu chung 5

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn 6

2.2.3 Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội in vitro trên thế giới và trong nước 11

2.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống dưa chuột, ớt cay ở nước ta 17

2.3.1 Chọn giống dưa chuột 17

2.3.2 Chọn giống ớt cay 20

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Vật liệu nghiên cứu 22

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 24

3.2 Nội dung nghiên cứu 24

3.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tạo dòng đơn bội kép (dưa chuột, ớt) 24

3.2.1.1 Trên cây dưa chuột 24

3.2.1.2 Trên cây ớt 30

3.2.2 Ứng dụng quy trình tạo dòng đơn bội kép của một số giống lai F1

dưa chuột, ớt 34

3.2.3 Đánh giá chọn lọc cây 2n, phát triển thành dòng thuần 34

3.3 Phương pháp nghiên cứu 35

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 35

3.3.2 Chỉ tiêu theo dõi 38

3.3.3 Thời gian thực hiện 40

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Kết quả nghiên cứu trên cây dưa chuột 41

4.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo cây dưa chuột đơn bội kép 41

4.1.2 Kết quả ứng dụng quy trình tạo cây dưa chuột đơn bội kép trên một số giống dưa chuột lai F1 65

4.1.3 Kết quả đánh giá, chọn lọc cây dưa chuột đơn bội kép trong điều 68

4.2 Kết quả nghiên cứu trên cây ớt 75

4.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo cây ớt đơn bội kép 75

4.2.2 Ứng dụng quy trình tạo dòng ớt đơn bội kép trên các giống ớt lai F1 (Hottchili, Green F1, GK99) 96

4.2.3 Kết quả đánh giá, chọn lọc cây ớt đơn bội kép trong điều kiện nhà lưới 99

3.3 Một số đặc điểm về quả của các tổ hợp lai ớt cay trong vụ xuân hè 2010 106

3.4 Khả năng chống chịu sâu bệnh các tổ hợp lai ớt cay vụ đông xuân 2011 107

3.5 Khả năng kết hợp chung của các dòng ớt đơn bội kép 108

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 111

5.1 Kết luận 111

5.2 Đề nghị 112

MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG ĐỀ TÀI 119

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA α -Naphthaleneacetic acid

BAP 6 - Benzylamino purine

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Đặc điểm của một số giống dưa chuột lai F1 được chọn làm

guồn vật liệu cung cấp hoa để lấy bao phấn nuôi cấy 22 Bảng 3.2 Đặc điểm của một số giống ớt lai F1 được chọn làm nguồn vật

liệu cung cấp hoa để lấy bao phấn nuôi cấy 23 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng cơ bản đến sự khả

năng tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột (sau 4 tuần) 41 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy

bao phấn cây dưa chuột (sau 4 tuần) 42 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến khả năng tạo callus từ

nuôi cấy bao phấn cây dưa chuột (sau 4 tuần) 43 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý lạnh đến khả năng

tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn cây dưa chuột (sau 6 tuần) 44

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo callus từ nuôi cấy in

vitrro bao phấn cây dưa chuột sau (8 tuần nuôi cấy) 46

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP đến sự tạo callus từ nuôi

cấy in vitrro bao phấn cây dưa chuột (sau 8 tuần) 47

Bảng 4.7 : Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + Kinetin đến sự tạo callus từ

nuôi cấy in vitrro bao phấn cây dưa chuột (sau 8 tuần) 48

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng tái sinh của cây dưa chuột

(sau 8 tuần) 50 Bảng 4.9: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự tái sinh từ callus bao

phấn cây dưa chuột (sau 8 tuần) 51 Bảng 4.10: Ảnh hưởng của BAP + TDZ đến khả năng tái sinh của cây

dưa chuột (sau 8 tuần) 52

Bảng 4.11: Kết quả phân tích độ bội của các chồi dưa chuột 54 Bảng 4.12: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh của chồi dưa

chuột in vitro (sau 4 tuần) 55 Bảng 4.13: Ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng nhân nhanh của chồi

dưa chuột in vitro (sau 4 tuần) 56 Bảng 4.14: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến khả năng nhân nhanh

cây dưa chuột đơn bội (sau 4 tuần) 57 Bảng 4.15: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến khả năng nhân

nhanh cây dưa chuột đơn bội (sau 4 tuần) 59 Bảng 4.16 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng nhân

nhanh chồi dưa chuột đơn bội (sau 4 tuần) 60 Bảng 4.17 Ảnh hưởng của hàm lượng casein đến khả năng nhân nhanh

chồi dưa chuột đơn bội (sau 4 tuần) 61 Bảng 4.18: Ảnh hưởng của xử lý colchicine đến khả năng nhị bội hóa

dòng dưa chuột đơn bội 62 Bảng 4.19: Ảnh hưởng của αNAA đến khả năng ra rễ của chồi dưa

chuột 63 Bảng 4.20: Ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ của chồi dưa chuột 64 Bảng 4.21: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi dưa chuột 64 Bảng 4.22: Kết quả tạo dòng dưa chuột đơn bội kép trên 3 giống

Mijabel, Ajax, Marinda 66 Bảng 4.23: Tỷ lệ sống của cây dưa chuột đơn bội kép 68 Bảng 4.24 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng phát triển của các

dòng dưa chuột trong vụ xuân năm 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 68 Bảng 4.25 Đặc điểm sinh trưởng phát triển của các dòng dưa chuột tạo

ra từ dòng đơn bội (vụ xuân năm 2010 tại viện Nghiên cứu Rau quả) 69

Bảng 4.26 Năng suất, yếu tố cấu thành năng suất và đặc điểm quả của

các dòng dưa chuột đơn bội kép (vụ xuân năm 2010 tại viện Nghiên cứu Rau quả) 70 Bảng 4.27 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng của các THL dưa

chuột trong vụ đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 71 Bảng 4.28 Đặc điểm hình thái của các tổ hợp lai dưa chuột trong vụ

đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 72 Bảng 4.29 Một số đặc điểm hình thái của các tổ hợp lai dưa chuột vụ

đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 72 Bảng 4.30 Đặc điểm quả của các tổ hợp lai dưa chuột trong vụ đông

2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 73 Bảng 4.31 Tình hình nhiễm bệnh đồng ruộng của các THL trong vụ

đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 73 Bảng 4.32: Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các tổ hợp

lai dưa chuột vụ đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 74 Bảng 4.33 Khả năng kết hợp chung của các dòng dưa chuột với 2 vật

liệu thử 74 Bảng 4.34: Tỷ lệ sống của bao phấn in vitro trên 3 loại môi trường dinh

dưỡng cơ bản (Sau 6 tuần ) 76

Bảng 4.35 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến khả năng tạo callus từ

nuôi cấy bao phấn cây ớt (sau 6 tuần) 77 Bảng 4.36: Ảnh hưởng của xử lý lạnh và thời gian xử lý đến tỷ lệ sống

của bao phấn (sau 6 tuần ) 78 Bảng 4.37: Ảnh hưởng của αNAA đến khả năng tạo callus từ bao phấn

của cây ớt (sau 6 tuần) 80 Bảng 4.38: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA + BAP đến khả năng tạo callus

từ bao phấn ớt (sau 6 tuần) 81

Bảng 4.39: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA + Kinetine đến khả năng tạo

callus từ bao phấn của cây ớt (sau 6 tuần) 82 Bảng 4.40: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng tái sinh của callus ớt (sau

4 tuần ) 84 Bảng 4.41: Ảnh hưởng của Zeatin đến khả năng tái sinh của cây ớt 84 Bảng 4.42: Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ + GA3 đến khả năng tái sinh

cây ớt (sau 4 tuần ) 85 Bảng 4.43: Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 + Zeatin đến sự tái sinh cây ớt

(sau 4 tuần) 86 Bảng 4.44: Kết quả phân tích độ bội của các chồi ớt 87 Bảng 4.45: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh của cây ớt

(sau 4 tuần) 88 Bảng 4.46: Ảnh hưởng của kinetine đến khả năng nhân nhanh của cây ớt

tái sinh (sau 4 tuần) 90

Bảng 4.47: Ảnh hưởng của BAP phối hợp với αNAA đến khả năng

nhân nhanh của cây ớt (sau 4 tuần) 91 Bảng 4.48: Ảnh hưởng của BAP phối hợp với IBA đến khả năng nhân

nhanh của cây ớt (sau 4 tuần) 91 Bảng 4.49: Ảnh hưởng của cao nấm men và dịch chiết hữu cơ đến chất

lượng chồi ớt (sau 4 tuần) 92 Bảng 4.50: Ảnh hưởng của xử lý Colchicines đến khả năng nhị bội hóa

dòng đơn bội 93 Bảng 4.51: Ảnh hưởng của αNAA và IBA đến khả năng ra rễ của chồi ớt 95 Bảng 4.52 : Kết quả ứng dụng quy trình tạo cây đơn bội kép trên 3 giống 96 Bảng 4.53: Tỷ lệ sống của cây đơn bội kép 99 Bảng 4.54 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng phát triển của các

dòng ớt đơn bội kép chọn lọc 100

Bảng 4.55 Chiều cao cây qua các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của

các dòng ớt đơn bội chọn lọc 101 Bảng 4.56 Đặc điểm hình thái thân, lá, quả của các của các dòng ớt đơn

bội kép chọn lọc 102 Bảng 4.57 Đặc điểm hình thái hoa của các dòng ớt đơn bội kép chọn lọc 103 Bảng 4.58: Năng suất và yếu tố cấu thành năng suất các dòng ớt đơn bội

kép chọn lọc 103 Bảng 4.59 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của các tổ

hợp lai trong vụ đông xuân 2010 104 Bảng 4.60 Năng suất và các yếu tố tạo thành năng suất của các tổ hợp

lai ớt cay vụ đông xuân 2010 105 Bảng 4.61 Đặc điểm quả của các tổ hợp lai ớt cay vụ Đông xuân 2011 106 Bảng 4 62 Khả năng chống chịu sâu bệnh các tổ hợp lai ớt cay vụ đông

xuân 2011 107 Bảng 4.63: Khả năng kết hợp chung về năng suất của các dòng và cây

thử 108

PHẦN I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Sản xuất rau là ngành có vai trò ngày càng quan trọng và có mức tăng trưởng khá cao trong sản xuất nông nghiệp của nước ta Rau xanh vừa là nguồn thực phẩm không thể thiếu cho mỗi bữa ăn hàng ngày với yêu cầu mức tăng khối lượng bình quân hàng năm gấp đôi tỷ lệ tăng dân số ( FAO, 2006), vừa là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và là mặt hàng nông sản xuất khẩu có tiềm năng Mức tăng sản lượng rau của nước ta khá cao: theo số liệu thống kê, năm 2010 tổng diện tích trồng rau các loại đạt 780 ngàn ha, sản lượng 13 triệu tấn; so với 2005 diện tích tăng 145 ngàn ha( tốc độ tăng bình quân 4,2%/năm), sản lượng tăng 3,3 triệu tấn( tốc độ tăng bình quân 6,1%/năm) Đây cũng là ngành sản xuất mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân Theo số liệu của dự án Superchain ( 2009) thu nhập bình quân trên

1 ha rau ở Đồng bằng sông Hồng tại vùng luân canh với cây lương thực đạt trung bình 46,3 triệu đồng/vụ, tại vùng chuyên canh từ 86- 120 triệu đồng/ năm Một trong những nguyên nhân của sự tăng trưởng trên là tỷ lệ sử dụng các tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất, nhất là giống lai khá cao Tuy nhiên phần lớn các giống lai F1 được nhập hoặc do các công ty nước ngoài cung cấp Việc tạo giống trong nước, đặc biệt là nhóm rau chủ lực, có khả năng ra hoa

trong điều kiện Việt Nam thuộc các họ thực vật Cucurbitaceae và Sonalaceae

là cần thiết trong giai đoạn hiện tại và trong tương lai

Dưa chuột và ớt cay thuộc nhóm cây rau ăn quả chủ lực ở nước ta hiện nay Ngoài việc đáp ứng nhu cầu trong nước ngày càng tăng , sản phẩm của các cây này còn là nguồn nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu với thị trường rộng lớn và ổn định Hầu hết các giống dưa chuột và ớt cay hiện đang trồng trên đất nông nghiệp tại vùng sản xuất hàng hóa tập trung ở nước ta là giống lai F1 có nguồn gốc nước ngoài Các giống này ngoài năng suất và độ đồng

đều cao, quả của các giống này còn thích hợp với thị hiếu tiêu dùng của nước nhập khẩu Tuy nhiên, do giá thành hạt giống cao và nhiều giống chưa qua khảo nghiệm tính thích ứng đã ảnh hưởng tới hiệu quả sản xuất Việc tạo giống trong nước theo yêu cầu của sản xuất và phù hợp với sinh thái vùng canh tác ngày càng trở lên cần thiết

Bên cạnh đó, các giống lai nước ngoài được nhập nội trồng liên tục qua nhiều năm đã làm xói mòn nguồn gen các giống thuần địa phương có tính thích ứng cao, khả năng chống chịu sâu bệnh và chất lượng thương phẩm tốt Một trong những khó khăn nữa của công tác tạo giống lai các đối tượng trên hiện nay là việc tạo ra các dòng thuần bằng phương pháp truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian và công sức Thông qua thụ phấn cưỡng bức và chọn lọc liên tục cũng phải qua 7-8 thế hệ mới nhận được các dòng thuần để đánh giá khả năng kết hợp của chúng Tuy vậy, phương pháp này trong nhiều trường hợp vẫn không cho các dòng bố mẹ đồng hợp tử ở tất cả các cặp allen

Vì vậy, việc áp dụng biện pháp nuôi cấy in vitrro bao phấn sẽ rút ngắn được

thời gian tạo dòng thuần mà các nghiên cứu trên một số cây lương thực đã khẳng định được tính hiệu quả của nó, đồng thời có thể lợi dụng nguồn vật liệu là các giống thương mại đang trồng phổ biến để tạo dòng thuần làm nguồn vật liệu cho con lai mới [6], [11]

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã giao cho Viện Nghiên cứu Rau quả chủ trì thực hiện đề tài:

“ Nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép (dưa chuột, ớt) phục vụ chọn tạo giống

ưu thế lai” Giai đoạn 2007 – 2010

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu chung

Tạo được một số dòng ớt, dưa chuột mới làm nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống ưu thế lai phục vụ sản xuất bằng công nghệ đơn bội kép

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

+ Quy trình tạo dòng dưa chuột, ớt đơn bội kép

+ Tạo được 1-2 dòng dưa chuột, ớt thuần làm vật liệu phục vụ cho chọn tạo giống ưu thế lai

1.3 Cách tiếp cận

- Tiếp cận hệ thống Đề tài đã thực hiện tuần tự các kỹ thuật từ nuôi ấy

bao phấn các đối tượng nghiên cứu, tái sinh callus, nhị bội hóa cây đơn bội , đánh giá đặc tính nông sinh học cây đơn bội kép ngoài đồng ruộng và xác định khả năng kết hợp các dòng thu nhận để phục vụ cho tạo giống lai F1 như một hệ thống các kỹ thuật đồng bộ và hoàn chỉnh

- Tiếp cận kế thừa Do nội dung nghiên cứu này trên đối tượng dưa

chuột và ớt chưa được thực hiện ở nước ta , việc tiếp thu và vận dụng các phương pháp được triển khai có kết quả ở nước ngoài thông qua các nguồn tài liệu đã giúp đề tài xác định các kỹ thuật cần thiết nhằm tạo khả năng phát sinh phôi và tái sinh cây từ bao phấn có hiệu quả

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vai trò của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng

Công tác chọn tạo giông với cây trồng tự thụ phấn trong một thời gian dài người ta yêu cầu phải có những tái tổ hợp gen mong muốn từ các nguồn đồng hợp tử khác nhau Bằng phương pháp truyền thống thường phải mất 8-10 năm

để tạo ra con lai đồng hợp tử ổn định Ở cây thụ phấn chéo thường gặp nhiều khó khăn hơn để có những dòng tự phối cường lực mạnh vì hiện tượng suy giảm do cận giao Những dòng tự phối đồng hợp tử này sẽ được lai với nhau

để tạo con lai F1 ưu thế lai Việc nghiên cứu cây đơn bội làm vật liệu nguồn

để lưỡng bội hóa chúng thành những vật liệu đồng hợp tử đã trở nên hữu dụng cho nhà chọn giống Thời gian cần thiết để tạo ra dòng vật liệu nguồn- dòng đơn bội kép ( double haploit – DH) như vậy được rút ngắn rất nhiều, khoảng 3-4 lần, tùy đối tượng cây ( Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2007) [2]

Karpachenco là người đầu tiên ngay từ năm 1929 đã chỉ ra khả năng và triển vọng của việc sử dụng đơn bội vào mục đích chon giống, vì lẽ trong bất

kỳ một quần thể nào, một tổ hợp mong muốn của các gen trong giao tử thường là cao hơn so với trong hợp tử Do đó về mặt lý thuyết sẽ thường xuyên và rất nhanh nhận được các dạng đồng hợp tử có những tổ hợp các dấu hiệu mong muốn bằng cách gấp đôi trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể ở các thể đơn bội

Để so sánh khả năng chọn giống ở mức độ đơn bội và lưỡng bội , người ta

sử dụng công thức 2n đối với các thể đơn bội và 4n đối với các thể lưỡng bội Công thức đầu tiên 2n cho phép ta xác định tất cả các tổ hợp gen có thể có về mặt lý thuyết ở mức độ đơn bội khi hình thành giao tử, còn công thức thứ hai-

4n để tính tổng số tối thiểu những cây F2 mà trong đó có thể xuất hiện tất cả các tổ hợp gen có thể về mặt lý thuyêt ở mức độ lưỡng bội Thí dụ, để nhận

được tất cả những kiểu dòng đồng hợp tử trên cơ sở tái tổ hợp 7 cặp gen độc lập thì về mặt lý thuyết cần phải có ở mức độ đơn bội 128 giao tử cái của cây lai F1 Ở mức độ lưỡng bội để đạt được chính kết quả này cần không ít hơn 16.384 cây F2 Khi tăng chỉ số n=10 thì những trị số tương ứng nêu ở trên sẽ

là 1024 và 1.048.576 Phép so sánh này đã chỉ ra rằng , hiệu quả của chọn

giống tổ hợp tăng hàng trăm lần trong trường hợp dùng phương pháp in vitro

tạo các dạng đơn bội trong quần thể để chuyển nó sang dạng DH bằng cách gấp đôi số nhiễm sắc thể đơn bội, ( Trần Duy Quý, 1997) [8]

2.2 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo cây đơn bội

2.2.1 Giới thiệu chung

Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn trong có chứa

các tiểu bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong môi trường dinh dưỡng tạo ra cây đơn bội, là một lối thoát kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng dụng cây đơn bội vào công tác chọn giống cây trồng Thông qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khó khăn trong lai xa Các dòng thuần có thể nhanh chóng được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn như sau [8],[30]:

Phôi hoá

Cây đơn bội

Tạo callus

Cây đơn bội

Nuôi cấy bao phấn trên môi

trường dinh dưỡng đặc hiệu

Một số ưu điểm của phương pháp này như sau: Kỹ thuật khá đơn giản,

ở một số loài sự phân chia tế bào dễ dàng ngay cả khi những tế bào hạt phấn chưa thực sự chín Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với môi trường nuôi cấy cao (tần suất cảm ứng môi trường cao) và có thể sản xuất thể đơn bội với số lượng lớn trong thời gian ngắn

Một số nhược điểm chính của tạo thể đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn là: Đối với một số loài nhiều cây tạo ra không phải là đơn bội Ở cây ngũ cốc, thu được cây xanh rất ít; nhiều cây bạch tạng hoặc bị thể khảm[30]

Nuôi cấy bao phấn là một phương pháp để tạo ra các dòng đồng hợp tử, trong một quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng phương pháp truyền thống[19], [39], [45] Cây đơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của nuôi cấy bao phấn, chúng có đặc điểm là đồng hợp tử tuyệt đối và được coi là nguồn vật liệu đa dạng phong phú cho chọn tạo giống [35], [38], [16] Thông qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khó khăn trong lai xa

Các dòng thuần có thể nhanh chóng được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất

Như vậy, phương pháp nuôi cấy bao phấn đã góp phần rút ngắn rất nhiều thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc và giúp giải quyết vấn đề trong lai xa Chính vì vậy mà phương pháp này đang được áp dụng rộng rãi trong chọn tạo giống cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn

Nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn cho chúng ta thấy hiệu quả của nuôi cấy bao phấn nói chung và bao phấn dưa chuột nói riêng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Điều kiện sinh lý của cây mẹ, giai đoạn phát triển của hạt phấn, biện pháp xử lý nhiệt, đặc biệt là kiểu gen của cây cho phấn và thành phần của môi trường dinh dưỡng [14], [20] [25], [29]

* Ảnh hưởng của cây cho bao phấn

Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong một loài Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một đặc điểm có khả năng di truyền [37], [41], [49]

Tác giả Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn cho thấy: trong số 85 kiểu gen của các giống được đưa vào nuôi cấy, callus chỉ được tạo ra từ bao phấn của 53 giống Sự tái sinh cây chỉ có được từ callus của 15 giống Số liệu thu được ch thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn [40]

Kiểu gen là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định ảnh hưởng đến

sự hình thành callus và tái sinh cây khi nuôi cấy bao phấn Niizeki (1983) và Haberlebos (1985) đã chỉ ra tác động có ý nghĩa của kiểu gen và mối tương tác giữa kiểu gen, môi trường đến sự hình thành callus và tái sinh cây Ngoài

ra theo một số nhà khoa học thì ngoài kiểu gen ra còn có các nhân tố tế bào chất cũng ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn (Heberlebor, 1985) [29] Tuy nhiên trong thời gian gần đây, Quimio và Zapata cho rằng: “sự hình thành callus và tái sinh cây bị điều khiển bởi các gen lặn mà không liên can gì đến các nhân tố tế bào chất”[41]

Điều kiện sinh trưởng và tình trạng sinh lý học của cây cho bao phấn cũng như mối tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường bên ngoài đều

ảnh hưởng đến phản ứng của bao phấn trong nuôi cấy in vitro Chaleff, (1982)

cho rằng: “Nhiệt độ tới hạn của cây cho bao phấn là 18oC” Hơn nữa, nếu cây sống trong điều kiện nhà lưới có nhiệt độ cao thì sự hình thành callus và tái sinh cây giảm, tỷ lệ bạch tạng sẽ tăng[18]

* Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của bao phấn

Các giai đoạn phát triển của bao phấn nuôi cấy cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng

thấp, đồng thời tỷ lệ cây bạch tạng tăng Tuy nhiên không phải bất cứ loài cây trồng nào cũng có hiệu suất tối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau một nhân, các loại hoà thảo có nhiều điểm khác nhau Theo Nizeki và Oono (1968) thì giai đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho nuôi cấy bao phấn lúa, còn theo Claphm (1971) lại cho rằng đại mạch có hiệu suất tạo cây cao nhất ở giai đoạn đơn nhân sớm Một số yếu tố khác hỗ trợ có thể gây nên sự thay đổi về giai đoạn phản ứng tối ưu, ví dụ đối với lúa giai đoạn phản ứng tối ưu là trước và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tăng từ 6 đến 9% (Chaleff ,1982) [18]

Để đạt được hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn và tạo cây đơn bội, giai đoạn phát triển của hạt phấn có ý nghĩa quan trọng Chẳng hạn đối với lúa các nhà khoa học ở Viện lúa quốc tế (IRRI) đã nghiên cứu 500 bao phấn chọn từ nhiều giống chứa hạt phấn ở các giai đoạn khác nhau, kết quả cho thấy hạt phấn ở giai đoạn từ đơn nhân giữa đến đơn nhân muộn là tốt nhất (Guzman, 2000), có nghĩa là cần lấy hoa khi khoảng cách giữa tai lá cờ và lá đối diện là 2- 4cm (Zapata, 1983)[53]

Trên cây thuốc lá Reed đã xác định được giai đoạn phát triển của bao phấn tốt nhất khi đài và tràng hoa có chiều dài tương đương nhau[42]

* Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy

Việc xử lý lạnh hay xử lý nhiệt đối với bao phấn hoặc cây cho bao phấn trước khi nuôi cấy đều có tác động đối với sự hình thành callus và tái sinh cây, nhiệt độ tối thích phụ thuộc vào từng giống

Điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng tái sinh cây cao, callus hình thành từ bao phấn được xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn bội và ít cây lưỡng bội hơn từ bao phấn không xử lý Các giống khác nhau đòi hỏi điều kiện xử lý có khác nhau, trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng có ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý Tác giả khẳng định khả năng hình thành callus tăng lên gấp đôi khi xử lý lạnh các bao phấn chứa các bào tử

ở giai đoạn giữa và cuối một nhân trong 7 -14 ngày, quá 14 ngày tỷ lệ hình thành cây xanh giảm [10]

Năm 1983 Ying đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh sớm lên hiệu quả nuôi cấy bao phấn đã cho thấy: Xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo được chứng minh ở nhiều loài như thuốc lá, cà độc dược, lúa mạch và lúa nước Tapia

và cs cũng cho là xử lý lạnh làm chậm sự lão hoá của hạt phấn, làm tăng sự phân chia của hạt phấn và giúp giải phóng những chất cần cho sự sinh sản đơn tính đực (Tapia, 2000) Sugimoto lại cho rằng xử lý lạnh làm tăng lượng axít amin tự

do và làm thay đổi tương quan giữa các axit amin tự do dẫn đến tăng tần số tái sinh cây đơn bội [43],[52]

Yamaguchi và cs (1999) nhận xét: thời gian tối ưu để xử lý lạnh tuỳ từng các giống cây trồng khác nhau Nếu xử lý ở thời gian dài thì khả năng tạo mô sẹo giảm dần, có thể do hạt phấn bị giảm sức sống do giữ lâu trong tủ lạnh Đối với lúa, Gooal và cộng sự, (1996) cho biết khi xử lý lạnh ở nhiệt độ

ôn hoà 10oC lên bao phấn trong 11 ngày đã nâng tỷ lệ tạo mô sẹo từ 12,5% lên 32,8% Ngoài ra Tang và cs cũng cho thấy, tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ tái sinh cây và tỷ lệ cây xanh phụ thuộc nhiều bởi kiểu gen của cây cho phấn [47] Như vậy việc xử lý lạnh rất có ý nghĩa trong phản ứng của bao phấn Một số phương pháp xử lý khác như xử lý ly tâm, chiếu tia gamma, xử lý trong đều kiện yếm khí tạo ra bởi nitơ phân tử hoặc áp suất nước bão hoà và với khí cacbonic ở 8oC trong 6 ngày đều có lợi cho sự hình thành callus [22]

* Ảnh hưởng của điều kiện sau khi nuôi cấy

Nhiệt độ trong phòng nuôi có ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus và tái sinh cây Nhiệt độ tối thích cho sự hình thành callus là 250C với biên độ là 25 - 280C và cho tái sinh cây là 20 - 250C Nhiệt độ cao hơn nhiệt

độ tối thích chính là nguyên nhân làm tăng cây bạch tạng Chen (1983) cho rằng nếu nhiệt độ phòng nuôi cao hơn 300C thì hầu như chỉ tái sinh cây bạch tạng Wang và cộng sự (1974) kết luận: việc hình thành cây xanh hay cây

bạch tạng chủ yếu do nhiệt độ tại thời điểm bắt đầu phát triển bào tử chứ không phải ở pha phân hoá callus, tuy nhiên quan điểm này vẫn cần phải làm sáng tỏ thêm[50]

* Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của nuôi cấy bao phấn, nhiều môi trường đã được xây dựng và sử dụng như môi trường White (1953), môi trường Miashige và Skoog (1962), môi trường Nitsch (1969), môi trường Gamborg (1968) Tuỳ theo từng đối tượng nuôi cấy khác nhau những môi trường cơ bản này sẽ được cải tiến thành nhiều môi trường khác cho phù hợp Tuy nhiên cũng có một số quy luật chung: Các cây hoà thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên Hàm lượng đường có thay đổi tuỳ đối tượng: Lúa mì 60-120g saccaroza/l, cây họ cà chỉ cần 20- 40g/l Dịch chiết khoai tây, nấm men, nước dừa, dịch thuỷ phân tỏ ra có tác dụng tốt trong nhiều môi trường nuôi cấy bao phấn [1], [42]

Mặc dù trong các bao phấn rất giàu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như auxin và giberillin nhưng số lượng và chất lượng của các hooc môn

và sự cân bằng giữa auxin – cytokinin đựơc xem là rất quan trọng để xác định phản ứng giữa bao phấn với môi trường và thay đổi sự biểu hiện di truyền Auxin cao và cytokinin thấp sẽ xúc tiến cho quá trình tăng sinh callus, ngựơc lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con Trong một vài trường hợp lại không cần thiết đến sự có mặt của auxin (Evan, 1981) [27]

Những auxin được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy bao phấn là: αNAA(naphthalene acetic acid), IAA (indone acetic acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) và CPA (p-chlorophenoxy acetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid) Trong đó, αNAA ở nồng độ 1 – 2 mg/l được coi là có hiệu quả hơn so với các auxin đơn lẻ hay kết hợp khác[18], [23]

Theo Phan Hữu Tôn (2004) để tạo mô sẹo đối với cây lúa thì auxin 2,4D ở nồng độ 2mg/l là thích hợp nhất [10] Nhưng Nguyễn Văn Uyển lại cho rằng phối hợp cả 2,4D, αNAA và Kinetin sẽ cho hiệu quả cao nhất, tỷ lệ

và các loại hoóc môn còn phụ thuộc vào từng kiểu gen[12]

Sự kết hợp khác nhau của auxin và cytokinin trên các môi trường đã được nghiên cứu rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần phải được thiết lập cho từng kiểu gen bởi vì không có môi trường đơn lẻ nào biểu hiện tốt nhất cho nhiều kiểu gen (Karim, 1987) [34]

Các chất chuyển hoá và các chất sinh trưởng khác nhau như DDT, Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose cũng được nghiên cứu, ABA và DDT được coi là ngăn cản sự phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi xanh trong nuôi cấy bao phấn lúa Trong khi đó, Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose lại tăng cường sự hình thành callus ở lúa mì và lúa nước ABA làm tăng sự tái sinh cây xanh nhưng mức tối thích lại tuỳ theo kiểu gen [48]

2.2.3 Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội in vitro trên thế giới và trong nước

* Các nghiên cứu ngoài nước

Trong nuôi cấy bao phấn tuỳ theo mỗi loại cây trồng mà thu đựơc tỷ lệ cây đơn bội và nhị bội khác nhau, trong một vài trường hợp có thể thu được cây

có mức độ bội thể cao hơn (Chu, 1982) [21] Các bao phấn dùng để nuôi cấy thường được lấy từ các cây của quần thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự đa dạng

di truyền tối đa trong quần thể những cây đơn bội được tạo thành Nhiễm sắc thể của cây đơn bội thông qua nuôi cấy hạt phấn F1, sau khi lưỡng bội hoá sẽ trở thành cây lưỡng bội thuần chủng, từ các cây này sẽ tạo thành quần thể các dòng thuần, qua đánh giá chọn lọc và cho ra giống mới [44]

Tác giả Brasiluro và cộng sự (1999) đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu giai đoạn phát triển của bao phấn và ảnh hưởng của xử lý tia gamma trên bao phấn cà chua đến sự hình thành callus Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt

phấn trong tế bào phân chia tiền kỳ I sinh ra nhiều calus nhất Bao phấn và chiều dài nụ hoa đều có ý nghĩa quan trọng liên quan đến giai đoạn phát triển bao phấn Trong thí nghiệm xử lý tia gamma, các tác giả đã xử lý hạt và nụ hoa cà chua của con lai IPA 5x Rotam4 (F2), IPA6x Rotam4 (F2) và đem cấy trên môi trường Gresshoff và Doy (1972) có bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng khác nhau Tuy nhiên, các tác giả không tìm thấy sự sai khác có ý nghĩa đến sự hình thành callus [17]

Đối với các cây trong họ bầu bí kỹ thuật nuôi cấy bao phấn để tạo cây đơn bội cũng đã được nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu và đã thu được những thành công nhất định Tuy nhiên, dòng đơn bội kép được tạo ra thông qua nuôi cấy bao phấn còn nhiều hạn chế [28], [13], [24] Những yếu tố như đặc tính di truyền, điều kiện trồng của cây mẹ, giai đoạn phát triển của tiểu bào tử, xử lý nụ hoa trước khi nuôi cấy, môi trường và điều kiện nuôi cấy

có ảnh hưởng đến kết quả của quá trình nuôi cấy bao phấn [15]

Với cây dưa hấu tác giả Xue và cộng sự (1989) cho rằng tiến hành lấy hoa khi bao phấn ở giai đoạn một nhân, có kích thước 5 mm và nụ hoa có tràng hoa nhìn rõ sẽ cho hiệu quả nuôi cấy tốt nhất Callus phát sinh trên môi trường khoáng MS có bổ sung 2mg/l BA + 2mg/l Ki + 3 saccarose + 6-7% agar ở pH 5,8 Sự phát sinh cơ quan thu được bằng nuôi cấy callus trên môi trường MS muối có bổ sung agar + 5-10 mg/l GA3 + 4mg/l BA + 30-40 mg/l adenine + 500mg/l lactalbumin hydrolysate Sự phát sinh cơ quan chuyên hoá

và sự phát triển chồi thu được trên môi trường nuôi cấy MS + 2mg/l Triaconital Rễ phát sinh trên môi trường agar + ½ MS + 0,2mg/l IBA + 1mg/l IAA + 1,5% succarose + pH 5,7 Mặc dù tần suất rất thấp nhưng họ vẫn thu được cây đơn bội và đơn bôi kép qua quá trình nuôi cấy [51]

Các nghiên cứu khác trên cây bí ngô Metwall cho thấy rằng khi nuôi cấy bao phấn cây ở giai đoạn giữa và cuối của giai đoạn hạt phấn một nhân được thu vào buổi sáng và xử lý ở nhiệt độ 40C trong 4 ngày, khử trùng nụ

hoa bằng ethanol 70% trong 2 phút và trong Clorox 20% (5,2% sodium hypochlorite) trong 20 phút cấy trên môi trường MS + 150g succarose + 5mg/l 2,4D cho tỷ lệ tạo cây cao nhất Rễ của 20 cây tạo ra được soi ở dưới

kính hiển vi cho thấy 50% số cây là lưỡng bội và 50% số cây là đơn bội [26]

Các tác giả Juhasz, Venczel, Balogh đã tạo cây đơn bội thông qua quá trình nuôi cấy noãn chưa thụ tinh của cây dưa chuột và cây bí xanh Hoa cái được thu từ cây mẹ trồng trong nhà lưới có chiều dài 2–3 cm đối với cây bí xanh và 0,5 – 1 cm đối với cây dưa chuột Cắt thành từng lát cấy vào môi trường có bổ sung 0,02 mg/1 TDZ, môi trường phát sinh phôi có chứa NAA

và BA đều có kết quả đối với cả dưa chuột và bí xanh [28]

Năm 1974 Eun và cộng sự khi nuôi cấy bao phấn dưa chuột đã phát hiện calus phát triển từ bao phấn sau khi nuôi cấy 7 ngày trên môi trường có

bổ sung 2,4 D Sau 30 ngày rễ và chồi sẽ xuất hiện[33]

Theo Lazarte, và Sasser, (1982) bao phấn dưa chuột được trên nuôi cấy môi trường Nitsch và Nitsch cải tiến sau đó tạo callus trên môi trường cơ bản

MS Phôi phát triển thành cây con trên môi trường Nitsch and Nitsch đặc có chứa 20 g/lit raffinos [36]

Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy bao phấn dưa chuột Tác giả Suprunova và Shmykova (2008) đã nuôi cấy 10 giống (Hiziz, Gordion, Hana, Melen, Kedet, Asak, Reisa, Tristan, Tarantutka và Rostovchanin) Kết quả chỉ có giống Gordion có thể tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn Trong

số những chất điều tiết sinh trưởng được nghiên cứu, thidiazuron (TDZ) là tốt nhất cho sự cảm ứng của bao phấn với nồng độ tối ưu nhất là 0,02 mg/l Dựa vào kết quả nghiên cứu các tác giả khẳng định giai đoạn phát triển tốt nhất của bao phấn

để tạo cây đơn bội là tiểu bào tử đơn nhân muộn và sớm [46]

Năm 2002, Ashok Kumar và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm trên hai giống dưa chuột Calypso và Green Long cho thấy bao phấn dưa chuột của cả hai giống đều thích hợp cho sự tái sinh phôi trực tiếp và tái sinh phôi gián tiếp

thông qua quá trình tạo callus trên môi trường cơ bản B5có bổ sung 0,25M saccarose và 2µM 2,4D hoặc kết hợp 2µM 2,4D + BAP 1µM Nụ hoa trước khi nuôi cấy đựơc xử lý lạnh 4oC trong 2 ngày là mức xử lý lạnh tối ưu Callus hình thành sau hai tuần nuôi cấy và có màu vàng Callus sau khi hình thành được chuyển sang môi trường B5 muối và vitamin có chứa 0,09M saccarose + 0,05µM NAA + 0,05µM Ki Sau đó lại được chuyển sang môi trường để phát sinh phôi là môi trường B5 muối và vitamin có chứa 0,09M saccarose và 5µM ABA Cuối cùng để phôi nảy mầm thành cây, callus lại được chuyển sang môi trường cơ bản B5 + 0,09M saccarose + 0,25 µM NAA + 0,25 µM KN Qua soi nhiễm sắc thể ở đầu rễ của 24 cây tái sinh ở mỗi giống đã phát hiện được 21 cây giống Calypso và 17 cây giống Green Long là đơn bội [13]

Tại Trung Quốc năm 2007 Song et al cũng nghiên cứu 20 kiểu gen của cây dưa chuột chỉ có 16 kiểu gen tạo được callus Tác giả đã khẳng định xử lý

nụ hoa trước khi nuôi cấy là chìa khoá của sự thành công trong nuôi cấy bao phấn Xử lý nhiệt phụ thuộc vào kiểu sinh thái, các loài dưa chuột từ vùng lạnh có phản ứng tốt khi xử lý sốc lạnh, các loài dưa chuột từ vùng nóng có phản ứng tốt khi xử lý sốc nhiệt Môi trường tốt nhất cho sự phát sinh callus

là môi trường MS có bổ sung 4,44M BA, 2,26M 2, 4-D, 4,64M KIN, 3% sucrose và 0,8% agar Môi trường cho sự phát sinh phôi là MS có bổ sung 0,54M NAA, 13,32M BA, 3% sucrose và 0,8% agar Môi trường cho sự tái sinh cây là MS bổ sung 2,22M BA, 6% sucrose và 1,2% agar[ 32]

Đối với cây ớt, trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu nuôi cấy bao phấn của nhiều dòng giống ớt khác nhau và đã thu được kết quả khác nhau:

Kim và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy bao phấn của giống Capsicum

annuum L trên môi trường MS chứa 0,1 mg/l NAA và 0,1 mg/l kinetine Bao

phấn được ủ và chịu nhiệt độ tới 310C và sự phát triển của tiểu bào tử trong bao phấn ở các giai đoạn khác nhau được quan sát hình thái tế bào học bằng

việc sử dụng chất DAPI ớt có đặc điểm là hạt phấn phát triển rất không đồng đều trong bao phấn đơn Tỷ lệ hạt phấn ở các giai đoạn khác nhau thay đổi theo các giai đoạn nuôi cấy và tỷ lệ hạt phấn chết tăng mạnh từ ngày thứ hai sau nuôi cấy Kết quả cho thấy giai đoạn hạt phấn thích hợp nhất cho sự phát triển phôi có chứa tỷ lệ lớn (75%) hạt phấn ở đầu giai đoạn hai nhân [30]

Tác giả Gonzalez - Garcia, Juvencio (2004) cũng nuôi cấy hạt phấn ớt

của sáu mươi cặp lai giữa loài phụ Veracruzano và giống địa phương nhằm

theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của tiểu bào tử Thí nghiệm được tiến hành khi hạt phấn ở giai đoạn đơn nhân giữa tới giai đoạn hai nhân và nuôi cấy trên môi trưòng MS gồm 6% đưòng, 0,7% agar, pH là 5,7 có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau như 2,4D, IBA, IAA Kết quả cho thấy, hiệu quả của nuôi cấy bao phấn phụ thuộc rất lớn vào kiểu gen của cây cho phấn Sự phát sinh phôi từ tiểu bào tử tốt nhất trên môi trường chứa 0.3mg/l

BA và 2 mg/l IAA [31]

Kết quả nghiên cứu nuôi cấy bao phấn của 4 cặp lai F1 và 13 dòng giống của ớt ngọt và ớt cay của tác giả Qin, Rotino (2002) lại cho rằng sự phát sinh phôi chỉ xuất hiện trên môi trường chứa 0,5 mg/l 6-BAP Có tổng số

268 phôi thu được từ 2937 bao phấn và cây đơn bội và nhị bội có tỷ lệ tương đương nhau [32]

* Các nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, công nghệ đơn bội được ứng dụng với hai mục đích chính:

- Cố định ưu thế lai thông qua việc rút ngắn thời gian tạo giống thuần chủng bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn con lai F1

- Tạo dòng thuần có những đặc tính thích nghi với thụ phấn chéo và mang gen kết hợp rộng

Sau năm 1975, nuôi cấy tế bào được phát triển, phương pháp nuôi cấy bao phấn cũng được nghiên cứu Các kết quả đầu tiên nuôi cấy thành công bao phấn lúa được Lê Thị Muội công bố năm 1978 (Nguyễn Đức Thành, 2000) [9]

Khi nghiên cứu vật liệu ban đầu cho nuôi cấy tạo cây đơn bội, tác giả Nguyễn Đức Thành (2000) cho thấy vật liệu ban đầu cho nuôi cấy có thể là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời Sử dụng bao phấn để nuôi cấy đơn giản hơn

về mặt kỹ thuật và môi trường nuôi cấy nhưng mô và cây có thể tạo thành từ

mô soma của thành bao phấn và như vậy rất khó phân biệt với cây tự lưỡng bội bắt nguồn từ hạt phấn Tuy nhiên thành bao phấn lại có vai trò quan trọng trong sự phát triển của hạt phấn Hạt phấn được khởi đầu phân chia trong bao phấn và chỉ những hạt phấn được khởi đầu phân chia mới tiếp tục phát triển Thành bao phấn cung cấp một số chất dinh dưỡng chủ yếu cho tế bào hạt phấn và đóng vai trò như bể chứa chất trao đổi cho hạt phấn hấp thu, dự trữ và biến đổi các chất từ môi trường nuôi cấy Đối với hạt phấn tách rời sẽ rất khó khăn để nuôi cấy và môi trường nuôi cấy cần giàu dinh dưỡng hơn Sự ổn định pH là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào vì vậy pH môi trường cũng cần được quan tâm Sự bền vững và hấp thu nhiều chất phụ thuộc vào

pH môi trường như αNAA, giberelin, vitamin, sắt, pH thường là 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng, pH mức cao hơn làm hầu hết các muối trong môi trường

có khuynh hướng kết tủa[9]

Năm 2007 Nguyễn Thị Hiệp cho rằng các giống lúa thuộc loài phụ

Japonica có tỷ lệ tạo callus cao hơn các giống lúa thuộc loài phụ Indica Xử

lý đòng ở nhịêt độ 7oC trong 7 ngày cho hiệu quả tạo callus cao nhất và môi trường tái sinh cây thích hợp cho nhiều kiểu gen là MS + 1mg/l Kinetin + 1mg/l αNAA + 1mg/l BAP [5]

Khi nuôi cấy bao phấn của các dòng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với môi trường tác giả Nguyễn Thị Hồng Hạnh kết luận điều kiện ngoại cảnh của cây cho bao phấn ( ánh sáng, nhiệt độ, chế độ dinh dưỡng ) và đặc biệt là yếu tố mùa

vụ có ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ tạo callus và tái sinh cây của các dòng EGMS Nuôi cấy các dòng lúa EGMS khi hạt phấn ở trạng thái hữu dục sẽ đem lại hiệu quả cao hơn nhiều so với nuôi cấy ở thời điểm hạt phấn bất dục [4]

Trên cây dưa hấu Nguyễn Thị Thanh Dung khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy bao phấn của các giống dưa hấu (Hắc Mỹ Nhân, Siêu Nhân 0110, SG 221) cho biết xử lý nụ hoa ở nhiệt độ 7oC trong 1 ngày và cấy trên môi trường B5 có bổ sung 1mg/l Ki + 1mg/l 2,4D + 3% Saccarose cho tỷ lệ tái sinh callus cao nhất [3]

Trong chọn tạo giống dưa chuột bằng phương pháp truyền thống, để tạo được dòng thuần cho việc thử khả năng kết hợp chung và kết hợp riêng phải mất từ 7- 8 thế hệ (3- 4 năm), mất rất nhiều thời gian và kinh phí, đồng thời kéo dài thời gian cho công tác chọn tạo giống Bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn dưa chuột sẽ khắc phục nhược điểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống Cây đơn bội kép tạo ra từ nuôi cấy hạt phấn có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hoàn toàn không phân ly trong các thế hệ sau và có thể tạo ra được trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết kiệm được rất nhiều kinh phí và đặc biệt rút ngắn thời gian cho công tác chọn tạo giống dưa chuột

Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật đơn bội phục vụ công tác tạo dòng thuần trong chọn tạo giống cây trồng vẫn còn nhiều hạn chế Hiện nay, kỹ thuật này mới chỉ ứng dụng được một phần rất nhỏ trong chọn tạo lúa, ngô còn các đối tượng cây trồng khác chưa được nghiên cứu nhiều Vì vậy, việc nghiên cứu nuôi cây bao phấn đối với nhiều loại cây trồng nhằm rút ngắn thời gian tạo giống là rất cần thiết Đặc biệt là trong công cuộc chuyển đổi cơ cấu cây trồng, để phát triển ngành nông nghiệp cần phát triển ngành công nghiệp chế biến, đẩy mạnh xuất khẩu, vấn đề rút ngắn thời gian tạo dòng thuần phục

vụ công tác chọn tạo giống cần được quan tâm nhiều hơn nữa

2.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống dưa chuột, ớt cay ở nước ta

2.3.1 Chọn giống dưa chuột

Nghiên cứu chọn tạo giống dưa chuột trong nước được bắt đầu từ những năm 70 của thế kỷ trước Ở thời gian đầu, công tác nghiên cứu mới chỉ tập trung nhập nội, đánh giá tính thích ứng của các giống được nhập nội từ

nước ngoài và phục tráng cải thiện các giống địa phương Trong những năm gần đây, công tác chọn tạo giống dưa chuột lai F1ở nước ta cũng mới được bắt đầu nghiên cứu

Theo hướng nhập nội, đánh giá tính thích ứng của các giống nhập nội

từ nước ngoài, các công ty giống: Đông Tây,Hoa Sen, Trang Nông và Công ty giống cây trồng Miền Nam đã nhập nội và khảo nghiệm và đánh giá thành công tính thích ứng của một số giống dưa chuột lai F1 như: Happy 14, DN-3, DN-6 có nguồn gốc từ Đài Loan cho năng suất và chất lượng cao Trong thời gian 1998-2003, tác giả Đoàn Ngọc Lân đã nghiên cứu đánh giá, tuyển chọn

và hoàn thiện quy trình kỹ thuật đưa ra sản xuất đại tràgiống dưa chuột 266 phục vụ chế biến muối mặn Giống có thời gian sinh trưởng ngắn 78-82 ngày (vụ xuân) và 85-90 ngày (vụ đông) Năng suất đại trà đạt 50-70 tấn/ha Mức

độ nhiễm bệnh sương mai thấp ở tất cả các thời vụ

Tại Viện Nghiên cứu Rau quả đã tiến hành khảo nghiệm các giống dưa chuột bao tử Marinda, Levina, kết quả đã đưa được giống dưa chuột Marinda vào sản xuất và hiện nay là giống có thế mạnh nhất trong sản xuất dưa chuột phục vụ chế biến xuất khẩu Trong chương trình hợp tác với Trung tâm Rau màu châu Á (nay là Trung tâm Rau thế giới), Viện Nghiên cứu đã nhập nội được một số lượng lớn các mẫu giống dưa chuột từ Thái Lan, Đài Loan, được đưa vào đánh giá phát hiện các tính trạng tốt, phù hợp sử dụng cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống dưa chuột của Viện

Theo hướng phục tráng các giống dưa chuột địa phương, trong đề tài giống chọn tạo giống rau cấp Bộ giai đoạn 2001-2005, Viện Nghiên cứu Rau quả đã phục tráng thành công giống dưa chuột Phú Thịnh, là giống đã được trồng cho chế biến đóng lọ từ nhiều năm nay ở phía Bắc, nhưng do quá trình thụ phấn tự do đã bị thoái hoá Giống dưa chuột Phú Thịnh đã được Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận giống tiến bộ kỹ thuật năm 2004

Theo hướng chọn tạo các giống dưa chuột lai F1, năm 2004, tác giả Nguyễn Tấn Hinh và cộng sự đã đánh giá các tổ hợp lai khác nhau và xác định được giống dưa chuột lai PC4 từ tổ hợp DL7 x TL15 có thời gian chín sớm, thuhoạch quả kéo dài 40 - 45 ngày, tổng thời gian sinh trưởng từ 85 - 90 ngày Năng suất có thể đạt từ 1,34 - 1,54 kg/cây (tương đương 45 - 47 tấn/ha),

số lượng quả trung bình/cây đạt 6,5 (vụ thu đông) và 7,2 quả (vụ xuân hè), khối lượng trung bình quả đạt 200 - 220 g Đây là giống có thể trồng được cả 2 vụ xuân hè và thu đông

Tại các tỉnh phía Nam, với lợi thế về nguồn vật liệu khởi đầu được nhập nội từ nước ngoài rất phong phú, các công ty giống: Đông Tây, giống Cây trồng miền Nam, Nông Hữu…đã chọn tạo thành công và đưa ra sản xuất nhiều giống dưa chuột lai F1 Các giống phổ biến ở phía Nam do các công ty trên tạo ra là CuC23, CuC39, CuC134(công ty Cổ phần Giống cây trồng miền Nam), Mỹ xanh, F1702, F1124 (công ty Đông Tây), Xuân Yến, Quần Yến, Cẩm Mỹ, Thái Lộc (công ty Nông Hữu) Tuy nhiên, do tính chất cạnh tranh nên các nghiên cứu chọn tạo giống ít được công bố

Theo hướng chọn tạo các giống dưa chuột lai F1, trong các giai đoạn

2001 - 2005 và 2006 - 2010, Viện Nghiên cứu Rau quả đã chọn tạo thành công một số giống mới và đưa vào phổ biến rộng rãi trong sản xuất Năm

2006, từ các tổ hợp lai giữa các giống dưa chuột nhập nội và các giống dưa chuột địa phương, tác giả Phạm Mỹ Linh và cộng sự đã chọn tạo thành công 2 giống dưa chuột lai F1 CV5 và CV11, trong đó giống CV5 đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống chính thức và giống CV11 được công nhận là giống cho sản xuất thử Giống dưa chuột lai F1 CV5 thuộc nhóm giống sử dụng cho ăn tươi, có năng suất đạt 45 - 48 tấn/ha, trồng được

cả trong vụ xuân hè và vụ đông, thời gian sinh trưởng ngắn 75-85 ngày tùy từng thời vụ Mức độ nhiễm bệnh sương mai nhẹ và không nhiễm bệnh phấn trắng Hiện nay giống dưa chuột CV5 đang được trồng được phổ biến ở các tỉnh Hưng Yên, Phú Thọ, Thanh Hóa, Hà Nội …

Trong đề tài nghiên cứu cấp Bộ: “nghiên cứu chọn tạo giống, xây dựng

quy trình kỹ thuật sản xuất tiên tiến cho một số loại rau chủ lực (Cà chua,

D-ưa chuột, DD-ưa hấu,Mướp đắng, ớt) phục vụ nội tiêu và xuất khẩu”, giai đoạn

2006 - 2010, tác giả Trần Khắc Thi và cộng sự đã chọn tạo thành công một số dòng dưa chuột đơn tính cái Từ các dòng đơn tính cái này, nhóm tác giả đã chọn tạo thành công hai giống dưa chuột lai F1 CV29 và CV209 Các giống dưa chuột lai F1 này đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống cho sản xuất thử Giống dưa chuột CV29 có một số đặc điểm chính là: quả dài, gai trắng, quả màu xanh đậm có thể dùng để ăn tươi và chế biến muối mặn năng suất đạt 40-45 tấn/ha Đặc điểm chính của giống CV209

là quả nhỏ phục vụ chế biến muối chua, đóng hộp, năng suất 25-28 tấn/ha Hiện nay giống dưa chuột CV29 được trồng nhiều tại Hà Nam, Bắc Ninh, Hà Nội; giống CV209 được tập trung nhiều tại tỉnh Hưng Yên

Như vậy, với thời gian nghiên cứu chọn tạo giống dưa chuột chưa nhiều, kết quả đạt được mới là những kết quả ban đầu, nhưng đến nay, Viện Nghiên cứu Rau quả đã thu thập và tạo mới được hàng trăm mẫu giống dưa chuột với các tính trạng quý, hàng nghìn dòng tự phối dưa chuột các loại: dưa chuột quả nhỏ, dưa chuột ăn tươi, dưa chuột quả dài chế biến muối mặn, dưa chuột đơn tính cái, dưa chuột ưu thế hoa cái đây là nguồn vật liệu quý phục vụ công tác lai tạo giống sau này

2.3.2 Chọn giống ớt cay

Nghiên cứu về ớt ở Việt Nam còn hạn chế, chủ yếu là Viện nghiên cứu Rau quả, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp và một số trường Đại học: như Đại học Nông nghiệp I, Đại học Nông lâm Huế… Tập trung ở lĩnh vực chọn tạo giống, đặc biệt là công tác thu thập và đánh giá tập đoàn các mẫu giống

nhập nội

Những năm gần đây ở Việt Nam, các nhà chọn tạo giống ớt đã đạt được một số kết quả đáng khả quan Song cơ cấu giống ớt của nước ta chưa

phong phú, nhất là các giống dùng cho chế biến, xuất khẩu còn quá ít, không

đủ cho nhu cầu sản xuất với qui mô lớn, hơn nữa khả năng chống chịu sâu bệnh kém nên đã làm giảm đi số lượng và chất lượng các giống ớt Việc nhập nội các giống mới, giống lai từ nước ngoài có năng suất, chất lượng tốt vẫn đang là phương thức chủ yếu để đáp ứng nhu cầu về cơ cấu giống phù hợp với từng vùng sinh thái và mục đích sử dụng, mặt khác các giống ớt với phương thức nhập nội lại có giá thành tương đối cao và không chủ động về giống, do đó công tác chọn tạo giống ớt có chất lượng, phù hợp với điều kiện trong nước đang ngày càng trở nên cấp bách

Với phương pháp chọn tạo giống truyền thống, để tạo được dòng thuần cho việc thử khả năng kết hợp chung và kết hợp riêng phải mất từ 4-5 thế hệ (2-3 năm), dẫn đến kéo dài thời gian cho công tác chọn tạo giống, gây tốn kém kinh phí và sức lao động Nhưng với phương pháp nuôi cấy bao phấn ớt tạo cây đơn bội kép sẽ khắc phục nhược điểm của phương pháp trên Cây đơn bội kép tạo ra từ nuôi cấy hạt phấn có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hoàn toàn không phân ly trong các thế hệ sau và có thể tạo ra được trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết kiệm được rất nhiều công sức, tiền của và đặc biệt rút ngắn thời gian cho công tác chọn tạo giống ớt

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bảng 3.1: Đặc điểm của một số giống dưa chuột lai F1 được chọn làm

guồn vật liệu cung cấp hoa để lấy bao phấn nuôi cấy

1 Mijabel Hà Lan Là giống dưa chuột > 85%% hoa cái, quả

dạng trung tử màu xanh đậm, quả có gai màu trắng mật độ gai dày, khối lượng trung bình quả 9-11 gram Chiều dài quả 5-7 cm Thích hợp cho chế biến muối chua đóng hộp

Cây sinh trưởng khỏe Năng suất trung bình đạt 10-15 tấn/ha, có thể trồng được 2 vụ/năm

2 Ajax Hà Lan Giống dưa chuột > 85% hoa cái, quả dạng

trung tử màu xanh đậm, quả có gai màu trắng mật độ gai dày, khối lượng trung bình quả 9-

11 gram Chiều dài quả 5-7 cm Thích hợp cho chế biến muối chua đóng hộp

Cây sinh trưởng khỏe Năng suất trung bình đạt 10-15 tấn/ha, có thể trồng được 2 vụ/năm

3 Marinda Hà Lan Là giống dưa chuột bao tử 100% hoa cái Cây

sinh trưởng khoẻ, hoa cái chùm, ra hoa sau trồng 30-35 ngày Thời gian sinh trưởng 75-

80 ngày Năng suất 21-23 tấn/ha

Bảng 3.2 Đặc điểm của một số giống ớt lai F1 được chọn làm nguồn vật

liệu cung cấp hoa để lấy bao phấn nuôi cấy

- Năng suất >25 tấn/ha

- Các dòng dưa chuột thu được từ 6 cây đơn bội kép trong vụ đông 2009

- Đối chứng: giống dưa chuột Ajax – giống gốc

- Các dòng ớt đơn bội kép được tạo ra từ kỹ thuật nuôi cấy bao phấn

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn được tiến hành trong phòng thí nghiệmBộ môn công nghệ sinh học tại Viện Nghiên cứu Rau quả và phòng thí nghiệm của Trung Tâm thực nghiệm sinh học Nông nghiệp công nghệ cao – Viện Di truyền Nông nghiệp

- Các cây đơn bội kép sau nuôi cấy được trồng và đánh giá trong khu nhà lưới Bộ môn Rau gia vị tại Viện Nghiên cứu Rau quả

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tạo dòng đơn bội kép (dưa chuột, ớt)

- Thực hiện năm 2007 – 2008 tại Viện Nghiên cứu Rau quả và Viện di truyền Nông nghiệp

3.2.1.1 Trên cây dưa chuột

* Thí nghiệm1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng cơ bản đến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn cây dưa chuột

CT1 Môi trường Murashige Skoog (1962) MS

CT2 Môi trường Chu và cộng sự(1975) N6 CT3 Môi trường Gamborg (1968) B5

* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo callus từ bao phấn cây dưa chuột

*Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến hiệu quả

tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột

CT1 5 - 9 mm CT2 10 - 15 mm CT3 16 - 20 mm

*Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ xử lý lạnh nụ

hoa đến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột

* Thí nghiệm 5 : Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo callus từ

bao phấn cây dưa chuột

* Thí nghiệm 6,7 : Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp(2,4D+ BA;, 2,4D + kinetin ) đến khả năng tạo callus từ bao phấn cây dưa chuột

CTTN 2,4D (mg/lít) Nồng độ

Nồng độ BAP, Kinetin

CT1 0 MS + 1,5mg2,4D (Đ/C)

CT2 0,5 MS + 1,5mg2,4D + 0,5mg (BAP,Ki) CT3 1,0 MS + 1,5mg2,4D + 1,0mg (BAP,Ki) CT4 1,5 MS + 1,5mg2,4D + 1,5mg (BAP,Ki) CT5

* Thí nghiệm 9 : Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP trong môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột

* Thí nghiệm 10 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP + TDZ đến khả

năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột

CT5

0,02

2,0 0,02 TDZ+2,0 BAP CT6 0,5 0,03 TDZ+0,5 BAP

*Thí nghiệm 11,12: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP,Kinetin và tổ hợp BAP +

IAA, BAP + αNAA đến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội in vitro

* Thí nghiệm 13:Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP + IAA đến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội in vitro

1,0

0,3 1,0 BAP + 0,3 IAA CT5 0,1 1,5 BAP + 0,1 IAA CT6 0,2 1,5 BAP + 0,2 IAA CT7

1,5

0,3 1,5 BAP + 0,3 IAA CT8 0,1 2,0 BAP + 0,1 IAA CT9 0,2 2,0 BAP + 0,2 IAA CT10

1,0

0,3 1,0 BAP + 0,3 αNAA CT5 0,1 1,5 BAP + 0,1 αNAA CT6 0,2 1,5 BAP + 0,2 αNAA CT7

1,5

0,3 1,5 BAP + 0,3 αNAA CT8 0,1 2,0 BAP + 0,1 αNAA CT9 0,2 2,0 BAP + 0,2 αNAA CT10

2,0

0,3 2,0 BAP + 0,3 αNAA

*Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men, casein đến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột

CTTN Hàm lượng cao nấm men

*Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý

Cholcine đến khả năng nhị bội hoá dòng đơn bội của cây dưa chuột

0,5

*Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số auxin đến sự ra rễ của chồi

cây dưa chuột nhị bội

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng cơ bản

đến khả năng tạo callus của bao phấn cây ớt

CT1 Môi trường Muashige Skoog (1962) MS

CT2 Môi trường Chu và Cs (1975) N6

CT3 Môi trường Gamborg (1968) B5

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến hiệu quả tạo

callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn ớt

hoa

CT1 3 - 4 mm CT2 5 - 6 mm CT3 7 - 8 mm

Thí nghiệm 3 : Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ xử lý lạnh nụ

hoa đến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn cây ớt