Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập, định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh vi khuẩn và đánh giá khả năng đối kháng của một số vi sinh vật có ích

TÓM TẮTĐề tài “Phân lập, định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héoxanh vi khuẩn và đánh giá khả năng đối kháng của một số vi sinh vật có ích” thực hiện tại phòng thí nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HOC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

Fe 2s 3k 2s 2 2k sk

KHOA LUAN TOT NGHIEP

PHAN LAP, DINH DANH VI KHUAN Ralstonia solanacearum

GAY BENH HEO XANH VI KHUAN VA DANH GIA

KHA NANG DOI KHANG CUA MOT SO

VI SINH VAT CO ÍCH

SINH VIÊN THUC HIỆN : LAM THANH GIANG

NGANH : BAO VE THUC VAT

KHOA : 2018 -2022

Thành phố Hồ Chí Minh, thang 11/ 2022

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VI KHUẨN Ralstonia solanacearum

GÂY BỆNH HÉO XANH VI KHUAN VÀ ĐÁNH GIÁ

KHẢ NĂNG DOI KHANG CUA MỘT SO

VI SINH VAT CÓ ICH

Tác giả

LAM THANH GIANG

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự cô gắng và nỗ

lực của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm, ủng hộ và động viên từ quý thầy cô,gia đình và bạn bè giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt và đúng tiến độ

đề tài tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Võ Thị Ngọc Hà đã tận tình hướngdẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, cũng như luôn quan tâm,

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận Cô là người truyền

cảm hứng giúp tôi có niềm đam mê với nghiên cứu và làm việc khoa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Kim Huyền đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡtôi khi thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, giúp đỡ, ủng hộ cả vềmặt vật chất lẫn tinh thần tao mọi điều kiện dé tôi được học tập Gia đình luôn là

nguồn động lực to lớn giúp tôi cố gắng từng ngày và thực hiện ước mơ của mình

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị và các bạn sinh viên nghiên cứu ở phòng thí

nghiệm Bệnh cây thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật - Khoa Nông học trường Đại học

Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn Nguyễn Trọng Nhân, Trần Phước Sang, Trần

Thị Lan Anh, Võ Nhật Duy, Đặng Thị Huỳnh Như và Trương Thị Ngọc Hân đã tận tình

giúp đỡ, ủng hộ, quan tâm, chăm sóc, động viên và chia sẽ niềm vui, nỗi buôn với tôi

Cuối lời, kính chúc tất cả mọi người nhiều sức khỏe, may mắn, hạnh phúc và

gặp nhiều thành công

Xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chi Minh, tháng 11 năm 2022

Sinh viên

Lâm Thanh Giang

il

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập, định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héoxanh vi khuẩn và đánh giá khả năng đối kháng của một số vi sinh vật có ích” thực

hiện tại phòng thí nghiệm Bệnh cây Bộ môn Bảo vệ Thực vật - khoa Nông học, trường

Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 5/2022 đến tháng 11/2022 Mục tiêu

nghiên cứu là xác định biovar của vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héoxanh trên cây họ cà tại khu vực Đông Nam Bộ và Tây Nguyên, đánh giá khả năng đối

kháng của một sô vi sinh vat có ich.

Đề tài thực hiện 2 nội dung: (1) Phân lập, định danh và xác định biovar vi

khuẩn Ralstonia solanacearum (2) Phân lập, định danh và đánh giá khả năng đối

kháng của một số vi sinh vật có ích với vi khuẩn R solanacearum Vi khuân Ralstoniasolanacearum được phan lập trên môi trường TZCA với đặc trưng khuẩn lạc có tính

nhay, màu trang ngà, ria mép nhẫn, ở giữa có màu phot hồng Khả năng chuyên hóa

carbon được xác định với 3 loại đường và 3 loại rượu Vi khuẩn đối kháng thực hiệnbằng phương pháp khuếch tán giếng thạch theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tó,

3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại của 1 nghiệm thức là một đĩa petri

Đề tài phân lập được 30 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum có khuẩn lạcmàu trắng ngà, có nhân hồng trên môi trường TZCA, tế bào vi khuan có hình que và đều

là Gram âm đều thuộc biovar 3 Đánh giá khả năng gây bệnh cho thấy dòng CHA1 cókhả năng gây bệnh cao nhất và được dùng trong thí nghiệm đánh giá khả năng đối khángcủa các vi sinh vật Phân lập được 25 dòng vi khuẩn từ các mẫu đất Trong đó có 8 dòngĐHA2, DKaD1 thuộc chi #z/erobacferia; ĐHA3, DQL1, DQL2, ĐXTI thuộc chiPseudomonas sp.; ĐKaÐ2 thuộc chi Bacillus sp và ĐHAI đều có khả năng đối kháng

với R solanacearum, 2 dòng ĐKaÐ2 và DHA3 có tính kháng mạnh với đường kính vòng

vô khuẩn là 14,73 mm và 12,45 mm

MỤC LỤC

Trang

SAT VY w-ssscsxrctssl2L334325153200302/36220601313538:B742/1)12220020135//6060-E242ĐZ39E05322813:BiSbS430342/483022313EE/6L3010230gã⁄2402nGE12ia2/ 1 IUNv u 0 ul

Tt Perea eee RIA AREA EEL ERESRE iiiMUG ỮÔlbetrniennitiloiirbieigtiTIGINEEGGNSIIGNGLGEBIRGHHUNNSSESANTUEGBEINERBUHSRGHGEDNSHISNiNBSa8 N0 0gmasesdl ivTosi ti RE TITẾT, se sxoonoeesosedtodfuuoskrodiigipttrouoduit<DvErdrlti00380gu030 950 i.ndE2mu020893ggL6e Vil

Dai SACH CAC BAN se snes: sssca0se sense snaneens ssw eneuseenasearaaea 5818343188 53058S8:g645ã616338gi80008838 100343440208 vill Dan sach cdc With 0 1X

0 T T c c cv Ác cố cơ 1

MUC tiOU 0 2

Yêu cÂU 2-52-5221 2222122122121122121121122121111211211111111111111111111111111111 211cc 2Giới hạn đề tài - - 5S 1 1E 3 1521212112121112111112111112111121 1112211211112 cee 2Chương] TÔ GAIN TẤT LTD nseeenaeerinndesoroiornuogogigsaigoigeogaogasse 31.1 Tổng quan về cây họ cà 2- 22 222222222122222212211211271211221 2112112212111 1c xe 3DLT Tổng tịdñ về đầu Dee IẪU, ca cán Ho 2.004 0 022.0,cn2020000210001807 010012000 31.1.2 Tổng quan về cây cả chua 52-55¿22212212232212212121121121121211211212121 21 Xe 41.2 Bénh héo xamnh trén cay O v1 51.2.1 Phân bó, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra 2: 2225525222: 51.2.3 So lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum cccccccccecsscessesesesvesesveseseseeseseeeveeees 61.2.4 Sự phan chia vi khuan Ralstonia solanacearum theo đặc tinh gay hại 61.2.5 Triệu chứng gây hai của vi khuân Ralstonia solana€€@f'MH -2 - 9123,6 Fiầu điểm ihä†.sinh: phối: triển ĐH «cssessasikiobkidakeibdiidedidiieslg1885003810nu1ai136 9

1.2.7 Biện pháp phòng We cseescnoeoibietiexstitg01145556151683658046580151153580Gã85ESGx94L5003013036814048E 10

1.3 Tổng quan về vi sinh vật đối kháng và cơ chế đối kháng - 101.3.1 Vi simh vat 0i an 101.3.2 Vai trò vi khuân đối kháng -2 2-22 ©2222222EE22EE222312231221122312212223222 xe ll

1.3.3 Cơ chế đối kháng của vi sinh vật -2 2- 252 SE22E+2E2EE2EE22E22E221223223222222e2 11

1.3.4 Nghiên cứu vi sinh vat đối kháng trong nước: -2 -+22z+22++2sz+22+z 12

1.3.5 Nghiễn cứu vi sinh vật ngOal TỚC-:¿csccsssssscc560140463566462305586230332s0.0506850888020-3053 13

Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHAP THÍ NGHIỆM - 15

2.1 NOt dung nghiGn 0 15

2.2 Thời gian và dia điểm nghiên cứu -.- 2 -2+222222+2E22EE22EEE22E2272227222222222xee 15

2.3 Vat li@u thi nghi6m 1 15

2.3.1 Đối tượng thí nghiệm 2-22 ©22S22E£2E22E2E2E121123121221121221121121121121222.22e2 15

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị TH TH naneenindtstisnginnolisugogtgsosdoigggSS'GSBSHERESSUEBGENHiETUIODBSLEG.HEDHGIIS.03.47201090E8E 16

5.5.3 Thánh phần riổÏ PHƯỜNG, c cac HH HH 30.0.17202C4.0.Z07180167-2022200172Xi l62.4.Phương pháp ñighiện GỮU ‹:.‹sos-sesseosesisisobii0icg180 0 100406545381500681530141353 1155 L65590334868855i 162.4.1 Phân lập và định danh vi khuân Ralstonia solanacearum gây bệnh trên cây họ cà 162.4.2 Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất -2- 2552 222.4.3 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập với vi khuan

Ẳ711/7//-812/2/12( 3.22171700000088 23

2.4.4 Định danh mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất -2 -2-©22+22++2zzzc5zze: 221.5 Piano 19 gỗ HB wicesacusnimeanuennnuonnnanngenmnmramennmenearmalnnis 28Chương 3 KET QUA VA THẢO LUẬN 55-52222222222222222Ezrxerrrrrrres 293.1 Kết quả phan lập va xác định vi khuan Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh

Ihg 23797290) 01417200808 nnn enn einen einen 29

3.1.1 Kết qua phan lập vi khuân gây bệnh eesseeseesseeseeseeseestessessneesess 293.1.2 Kết quả định danh vi khuẩn thông qua môi trường TZCA . - 303.1.3 Kết quả đánh giá độc tính của các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum đã

phân lập được trong phòng thí nghiệm - - - 5 22+ * SE £*E£+£+E£vEesEererrerrrrrkrre 31

3.1.4 Kết qua định danh vi khuan gây bệnh héo xanh trên cây ho ca bang đặc điểm

3.1.5 Kết qua định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ ca bang các phản ứng

SINH, HO Äseesessesssssi1008010163190135536010gG08500143391885533405038080018044 388E54S15558861G0340833883G001388000800586 34

3.2 Kết quả phan lập vi khuẩn đối kháng trong đất . 2-c52555+5csscs-cs 3/7

3.3 Kết quả khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập được trong dat đối với

vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm 373.4 Kết quả định danh sơ bộ vi khuẩn có ích -2- 22s22szzszzszzszzssrsscsscse- - 303.4.1 Kết quả định danh vi khuẩn có ich theo đặc điểm hình thái - 393.4.2 Kết quả định danh vi khuẩn có ích bằng đặc điểm hình thái va các phản ứng sinh

Mau phan lập

Ngày sau cay

Nghiệm thức Potato Glucose Agar Sucrose Peptone Agar

Tetrazolium Chloride Agar

Vi sinh vat

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 1.1 Các đặc tinh sinh hóa của 5 biovar vi khuẩn Ralstonia solanacearum 8

Bang 2.1 Xác định biovar vào phan ứng sinh hóa - 5 55+ 2+<£++++eezeeseresees 22

Bảng 3.1 Kết qua phân lập 30 dòng vi khuan Ralstonia solanacearuim - 29

Bang 3.2 Kết quả khuẩn lạc trên môi trường TZCA 2 2:5225225225222z55+2 30

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh cây ca chua khi chủng các dòng vi khuẩn R solanacearum

ssa SMEs RU SIS Sec STRATOS a RGU WA EATS 463016058 RN UE TS STR NA RARER REEMA 31

Bang 3.4 Kết qua thử nghiệm biovar đối với 30 dong vi khuẩn R solanacearum 35Bang 3.5 Các dòng vi khuẩn phân lập được trong đất -2- 52 ©5z2cz+c+z 37Bang 3.6 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn trong đất với vikhuan Ralstonia solanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm 38

Bang 3.7 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường LB - -: 5-55: 39

Bang 3.8 Kết quả định danh vi khuẩn bằng đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Bệnh héo xanh trên cây họ cà 5-52-2222 3222221221121 .1eexee 17

Hình 2.2 Bồ trí vi sinh vật đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đĩa petribằng phương pháp cấy khuếch tán giếng thạch 2-22 2222222E£222+z2zzzzzzze 24

Hình 3.1 Kết quả chủng Koch các dòng vi khuẩn trên cây cà chua -. 33

Hình 3.2 Phản ứng nhuộm gram âim 2 2+ 22+ E**ES 3E ErEExrkerrrrrrrkrrrerrvre 34 Hình 3.3 Phản ứng dung dịch KOH 3% kéo SỢI 5 + 2S2£S+2£ssesererrerrrrrrrs 34

Hình 3.4 Phản ứng của các dòng vi khuẩn trên ba loại đường và ba loại rượu sau 5

pe EÍ TangeorntiortitoirptttgGEELERIEGTEEIEENEERIGESSESERENEEHSE rao 36Hình 3.5 Kết quả khuếch tán giếng thạch -22©2252222222zszssrserszrrsrsc-sc 30Hình 3.6 Đặc điểm các dong khuẩn lạc có Ích ¿c2 x2 40

Hình.3.7 Phan ứng thứ đứng dich KOH 3 isc scnassasaus saesacsssssnsasaceceneseawexaxesexensonscostan: 40

Hình 3.8 Kết quả nhuộm Gram vi khuan dưới thấu kính 100X oo cece 42Hình 3.9 Kết quả nhuộm nội bảo tite ceccccecccssecsecseesessessessecseesessessessessessesseseesseeseaes 43Hình 3.10 Vi khuẩn phát triển trong điều kiện ky khí 2-22 55222zz25z22zz>+2 43Hình 3.11 Kết qua phản ứng với Catalase - 2-2 22222+2E2EE2EE2EE+Exrrxrzrrrrev 44Hình 3.12 Kết qua phan ứng Oxidase 2222 22222222E22E22EE22E22E222222122222e2Ercrev 44

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Cây cà chua (Licopersicum esculentum) và cây khoai tây (Solanum tuberosum)

là các loại cây trồng thuộc họ ca (Solanaceae), giữ một vi trí quan trọng trong sản xuấtnông sản ở nước ta, là loại cây trồng thu lấy quả và củ, mang lại giá trị dinh dưỡng vàgiá trị kinh tế cao Tại Việt Nam, mặc dù có nhiều lợi thế và điều kiện tự nhiên phùhợp với việc trồng và sản xuất hai loại cây trồng này, nhưng năng suất và sản lượngcủa hai loại cây trồng gặp nhiều hạn chế chưa tương ứng với tiềm năng sẵn có.Nguyên nhân chủ yếu do bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra,bệnh hại nặng đối với các vùng chuyên canh rau màu, đặc biệt là trên cây họ ca, trong

đó có cà chua và khoai tây (Nguyễn Tat Thắng, 2012)

Cho đến nay, các phương pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng phương pháp

hóa học dần được thay thế bằng các biện pháp sinh học, vì biện pháp này có nhiều ưu

điểm như: không gây ô nhiễm môi trường, không làm mất cân bằng hệ sinh thái, hạn

chế phát sinh các mầm bệnh kháng thuốc và quan trọng nhất là không tồn dư chất độc

hại vừa an toàn cho cả người sử dụng và người sản xuất Phát triển ngành nông nghiệptheo hướng xanh và bền vững là vấn đề tất yếu của mọi quốc gia và phân bón hữu cơ

sinh học đang là giải pháp ưu thế được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vàứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới (Bhardwaj và ctv, 2014)

Dé làm cơ sở cho việc phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn được tốt hơn, việc xác

định biovar của vi khuan Ralstonia solanacearum ở các vùng trồng cà chua, khoai tây

khác nhau và sử dụng một số vi sinh vật có ích trong phòng trừ bệnh góp phần hạn chế

bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây họ cà là cần thiết Trước tình hình đó đề tài “Phân lập,định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh vi khuẩn và đánhgiá khả năng đối kháng của một số vi sinh vật có ích” đã được thực hiện

|

Đánh giá khả năng đối kháng của các vi khuan có tinh kháng với vi khuẩn

Ralstonia solanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm

Giới hạn đề tài

Các mẫu bệnh héo xanh trên cây họ cà chỉ thu được tại tỉnh Lâm Đồng.

Các vi sinh vật chỉ được định danh bằng các đặc điểm hình thái va sinh hóa

Chương 1

TONG QUAN TAI LIEU1.1 Tổng quan về cây họ cà

1.1.1 Tổng quan về cây khoai tây

Phân loại khoa học

Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum, thuộc ho Solanaceae, loài

S tuberosum Theo Hawes (1956) cho rang có 4 loài trồng trọt nhị bội: S ajanhuiri, S.

goniocalyx, S phureja và S stenotonum Khoai tây trồng trọt nhị bội có nguồn gốc từ

khoai tây dại Hai loài phụ quan trọng đã được xác định là S tuberosum ssp tuberosum và S tuberosum ssp andigena (Tạ Thu Cúc, 2005).

Nguồn gốc

Khoai tây có nguồn gốc từ Peru, trong nghiên cứu của David Spooner (2005)thì quê hương của khoai tây là một khu vực phía Nam Peru (ngay phía bắc hồTiticaca) Hiện nay người ta cho rằng khoai tây đã được du nhập vào châu Âu vàokhoảng thập niên 1570 và sau đó nó đã được những người di biển châu Âu đưa đến cáclãnh thé và các cảng trên khắp thế giới khi chế độ thực dân châu Âu mở rộng vào thé

kỷ 17 và 18 (Spooner va ctv, 2005).

Giá trị dinh dưỡng

Khoai tây là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng phong phú, trong thân củ

khoai tây chứa nhiều chất quan trọng như: tinh bột, protein, đường, nhiều loại vitamin:

Caroten, Bị, Bz, Ba, PP, đặc biệt là vitamin C Trong khoai tây còn chứa các chất

khoáng chủ yếu, đứng đầu là Kali, thứ đến là Ca, P, Mg, sự có mặt của nhiều loại axit

amin tự do đã lam tăng thêm giá trị dinh dưỡng của cây.

Giá trị kinh tế

Khoai tây là một trong 5 loại cây lương thực trên thế giới sau lúa, ngô, mì,mạch Khoai tây là cây lương thực quan trọng của nhiều nước, là nguồn cung cấp nănglượng chính trong bữa ăn thường ngày của người châu Âu và một số nước khác

(Tạ Thu Cúc, 2005).

1.1.2 Tổng quan về cây cà chua

Phân loại khoa học

Cây ca chua có tên khoa học là Lycopersicon esculentum, thuộc ho Solanaceae,

loài S lycopersicum Cho đến nay hệ thống phân loại của Breznep (1964) được sửdụng phổ biến và rộng rãi nhất Theo Breznep, chi Lycopersicon được chia thành 3loài thuộc 2 chi phụ (Nguyễn Hồng Minh, 2000) là chi phụ 1 - Eulycopersion và chi

phu 2 - Eriopersicon.

Nguồn gốc

Học thuyết về trung tâm phát sinh cây trồng của Valilov đề xướng và Zukovxki

bé sung, cho rang quê hương của cây cà chua ở vùng Nam Mỹ Da số các tài liệu

nghiên cứu của các nhà thực vật học De Calldolle (1884), Muller (1940), Jenkins

(1984), đều thống nhất cho rằng số lượng lớn cà chua hoang dai cũng như cà chua

trồng được tìm thấy ở Peru, Equador, Chile dọc theo bờ biển Thái Bình Dương, từ

quần đảo Galanpagos tới Chile Trước khi Christop Colombus tìm ra Châu Mỹ thì ởPeru và Mehico đã có cà chua được trồng, ở đó người dân bản xứ đã thuần hóa và cải

tiến, sau đó cà chua được du nhập sang các nước châu Âu và trên khắp thế giới

(Tạ Thu Cúc, 2003).

Giá trị dinh dưỡng

Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao Giá trị dinh dưỡng của cả

chua đến từ thành phần giàu vitamin, khoáng chất và các loại dưỡng chất quan trọnggóp phần đặc biệt vào lợi ích sức khỏe - sắc đẹp con người

Theo Ersakov và Araximovich, thành phần của cà chua như sau: khối lượngchất khô 5 - 6%, trong đó đường dễ tan chiếm 3%, acid hữu cơ 0,5%, xenlulose 0,84%,chất keo 0,13%, protein 0,95%, lipit thô 0,2%, chất khoáng 0,6% Hàm lượng vitamin

C trong quả tươi chiếm 17 - 35,7 mg (Tạ Thu Cúc, 2003)

Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, cà chua còn đem lại nhiều lợi ích về y học Quả cà

chua có nhiều vitamin, chất khoáng và vi khoáng dé hấp thu giúp cơ thé tăng cường

khả năng miễn dịch, phòng chống nhiễm trùng Việc sử dụng cà chua thường xuyên,tăng cường cà chua trong chế độ ăn đã góp phan làm chậm quá trình lão hóa va giảmnguy cơ ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư đại tràng, ung thư vòm họm

(Tạ Thu Cúc, 2003).

Giá trị kinh tế

Ở Việt Nam, cây cà chua được xếp vào các loại rau có giá trị kinh tế cao, điện

tích trồng cà chua lên đến chục ngàn ha, tập trung chủ yếu ở đồng bằng và trung du

phía Bắc Hiện nay có một số giống chịu nhiệt mới lai tao chon lọc có thé trồng tại

miền Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ nên diện tích ngày càng mở rộng Nhiều giống

cà chua lai ghép chất lượng tốt được phát triển mạnh ở Đà Lạt, Lâm Đồng Một sốgiống cà chua chất lượng đã được xuất khẩu ra thị trường thế giới (Tạ Thu Cúc, 2005).1.2 Bệnh héo xanh trên cây họ cà

1.2.1 Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra

Ngày nay, Ralstonia solanacearum được ghi nhận là vi khuan gây hại ở hầu hếtcác châu lục Trên cả chua, vi khuẩn gây bệnh héo xanh, là một trong những bệnh gâyhại nghiêm trọng nhất đối với hầu hết các vùng trồng cà chua trên thế giới, gây thiệthại khá nghiêm trọng đến năng suất, có khi lên đến 95% thậm chí mất trắng(Hồ Thanh Hoàng, 2005)

Ở Việt Nam, bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là mộttrong những bệnh gây hại phổ biến nhất làm chết hàng loạt cà chua trên đồng ruộng,

gây tốn thất lớn ở các vùng trồng cà chua trong nước, nhất là vùng đồng bằng sông

Hồng Kết quả điều tra gần đây cho thấy ở nước ta vi khuân gây bệnh héo xanh thuộcphân chia châu A (Lê Luong Té, 1997), race 1, biovar 3 và 4 (Nguyễn Thị Yến, 2002).

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là loài vi khuẩn gây hại cho hàng trăm loàicây thực vật khác nhau Năm 1892, Halted đã nghiên cứu bệnh này, đến năm 1896

Smith nghiên cứu mô tả và định tên Ralstonia solanacearum Những năm về sau, có

nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn R solanacearum, phải nói đến các công trình

nghiên cứu của các tác giả: Buddenhagen và Kelman (1964), Hayward (1994), Ayami

và ctv (2003), Kiba va ctv (2003), Zhao va ctv (2011), Huang va ctv (2012), Cheng va

ctv (2012) Tat cả các nghiên cứu đều tập trung vào vi khuẩn R solanacearum và các

biện pháp phòng trừ.

Vào năm 2012, Scholarly Brief đã xuất bản cuốn sách “Những tiến bộ trongnghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn Ralstonia solanacearum” Năm 2013, Scholarly

Paper đã tái bản và bố sung thêm các nghiên cứu mới vào cuốn sách Điều này càng

nói lên tầm quan trọng của việc nghiên cứu sâu và rộng về vi khuan Ralstoniasolanacearum trên thê giới

1.2.3 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Vi khuan Ralstonia solanacearum là vi khuân hình que, kích thước tế bao0,5 - 1,5 um, gram âm (Sneath và ctv, 1986) V1 khuẩn tồn tại trong đất, tàn dư thực

vật, ký chủ phụ, hạt giống (đậu phộng) Chúng lan truyền theo nước hoặc đất bị nhiễm,

xâm nhập vào cây qua vết thương hoặc qua lỗ thở tự nhiên, vết nứt đầu rễ và di chuyểnvào trong bó mạch Chúng phá bó mạch làm tắc nghẽn sự vận chuyển nước và chất

dinh dưỡng Vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ 25 - 35°C, nhiệt độ tối đa là 41°C, nhiệt độtối thấp 10°C, nhiệt độ gây chết là 55°C Vi khuẩn phát triển trên phạm vi rộng

Nòi 1 bao gồm blovar 1, 3, 4 phân bố rộng ở các nước.

Noi 2 gồm biovar 1 gây héo chuối có phân bồ hẹp ở một số nước

Nòi 3 gồm biovar 2 có nguồn gốc ở Trung và Nam Mỹ với phạm vi ký chủ hẹp

nhưng phân bố khá rộng ở nhiều vùng, nhiều nước ở châu Á, châu Phi, châu Mỹ, châu

Đại Dương Đặc biệt nòi 3 đã gây hại trên khoai tây ở nhiều nước khí hậu ôn đới củachâu Âu từ những năm 1990

Noi 4 gồm biovar 4 gây héo cây gừng ở Trung Quốc, Philipin và một số nước khác.Noi 5 gồm biovar 5 chỉ gây hai ở cây dâu tằm (Đoàn Thị Thanh, 1998)

1.2.4.2 Biovar

Nhiều tác giả sử dụng khái niệm biovar và race là khái niệm cơ bản dé phânbiệt đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R solanacearum (Hayward, 1990) Theo cácnghiên cứu đến nay, đã có nhiều tác giả công bố kết quả nghiên cứu về nòi (race) củaloài Ralstonia solanacearum Họ đã phát hiện và công bố 5 nòi khác nhau trên cơ sởphân biệt về phạm vi ký chủ, phân bố địa lý và kha năng tồn tại ở những môi trường

khác nhau (He và ctv, 1983).

Trong các nghiên cứu từ trước đến nay thì cho thấy các nguồn vi khuẩn đượcphân lập từ các vùng địa lý khác nhau, từ cây ký chủ khác nhau đều không giống nhau

về sinh hóa, phản ứng huyết thanh và độ mãn cảm với thé thực khuẩn

Một nghiên cứu của ông Kelman và ctv (1964) đã phân lập các nòi vi khuẩnRalstonia solanacearum từ thuốc lá và lạc ở Mỹ và ông đã xác định 3 noi vi khuẩn

R solanacearum, Cũng vào năm 1964, Hayward đã xác định được 4 biovar khác nhau

dựa trên đặc điểm sinh hóa (Đoàn Thị Thanh, 1998) Cho đến năm 1983, He và ctv đãphát hiện bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại trên cây dâu tằm tương đương nòi 5, biovar

5 ở Trung Quốc

Bảng 1.1 Các đặc tinh sinh hóa của 5 biovar vi khuẩn Ralstonia solanacearum

(He và ctv, 1983; Hua và ctv, 1984)

Biovar Kha nang oxy hóa

Biovar 1: Không có phản ứng oxy hóa cả hai nhóm đường và nhóm rượu.

Biovar 2: Chỉ có phan ứng oxy hóa với nhóm đường và không oxy hóa nhóm rượu Biovar 3: Có phản ứng oxy hóa cả hai nhóm đường và nhóm rượu.

Biovar 4: Chỉ có phản ứng oxy hóa nhóm rượu.

Biovar 5: Chi oxy hóa 3 loại đường là lactose, maltose, cellobiose và 1 loại rượu là mannitol mà không oxy hóa sorbitol, dulcitol.

Mỗi nòi, biovar của loài Ralstonia solanacearum đều có tính độc, phạm vi kýchủ khác nhau, phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và một phần vùng

có khí hậu ôn đới.

Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng va ctv (1997) cho rằng các nguồn vi khuẩn

Ralstonia solanacearum phân lập được kiểm tra đều có tính độc cao đối với cây lạc vàmột số cây ký chủ khác, các mẫu phân lập được đều thuộc nòi 1, biovar 3 và biovar 4

Theo Đỗ Tân Dũng vào năm 1999 cho rằng, tác nhân gây ra bệnh héo xanh vikhuẩn trên cây cà chua, cả pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình đều do loài vi khuẩn

Ralstonia solanacearum thuộc noi 1, biovar 3 Các vi khuẩn gây bệnh héo xanh phânlập từ các cây ký chủ đều có khả năng lây bệnh chéo cho nhau, mức độ nhiễm bệnhkhác nhau, điều đó thé hiện tinh độc, tính gây bệnh giữa các mẫu phân lập vi khuẩn

cũng khác nhau.

1.2.5 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Bệnh phát sinh từ cây non đến khi thu hoạch Triệu chứng thường biểu hiệnngay sau khi xâm nhập vào cây Ở cây bị bệnh ban ngày lá mat màu nhẫn bóng, táixanh, héo cup xuống Ở giai đoạn cây con thường biểu hiện trên toản cây, còn ở giaiđoạn trưởng thành triệu chứng thường biểu hiện ở lá ngọn trước Ở 1 - 2 ngày đầu cây

có thể phục hồi lại được vào lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2 - 3 ngày lá héokhông thể hồi phục lại được nữa và toàn cây bị héo rũ rồi chết

Vỏ thân gần gốc của cây bị bệnh san sùi, khi cắt ngang thấy bó mach bị hóa nâu

Trong điều kiện 4m độ cao, thân cây bị bệnh dần dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cắt

có thé thay địch nhờn vi khuẩn tiết ra màu trắng sữa Rễ có màu nâu den và thối

1.2.6 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh

Thời gian vi khuẩn tồn lưu trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố như 4m độ,

nhiệt độ, hóa lý đất Vi khuẩn có thể tồn lưu trong đất từ 5 - 6 năm, trong cơ thể ký chủthực vật hoặc trong hạt giống có thé sống tới 7 tháng, còn nếu bám dính trên bề mặthạt chỉ tồn tại 2 - 7 ngày (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998)

Vi khuẩn lan truyền chủ yếu bằng nguồn nước, đất như bám dính vào giày đép,

dụng cụ canh tác Bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh phát triển phụ thuộc vào điều kiện đất đai như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn các chân đất thấp, đất được

luân canh với lúa nước làm giảm tỉ lệ bệnh đáng ké (Đỗ Tan Dũng, 2001)

Thời vụ trồng cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh, thời

vụ trồng có mưa nhiều, ẩm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát triển bệnh Mật độtrồng cao tỉ lệ bệnh thường cao do chúng tạo một vùng khí hậu thuận lợi cho sự phát

sinh phát triển bệnh

Việc phòng trị bệnh héo xanh thường rất khó khăn do chúng có phạm vi ký chủrộng, có khả năng lưu tồn rất hữu hiệu trong đất (Đỗ Tan Dũng, 2004) Luân canh cây

trồng không phải ký chủ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum là một trong những giải

pháp quan trọng giúp giảm mật độ vi khuẩn trong dat và hạn chế tối đa nguồn bệnh từcác tàn dư thực vật ở vụ trước Xử lý và cải tạo đất bằng việc bón tăng cường phân

chuồng, lưu huỳnh, canxi cũng đem lại những kết quả khác biệt nhau.

Biện pháp sinh học có thể sử dụng chế phẩm sinh học đối kháng như

Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis dé xử lí hạt trước khi gieo trồng hoặc đưa

vi sinh vật đối kháng vào vùng rễ sau trồng nhằm ức chế, cạnh tranh và tiêu diệt vikhuẩn Ralstonia solanacearum (Đỗ Tan Dũng, 2001)

Biện pháp dùng thuốc bảo vệ thực vat được cho là ít có hiệu quả trong phòngchống vi khuẩn Ralstonia solanacearum do vi khuân này có nguồn gốc từ đất xâmnhiễm gây bệnh và sinh sản trong hệ thống mạch dẫn của cây

1.3 Tổng quan về vi sinh vật đối kháng và cơ chế đối kháng

1.3.1 Vi sinh vật đối kháng

Trong tự nhiên thì có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng ức chế sự sinh

trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật khác và chúng thường được gọi là vi sinh

vật đối kháng Việc sử dụng hiện tượng đối kháng này trong công tác bảo vệ thực vật

được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học Biện pháp này được coi là phương pháp

quản lý bệnh cây trồng trực tiếp, giúp cây trồng chống lại những tác nhân gây bệnh,cũng là chìa khóa dé tạo một nền nông nghiệp bền vững Các loại vi sinh vật đối khang

tiêu diệt hoặc ức chế các hoạt động của vi sinh vật gây bệnh cây chủ yếu bằng các chat

kháng sinh, là những sản phẩm trao đổi chất trong quá trình sống của chúng (Vũ TriệuMan và Lê Lương Té, 1998).

1.3.2 Vai trò vi khuẩn đối kháng

Các loài vi khuẩn đối kháng luôn tổn tại trong tự nhiên, đa số trong chúng đều cólợi cho con người Đối với nông nghiệp những vi khuân đối kháng đều thuộc hệ vi sinhvật sống ở vùng rễ cây trồng và sống hoại sinh trong đất Trong quá trình sinh trưởngchúng tiết ra các chất trao đôi thứ cấp như: kháng sinh, enzyme, siderophore, chất điều

hòa sinh trưởng, acid Những chất này rất có lợi cho sự phát triển của cây trồng như:

kháng bệnh, tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây trồng, kích thích sự sinhtrưởng cho cây, hòa tan dinh dưỡng trong dat từ dang khó tiêu thành dang dễ tiêu décây trồng hap thụ được

Ngoài ra, còn có các yếu tố ảnh hưởng đến quan hệ đối kháng giữa các vi sinh

vật Trong môi trường tự nhiên, quan hệ đối kháng giữa các vi sinh vật cũng phụ thuộc

vào nhiều yếu tố như: môi trường, tính đặc hiệu, mối quan hệ giữa mật độ nhiễm vàocủa vi sinh vật đối kháng và mật độ của vsv gây bệnh, sự hấp thụ, tính hoạt động vàkhông hoạt động của những chất kháng sinh cũng phụ thuộc vào độ pH của đất

1.3.3 Cơ chế đối kháng của vi sinh vật

Cơ chế đối kháng do kháng sinh: kháng sinh là một chất quan trọng sinh ra trong

quá trình sinh trưởng của vi sinh vật để tiêu diệt những mầm bệnh có trong đất, giúpcây trồng phát triển Nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kiềm hãm sự sinh trưởngcua vi khuân một cách đặc hiệu.

Cơ chế đối kháng do siderophore: vi sinh vật đối kháng cũng có khả năng cạnh

tranh trực tiếp với nguồn bệnh về dinh dưỡng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh,tạo siderophore, để sinh trưởng Trong đó, siderophore là một loại protein sinh ratrong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe” trongmôi trường với áp lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp cua vi

sinh vật, lam cho môi trường xung quanh nghéo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khá

11

không có đủ ion Fe” cho quá trình sinh trưởng của minh, do đó chúng sẽ không sinh

trưởng được.

Cơ chế đối kháng tăng cường sức đề kháng của cây (kích kháng): tác dụng của vi

sinh vật kích thích sự sinh trưởng thực vật: là vi khuẩn vùng rễ khi tương tác với rễ cây

có thé tạo ra tính kháng của cây chống lại vi khuẩn, nam và virut gây bệnh Hiện tượngnày được gọi là tính kích kháng hệ thống, cũng giống như tính kích kháng hệ thống có

điều kiện (Ryu và ctv, 2004)

1.3.4 Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong nước:

Theo một nghiên cứu của Lê Như Kiều và ctv (2010), có 10 chủng vi khuẩn

phân lập và tuyến chọn được có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Ralstonia

solanacearum Trong đó, chủng CX5 thuộc chi Bacillus và PXI thuộc chi

Pseudomonas vừa có khả năng kiểm soát bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstoniasolanacearum trên cả lạc và rừng Chung CX5 làm giảm tỉ lệ rừng chết héo là 66,64%

và lạc là 74,41% so đối chứng, với chủng vi khuẩn PXI tỉ lệ này là 71,31% và 61,3%

Do đó chúng có tiềm năng trong sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng

Lê Thị Thanh Thủy năm 2014, đã báo cáo tuyên chọn được 2 củng vi khuân

B subtilis ĐKBI va P fluorescens DKP1 có khả năng kháng vi khuẩn Ralstoniasolanacearum (LH3 và YH3) với đường kính vòng ức chế tương ứng là 15 mm và 16

mm và chúng thuộc loại an toàn sinh học Ngoài ra, đã tách chiết được kháng sinhPhenazine từ chủng P fluorescens DKP1 và Iturin A từ chủng B subtilis ĐKBI, cả 2chất này đều có khả năng ức chế vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh

trên lạc và ớt (LH3 và YH3) Va đã xác định được Phenazine, Iturin A và siderophore

là một trong số những chất tham gia vào quá trình đối kháng vi khuẩn

R solanacearum của P fluorescens ĐKP! và B subtilis ĐKBI.

Từ các mẫu đất ở rễ cây cà chua Lê Vũ Kháng Trang và Lý Hải Triều (2020),

đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn là P01, P02, P03, P04, P05, chúng có kha năngsinh trưởng tốt trong môi trường KB và phát quang khi quan sát dưới tia UV Trong

đó, chủng P04 có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Chung P04 được định danh tên khoa học là Pseudomonas aeruginosa Kết quả củanghiên cứu là cơ sở dé đa dạng hóa các chế phẩm sinh học, cải thiện và ứng dụng chế

pham Pseudomonas sp vào lĩnh vực nông nghiệp trong phòng và chữa bệnh héo xanh

do vi khuẩn gây ra

1.3.5 Nghiên cứu vi sinh vật ngoài nước

Theo các nghiên cứu cua Davey và O’Toole (2000), Kokare va ctv (2009) Bacillus subtilis có khả nang sinh trưởng tao mang sinh vat (biofilm) Thí nghiệm với

rễ cây Arabidopsis cho thay việc sử dụng chủng B subtilis 6051 có hoạt tinh taobiofilm đồng thời tổng hợp surfactin lam tăng kha năng hấp thu của rễ cây Việc cómặt của surfactin trong biofilm còn ức chế sự phát triển của Salmonella enterica ởnồng độ 50 ug/ml, E coli va Proteus mirabilis ở mức cao hơn trong điều kiện in vitro

Chat surfactin từ chủng B subtilis có tác dụng cao hơn cả iturin A trong việc kháng lại

các nắm gây bệnh thực vật và nam sinh độc té aflatoxin Một số sản phẩm thương mạinhư surfactin, serenade được tông hợp từ B subtilis có khả năng diệt các vi khuẩn gâybệnh thực vật như Erwina, Pseudomanas hay Xanthomonas.

Trong một nghiêm cứu của Tiantian Zhou và ctv (2012), cho thấy một dòng vi

khuan J12 ức chế mạnh sự phát triển của vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh

héo xanh trên cây cà chua Chung J12 được xác định là Pseudomonas brassicacearumdựa trên trình tự gen 16S rRNA của nó J12 có thé tao ra 2,4 - diacetylphloroglucinol(2.4 - DAPG), hydrogen cyanide (HCN), siderophore va protease Sự phat triển tối da

và hoạt động đối kháng ở 30°C và pH 8 Glucose và tryptone được sử dung làm nguồncacbon và nitơ tương ứng và thích hợp nhất Strain J12 đã ngăn chặn đáng kề 45,5% vi

khuẩn gây bệnh héo xanh trên cà chua trong thí nghiệm ở nhà kính

Jae Won Kwon và Shin Duk Kim (2013), đã nghiên cứu Bacillus subtilis JW-1

được phân lập từ dat rhizosphere là tác nhân kiểm soát sinh học tiềm năng đối với

bệnh héo xanh do vi khuan Ralstonia solanacearum gây ra Sự ức ché bởi dòng JW-1

là sự tiết kháng sinh

13

Tương tự, thí nghiệm của Prihatiningsih va Djatmiko (2016), cho thấy Bacillussubtilis B315 có thé ngăn chặn sự phát triển của R solanacearum với ving ức chế 14

mm Hoạt động khang sinh của Ö subtilis B315 như tác nhân sinh học được thê hiện

bằng cách sản xuất enzyme amylase với hoạt độ 0,802 đơn vi/ml

Theo một nghiên cứu khác của Ayomide và ctv (2020), đã phân lập và xác địnhđược bảy loài Pseudomonas ban địa có enzyme và hoạt tính kháng khuẩn invitrochống lại vi khuân Ralstonia solanacearum gây bệnh bằng phương pháp nuôi cấy đĩa

kép Các loài P aeruginosa, P syringae và P fluorescens tạo ra các enzyme lipase,

protease va a-amylase Tất cả các đồng phan Pseudomonas ngoại trừ P aureofaciens

đều ức chế làm giảm tỷ lệ bệnh héo xanh do vi khuẩn và thúc day sự phát triển của các

kiểu gen cà chua được thử nghiệm

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

2.1 Nội dung nghiên cứu

Phân lập và định danh vi khuân Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trêncây họ cà Xác định biovar của vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà

Phân lập và định danh các dòng vi khuẩn có ích bằng đặc điểm hình thái và cácphản ứng sinh hóa Đánh giá tính đối kháng của các dòng vi khuẩn có ích với vi khuẩnRalstonia solanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 05 năm 2022 đến tháng 11 năm 2022

Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa

Nông học, Đại học Nông Lâm TP HCM.

Địa điểm lấy mẫu: tỉnh Lâm Đồng

2.3 Vật liệu thí nghiệm

2.3.1 Đối tượng thí nghiệm

Các mẫu cây họ cà (cả chua, khoai tây) và mẫu đất vùng bị bệnh héo xanh thu tạitỉnh Lâm Đồng

Quy ước đặt tên mẫu bệnh, mẫu đất (mã mẫu): mẫu bệnh được mã hóa theo địa

điểm thu mẫu và số thứ tự mẫu cụ thé: Tên mẫu: Mẫu (C ca chua, K khoai tây, D

-dat) - xã lay mẫu (HA - Hiệp An, KaÐ - Ka Don, KD - Ka Đô, XT - Xuân Thọ) - số

thứ tự mẫu Vi dụ: CHA1, CHA2, KKaD1, ĐXTI,

là

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị máy móc

Dụng cụ: Đĩa petri, Ống nghiệm, eppendorf, nước cất khử trùng, cồn, số ghi chép,

máy chụp hình, bông gòn hút nước, thước do, viết, pipet các loại, đầu típ các loại

Thiết bị: Tủ cấy khử trùng, máy hấp khử trùng, máy sấy khử trùng, kính hiển vi,

cân điện tử, bếp điện tử, lò viba, máy ly tâm, máy Vortex

20 g agar vào 1000 ml nước cất với nước lọc khoai tây

Môi trường KBA (King'B Agar): thành phần peptone 20 g, Glycerol 10 g,

K;HPO¿ khan 1,5 g, MgSO¿.7H;O 1,5 g, agar 15 g, nước cất 1000 ml

Môi trường đặc hiệu: Môi trường TZC - agar (TZCA): thành phan peptone 10 g,Casein hydrolysate 1 g, Glucose 5 g, TZC: 0,05 g, agar 20 g, nước cat 1000 ml

Môi trường WA: thành phan agar 20 g, nước cất 1000 ml

Môi trường cơ sở: NH4H2SO, 1 g, KCL 0,2 g, MgSO¿.7H;O 1 g, Methyl red 0,08

g, nước cat 1000 ml

Môi trường SPA: Sucrose 20 g; Peptone 5g, K;HPO¿ 0,5 g, MgSO4.7H2O 0,25

g, agar 15 g, nước cất 1000 ml

2.4 Phuong phap nghién ciru

2.4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh trên cây họ cà

2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu bệnh héo xanh

Thu thập và bảo quản mẫu bệnh theo phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật

của Roger Shivas và Dean Beasley (2005).

Thu thập các mẫu bệnh tại tỉnh Lâm Đồng ở 2 huyện Đức Trọng, Đơn Dương

và thành phố Đà Lạt, mỗi huyện thu 3 ruộng, mỗi ruộng thu 2 mẫu có triệu chứng

bệnh héo xanh điền hình do Ralstonia solanacearum gây ra trên cà chua và khoai tây

Tổng số mẫu thu 12 mẫu bệnh tại tỉnh Lâm Đồng Thời điểm thu mẫu cây bệnh

thích hợp nhất là ở giai đoạn đầu hoặc giữa của bệnh, khi vi khuẩn hại vẫn đang ởtrạng thái hoạt động.

Phương pháp bảo quản mẫu: Bảo quản mẫu theo Roger Shivas và DeanBeasley (2005): Mô bệnh vi khuan dễ khô nhanh, vì vậy khi thu thập và vận chuyểnmẫu bệnh tới phòng thí nghiệm ở xa phải đặt mẫu bệnh vào túi giấy và dùng giấy báo4m bọc lại dé tránh cho mẫu khỏi bị khô Nên giữ mẫu ở nơi mát mẻ, tránh ánh nang

mặt trời.

Hình 2.1 Bệnh héo xanh trên cây ho ca (A) Cây khoai tây, (B) cây cà chua

2.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà

Mẫu sau khi đem về, cắt lấy 10 cm đoạn thân sát rễ, rửa sạch bằng nước cat,

ngâm trong cồn 70° khoảng 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần Cắtđoạn thân trên thành những đoạn nhỏ 1 cm đặt vào ống nghiệm khoảng 5 ml nước cat

vô trùng Sau 5 phút, vớt bỏ phan thân trên, phan dịch tiết ra gọi là dich thô

17

Sau đó, lấy 20 pl dich đục dan mỏng trên bề mặt môi trường LB đã chuẩn bi, ủ

ở nhiệt độ phòng 25 - 30°C trong sau 24 giờ dé khuân mọc lên Sau 1 ngày, khuẩn lạcmọc lên Sử dung que cấy lay khuẩn lạc cần thiết cay theo đường ziczac Tiếp tục cay

chuyền đến khi vi khuẩn thuần (3 lần) Các mẫu thuần được sử dụng cho các thí

nghiệm tiếp theo, giống vi khuẩn thuần được cay trên ống thạch nghiêng, bảo quan

4°C dé tiến hành các thí nghiệm sau và bảo quản trong eppendorf với 50% glycerol ở20°C để lưu giữ mẫu (Mubeev và ctv, 2015)

2.4.1.3 Phương pháp định danh vi khuẩn thông qua môi trường TZCA

Cấy khuẩn lạc trên môi trường TZCA, ủ ở nhiệt độ 25 - 30°C trong 48 giờ và

quan sát Các khuẩn lạc có đặc tính nhầy, màu trắng ngà, rìa mép nhẫn, ở giữa có màuphot hồng trên môi trường TZCA là đặc trưng của vi khuẩn R solanacearum(Kelman, 1953).

Vi khuẩn Ralstonia solanacesrum có té bào vi khuân hình que, kích thước tế

bảo 0,5 x 1,5 um (Mehan và ctv, 1994).

2.4.1.4 Đánh giá độc tính của các dòng vi khuẩn R Solanacearum đã phân lậpđược trong phòng thí nghiệm

Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch trong điều kiện phòng thí nghiệm:

Chuẩn bị: Hạt giông cà chua được rửa bằng cồn 70” trong 30 giây Ủ hạt trêngiấy thấm vô trùng được làm 4m đặt trong dia petri, giữ ở nhiệt độ phòng 27 - 30°C

Các dòng vi khuẩn có đặc trưng trên môi trường TZCA nuôi cấy trong môi

trường LB lỏng sau 2 ngày, cho 25 ml vi khuân vào ống fancol, tiến hành ly tâm 6000

vòng trong thời gian 15 phút Thu được dung dịch vi khuẩn

Bo trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngau nhiên, moi dong vi khuân là một nghiệmthức và một nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 10 hạt, 3 lần lặp lại

NTO: Đối chứng không lây nhiễm vi khuẩn

NTI : Lay nhiễm mẫu phân lập CHAI

: Lay nhiễm mẫu phân lập CHA2

: Lây nhiễm mẫu phân lập CHA3: Lây nhiễm mẫu phân lập CHA4

: Lay nhiễm mẫu phân lập CHAS

: Lay nhiễm mẫu phân lập CHA6

: Lay nhiễm mẫu phân lập KKaÐ1: Lây nhiễm mẫu phân lập KKaÐ2

: Lây nhiễm mẫu phân lập KKaÐ3: Lây nhiễm mẫu phân lập KKaÐ4: Lây nhiễm mẫu phân lập KKaÐ5

: Lay nhiễm mẫu phân lập KKaD6: Lây nhiễm mẫu phân lập KKĐI

: Lay nhiễm mẫu phân lập KKĐ2

: Lay nhiễm mẫu phân lập KKD3: Lay nhiễm mẫu phân lập KKD4: Lây nhiễm mẫu phân lập KKĐ5: Lay nhiễm mẫu phân lập KKD6: Lay nhiễm mẫu phân lập KKD7: Lây nhiễm mẫu phân lập KQLI: Lây nhiễm mẫu phân lập KQL2: Lay nhiễm mẫu phân lập KQL3

: Lây nhiễm mẫu phân lập KQL4

: Lây nhiễm mẫu phân lập KQL5

19

NT25 : Lây nhiễm mẫu phân lập CXTI

NT26 : Lây nhiễm mẫu phân lập CXT2

NT27 : Lay nhiễm mẫu phân lập CXT3

NT28 : Lây nhiễm mẫu phân lập CXT4

NT29 : Lay nhiễm mẫu phân lập CXT5

NT30 : Lay nhiễm mẫu phân lập CXT6

Phương pháp lây nhiễm: Lây nhiễm theo phương pháp của Zhang Liquin(2001) Khi hạt nảy mầm khoảng 1,5 mm, ngâm hạt vào dịch vi khuẩn đã chuẩn bị

trong 20 phút Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, cấy vào đĩa petri chứa

sẵn môi trường WA (10 hạt trên một đĩa petri), đặt ở nhiệt độ phòng

Tiến hành theo dõi triệu chứng bệnh trong vòng 1 tuần

Ti lệ bệnh (%) = (Số cây bị bệnh/ Tổng số cây lây nhiễm của nghiệm thức) x 100

2.4.1.5 Định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà bằng đặc điểm hình thái

Nhuộm Gram vi khuẩn

Mục đích: phương pháp nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gramdương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào

Vật liệu nhuộm Gram gom: lam kính, kính hién vi, dau soi kính, dung dichCrystal violet, Lugol, Safranin, Ethanol 96°, bút sáp, khuyên cấy, khuẩn lạc nuôi cấy

trong vòng 24 giờ.

Cách tiến hành: dùng bút sap dé ghi tên mẫu và vẽ vòng tròn dé giới hạn vùngphết vi khuẩn Dùng khuyên cấy lấy một khuyên cấy nước cất vô trùng đặt vào giữavòng tròn đã vẽ, lay một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc và đàn mỏng với nước cấttrong vòng tròn Hơ mặt dưới của lam kính qua lại trên ngọn lửa 2 đến 3 lần, tránh không

để tiêu bản quá nóng Sau khi vi khuẩn khô nhỏ 3 giọt dung dịch Crystal violet lên vòng

tròn đề trong 60 giây, sau đó rửa sạch bằng nước cất cho đến khi thấy dung dịch khôngcòn bị rửa trôi Tiếp tục nhỏ 3 giọt dung dịch Lugol lên vòng tròn dé trong 60 giây,

sau đó rửa lại nhẹ bằng nước cất vô trùng rồi thấm khô Nhỏ một giọt dung dịchEthanol 96° trên lam vài giây dé rửa hóa chất nhuộm, rửa lại nhẹ bằng nước cất vôtrùng rồi thắm khô Sau đó tiếp tục nhỏ 3 giọt dung dịch Safranin lên vòng tròn trong

60 giây, rửa lại bằng nước vô trùng rồi thắm khô Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ

phóng đại 100 lần có giọt dầu soi kính

Quan sát két qua: nêu là vì khuân Gram dương sẽ bắt màu tím xanh, vi khuânGram âm sẽ bắt màu hong

Thử dung dịch KOH 3%

Mục đích: thử Gram bằng KOH 3% là phương pháp dựa trên cấu tạo khác nhau

giữa thành phan tế bào vi khuẩn Gram dương (+) và Gram âm (-)

Vật liệu dé thử Gram: KOH 3%, que tăm đã hap khử trùng, lam kính, khuẩn lạc

nuôi cây trong vòng 24 giờ

Cách thực hiện: Dùng que tăm đã hấp khử trùng lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từkhuẩn lạc đang phát triển và trộn đều với một giọt dung địch KOH 3% trên một lamkính Nhac đầu que tăm lên cách bề mặt của lam kính khoảng vài milimet, khoảng

5 — 20 mm Nếu dich vi khuẩn dạng nhớt dính (đám nhay), tao thanh soi duoc kéo theoque tam thi vi khuẩn đó thuộc nhóm Gram âm (-) Nếu dich vi khuẩn giống như nước,

không dính nhớt (đám nhay), không có dang sợi thì vi khuẩn đó thuộc nhóm Gram

dương (+).

2.4.1.6 Định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà bằng phản ứng sinh hóa

Phương pháp xác định khả năng sử dụng và chuyển hóa cacbon trong môitrường nuôi cấy của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Theo phương pháp xác định biovar của French (1995)

Môi trường cơ sở sau khi hòa tan, điều chỉnh pH 7, sau đó hap 6 121°C trong

20 phút Khi nhiệt độ môi trường khoảng 63°C, thêm 10% từng dung dịch đường và

rượu đã chuẩn bị rồi hút 5 ml cho vào ống nghiệm

Vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, cho 25 ml vi khuẩn

pal

vào ông, tiễn hành ly tâm 4000 vòng trong thời gian 15 phút Dùng pipet hút 100 ul vi

khuẩn thu được cho vào từng ống nghiệm chứa các loại môi trường, cố định ở 30°C

đặt trong tủ định ôn, các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng

Theo dõi 3 ngày đối với môi trường rượu, 5 ngày đối với môi trường đường, nếumôi trường dịch chuyên từ màu đỏ của dung dịch ban đầu sang màu vàng thì xác định là

có khả năng chuyền hóa cacbon, ngược lại không chuyển màu là không có khả năngchuyên hóa cacbon.

Bảng 2.1 Xác định biovar vào phan ứng sinh hóa (He va ctv, 1983; Hua va ctv, 1984)

Két qua:

(+): Dương tinh (môi trường chuyền từ đỏ sang vàng)

(-): Âm tính (môi trường vẫn còn màu đỏ ban đầu)

2.4.2 Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất

2.4.2.1 Thu thập vi khuẩn đối kháng trong đất

Mau đất được thu thập trên những ruộng có triệu chứng bệnh do vi khuẩn

Ralstonia solanacearum gây ra.

Tổng số mẫu thu là 6 mẫu ở 2 huyện Đương Dương, Đức trọng và TP Đà Lạt.Trên mỗi ruộng thu thập ở nhiều vị trí khác nhau Mỗi mẫu đất lấy khoảng 200 g, lấytrong khoảng 50cm cách gốc và chiều sâu từ 10cm