2.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập và định danh vi khuân Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà. Xác định biovar của vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà.
Phân lập và định danh các dòng vi khuẩn có ích bằng đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh hóa. Đánh giá tính đối kháng của các dòng vi khuẩn có ích với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 05 năm 2022 đến tháng 11 năm 2022.
Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa
Nông học, Đại học Nông Lâm TP. HCM.
Địa điểm lấy mẫu: tỉnh Lâm Đồng.
2.3 Vật liệu thí nghiệm
2.3.1 Đối tượng thí nghiệm
Các mẫu cây họ cà (cả chua, khoai tây) và mẫu đất vùng bị bệnh héo xanh thu tại tỉnh Lâm Đồng.
Quy ước đặt tên mẫu bệnh, mẫu đất (mã mẫu): mẫu bệnh được mã hóa theo địa điểm thu mẫu và số thứ tự mẫu cụ thé: Tên mẫu: Mẫu (C - ca chua, K - khoai tây, D - dat) - xã lay mẫu (HA - Hiệp An, KaÐ - Ka Don, KD - Ka Đô, XT - Xuân Thọ) - số thứ tự mẫu. Vi dụ: CHA1, CHA2, KKaD1, ĐXTI,...
là
2.2.2 Dụng cụ, thiết bị máy móc
Dụng cụ: Đĩa petri, Ống nghiệm, eppendorf, nước cất khử trùng, cồn, số ghi chép, máy chụp hình, bông gòn hút nước, thước do, viết, pipet các loại, đầu típ các loại.
Thiết bị: Tủ cấy khử trùng, máy hấp khử trùng, máy sấy khử trùng, kính hiển vi, cân điện tử, bếp điện tử, lò viba, máy ly tâm, máy Vortex.
2.2.3 Thành phần môi trường
Môi trường LB - Luria Broth: thành phan peptone 10 g, cao nắm men 5 g, NaCl 10 g, agar 20 g, nước cất 1000 ml, pH 7.0.
Môi trường PGA - Potato Glucose Agar: rửa sạch 200 g khoai tây (không gọt
vỏ). Cắt khoai tây thành từng miếng nhỏ và luộc trong khoảng 1 giờ, sau đó lọc khoai tây và nước luộc bằng rây (hoặc vải màn). Hòa tan 20 g đường dextrose (glucose) và 20 g agar vào 1000 ml nước cất với nước lọc khoai tây.
Môi trường KBA (King'B Agar): thành phần peptone 20 g, Glycerol 10 g, K;HPO¿ khan 1,5 g, MgSO¿.7H;O 1,5 g, agar 15 g, nước cất 1000 ml.
Môi trường đặc hiệu: Môi trường TZC - agar (TZCA): thành phan peptone 10 g, Casein hydrolysate 1 g, Glucose 5 g, TZC: 0,05 g, agar 20 g, nước cat 1000 ml.
Môi trường WA: thành phan agar 20 g, nước cất 1000 ml.
Môi trường cơ sở: NH4H2SO, 1 g, KCL 0,2 g, MgSO¿.7H;O 1 g, Methyl red 0,08
g, nước cat 1000 ml.
Môi trường SPA: Sucrose 20 g; Peptone 5g, K;HPO¿ 0,5 g, MgSO4.7H2O 0,25
g, agar 15 g, nước cất 1000 ml.
2.4 Phuong phap nghién ciru
2.4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh trên cây họ cà 2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu bệnh héo xanh
Thu thập và bảo quản mẫu bệnh theo phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật
của Roger Shivas và Dean Beasley (2005).
Thu thập các mẫu bệnh tại tỉnh Lâm Đồng ở 2 huyện Đức Trọng, Đơn Dương và thành phố Đà Lạt, mỗi huyện thu 3 ruộng, mỗi ruộng thu 2 mẫu có triệu chứng bệnh héo xanh điền hình do Ralstonia solanacearum gây ra trên cà chua và khoai tây.
Tổng số mẫu thu 12 mẫu bệnh tại tỉnh Lâm Đồng. Thời điểm thu mẫu cây bệnh thích hợp nhất là ở giai đoạn đầu hoặc giữa của bệnh, khi vi khuẩn hại vẫn đang ở
trạng thái hoạt động.
Phương pháp bảo quản mẫu: Bảo quản mẫu theo Roger Shivas và Dean Beasley (2005): Mô bệnh vi khuan dễ khô nhanh, vì vậy khi thu thập và vận chuyển mẫu bệnh tới phòng thí nghiệm ở xa phải đặt mẫu bệnh vào túi giấy và dùng giấy báo 4m bọc lại dé tránh cho mẫu khỏi bị khô. Nên giữ mẫu ở nơi mát mẻ, tránh ánh nang
mặt trời.
Hình 2.1 Bệnh héo xanh trên cây ho ca (A) Cây khoai tây, (B) cây cà chua
2.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà
Mẫu sau khi đem về, cắt lấy 10 cm đoạn thân sát rễ, rửa sạch bằng nước cat, ngâm trong cồn 70° khoảng 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần. Cắt đoạn thân trên thành những đoạn nhỏ 1 cm đặt vào ống nghiệm khoảng 5 ml nước cat vô trùng. Sau 5 phút, vớt bỏ phan thân trên, phan dịch tiết ra gọi là dich thô.
17
Sau đó, lấy 20 pl dich đục dan mỏng trên bề mặt môi trường LB đã chuẩn bi, ủ ở nhiệt độ phòng 25 - 30°C trong sau 24 giờ dé khuân mọc lên. Sau 1 ngày, khuẩn lạc mọc lên. Sử dung que cấy lay khuẩn lạc cần thiết cay theo đường ziczac. Tiếp tục cay chuyền đến khi vi khuẩn thuần (3 lần). Các mẫu thuần được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo, giống vi khuẩn thuần được cay trên ống thạch nghiêng, bảo quan 4°C dé tiến hành các thí nghiệm sau và bảo quản trong eppendorf với 50% glycerol ở 20°C để lưu giữ mẫu (Mubeev và ctv, 2015).
2.4.1.3 Phương pháp định danh vi khuẩn thông qua môi trường TZCA
Cấy khuẩn lạc trên môi trường TZCA, ủ ở nhiệt độ 25 - 30°C trong 48 giờ và quan sát. Các khuẩn lạc có đặc tính nhầy, màu trắng ngà, rìa mép nhẫn, ở giữa có màu phot hồng trên môi trường TZCA là đặc trưng của vi khuẩn R. solanacearum
(Kelman, 1953).
Vi khuẩn Ralstonia solanacesrum có té bào vi khuân hình que, kích thước tế
bảo 0,5 x 1,5 um (Mehan và ctv, 1994).
2.4.1.4 Đánh giá độc tính của các dòng vi khuẩn R. Solanacearum đã phân lập
được trong phòng thí nghiệm
Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch trong điều kiện phòng thí nghiệm:
Chuẩn bị: Hạt giông cà chua được rửa bằng cồn 70” trong 30 giây. Ủ hạt trên giấy thấm vô trùng được làm 4m đặt trong dia petri, giữ ở nhiệt độ phòng 27 - 30°C.
Các dòng vi khuẩn có đặc trưng trên môi trường TZCA nuôi cấy trong môi trường LB lỏng sau 2 ngày, cho 25 ml vi khuân vào ống fancol, tiến hành ly tâm 6000 vòng trong thời gian 15 phút. Thu được dung dịch vi khuẩn.
Bo trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngau nhiên, moi dong vi khuân là một nghiệm
thức và một nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 10 hạt, 3 lần lặp lại.
NTO: Đối chứng không lây nhiễm vi khuẩn NTI : Lay nhiễm mẫu phân lập CHAI
NT4
NTIS
NT6
NT
NTS
NT9
NT10
NT11
NT12
NT13
NT14
NT15
NT16
NT17
NT18
NT19
NT20
NT21
NI22
NT23
NT24
: Lay nhiễm mẫu phân lập CHA2 : Lây nhiễm mẫu phân lập CHA3 : Lây nhiễm mẫu phân lập CHA4 : Lay nhiễm mẫu phân lập CHAS : Lay nhiễm mẫu phân lập CHA6 : Lay nhiễm mẫu phân lập KKaÐ1 : Lây nhiễm mẫu phân lập KKaÐ2 : Lây nhiễm mẫu phân lập KKaÐ3 : Lây nhiễm mẫu phân lập KKaÐ4 : Lây nhiễm mẫu phân lập KKaÐ5 : Lay nhiễm mẫu phân lập KKaD6 : Lây nhiễm mẫu phân lập KKĐI : Lay nhiễm mẫu phân lập KKĐ2 : Lay nhiễm mẫu phân lập KKD3 : Lay nhiễm mẫu phân lập KKD4 : Lây nhiễm mẫu phân lập KKĐ5
: Lay nhiễm mẫu phân lập KKD6 : Lay nhiễm mẫu phân lập KKD7 : Lây nhiễm mẫu phân lập KQLI : Lây nhiễm mẫu phân lập KQL2 : Lay nhiễm mẫu phân lập KQL3 : Lây nhiễm mẫu phân lập KQL4 : Lây nhiễm mẫu phân lập KQL5
19
NT25 : Lây nhiễm mẫu phân lập CXTI NT26 : Lây nhiễm mẫu phân lập CXT2 NT27 : Lay nhiễm mẫu phân lập CXT3 NT28 : Lây nhiễm mẫu phân lập CXT4 NT29 : Lay nhiễm mẫu phân lập CXT5 NT30 : Lay nhiễm mẫu phân lập CXT6
Phương pháp lây nhiễm: Lây nhiễm theo phương pháp của Zhang Liquin (2001). Khi hạt nảy mầm khoảng 1,5 mm, ngâm hạt vào dịch vi khuẩn đã chuẩn bị trong 20 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, cấy vào đĩa petri chứa sẵn môi trường WA (10 hạt trên một đĩa petri), đặt ở nhiệt độ phòng.
Tiến hành theo dõi triệu chứng bệnh trong vòng 1 tuần.
Ti lệ bệnh (%) = (Số cây bị bệnh/ Tổng số cây lây nhiễm của nghiệm thức) x 100.
2.4.1.5 Định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà bằng đặc điểm hình thái Nhuộm Gram vi khuẩn
Mục đích: phương pháp nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào.
Vật liệu nhuộm Gram gom: lam kính, kính hién vi, dau soi kính, dung dich Crystal violet, Lugol, Safranin, Ethanol 96°, bút sáp, khuyên cấy, khuẩn lạc nuôi cấy
trong vòng 24 giờ.
Cách tiến hành: dùng bút sap dé ghi tên mẫu và vẽ vòng tròn dé giới hạn vùng phết vi khuẩn. Dùng khuyên cấy lấy một khuyên cấy nước cất vô trùng đặt vào giữa vòng tròn đã vẽ, lay một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc và đàn mỏng với nước cất trong vòng tròn. Hơ mặt dưới của lam kính qua lại trên ngọn lửa 2 đến 3 lần, tránh không để tiêu bản quá nóng. Sau khi vi khuẩn khô nhỏ 3 giọt dung dịch Crystal violet lên vòng tròn đề trong 60 giây, sau đó rửa sạch bằng nước cất cho đến khi thấy dung dịch không còn bị rửa trôi. Tiếp tục nhỏ 3 giọt dung dịch Lugol lên vòng tròn dé trong 60 giây,
sau đó rửa lại nhẹ bằng nước cất vô trùng rồi thấm khô. Nhỏ một giọt dung dịch Ethanol 96° trên lam vài giây dé rửa hóa chất nhuộm, rửa lại nhẹ bằng nước cất vô trùng rồi thắm khô. Sau đó tiếp tục nhỏ 3 giọt dung dịch Safranin lên vòng tròn trong 60 giây, rửa lại bằng nước vô trùng rồi thắm khô. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 lần có giọt dầu soi kính.
Quan sát két qua: nêu là vì khuân Gram dương sẽ bắt màu tím xanh, vi khuân
Gram âm sẽ bắt màu hong.
Thử dung dịch KOH 3%
Mục đích: thử Gram bằng KOH 3% là phương pháp dựa trên cấu tạo khác nhau giữa thành phan tế bào vi khuẩn Gram dương (+) và Gram âm (-).
Vật liệu dé thử Gram: KOH 3%, que tăm đã hap khử trùng, lam kính, khuẩn lạc nuôi cây trong vòng 24 giờ.
Cách thực hiện: Dùng que tăm đã hấp khử trùng lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc đang phát triển và trộn đều với một giọt dung địch KOH 3% trên một lam kính. Nhac đầu que tăm lên cách bề mặt của lam kính khoảng vài milimet, khoảng 5 — 20 mm. Nếu dich vi khuẩn dạng nhớt dính (đám nhay), tao thanh soi duoc kéo theo que tam thi vi khuẩn đó thuộc nhóm Gram âm (-). Nếu dich vi khuẩn giống như nước, không dính nhớt (đám nhay), không có dang sợi thì vi khuẩn đó thuộc nhóm Gram
dương (+).
2.4.1.6 Định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà bằng phản ứng sinh hóa Phương pháp xác định khả năng sử dụng và chuyển hóa cacbon trong môi trường nuôi cấy của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Theo phương pháp xác định biovar của French (1995)
Môi trường cơ sở sau khi hòa tan, điều chỉnh pH 7, sau đó hap 6 121°C trong
20 phút. Khi nhiệt độ môi trường khoảng 63°C, thêm 10% từng dung dịch đường và
rượu đã chuẩn bị rồi hút 5 ml cho vào ống nghiệm.
Vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, cho 25 ml vi khuẩn
pal
vào ông, tiễn hành ly tâm 4000 vòng trong thời gian 15 phút. Dùng pipet hút 100 ul vi khuẩn thu được cho vào từng ống nghiệm chứa các loại môi trường, cố định ở 30°C đặt trong tủ định ôn, các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Theo dõi 3 ngày đối với môi trường rượu, 5 ngày đối với môi trường đường, nếu môi trường dịch chuyên từ màu đỏ của dung dịch ban đầu sang màu vàng thì xác định là có khả năng chuyền hóa cacbon, ngược lại không chuyển màu là không có khả năng
chuyên hóa cacbon.
Bảng 2.1 Xác định biovar vào phan ứng sinh hóa (He va ctv, 1983; Hua va ctv, 1984) . ‹ „ Blovar
Khả năng sử dụng và oxy hóa 5 z 7 5
Cellobiose - + + - + Lactose - + + - + Maltose - + + = + Dulcitol - - + = 2 Mannitol - - + + 4 Sorbitol - - + + -
Két qua:
(+): Dương tinh (môi trường chuyền từ đỏ sang vàng) (-): Âm tính (môi trường vẫn còn màu đỏ ban đầu)
2.4.2 Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất 2.4.2.1 Thu thập vi khuẩn đối kháng trong đất
Mau đất được thu thập trên những ruộng có triệu chứng bệnh do vi khuẩn
Ralstonia solanacearum gây ra.
Tổng số mẫu thu là 6 mẫu ở 2 huyện Đương Dương, Đức trọng và TP Đà Lạt.
Trên mỗi ruộng thu thập ở nhiều vị trí khác nhau. Mỗi mẫu đất lấy khoảng 200 g, lấy trong khoảng 50cm cách gốc và chiều sâu từ 10cm.
Mẫu đất nên được giữ trong túi nilon và sử dụng búp chì để viết tên nhãn cho từng mẫu. Qui ước đặt tên mẫu: được mã hóa theo tên ruộng cây trồng và địa điểm thu thập. Ví dụ: mẫu đất thu thập tại ruộng cà chua ở Lâm Đồng (ĐLĐ).
2.4.2.2 Phân lập vi khuẩn đối kháng trong đất
Cho mẫu đất, rễ nhỏ (10 g) lay ở xung quanh vùng rễ cây bị bệnh được loại bỏ rác, nghiền nhỏ trong cối chày sứ vô trùng, bỗ sung 90 ml nước cất vô trùng và chuyền sang bình tam giác, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong vòng 20 phút. Lay 1 ml dung dịch chyén sang ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lí vô trùng và tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10”, 10', 10°. Từ các ống nghiệm có độ pha loãng khác nhau (10°, 10', 10°), cấy trải 100 pl trên môi trường KBA. Sau 2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc (Nguyễn Thị Kim Cúc và ctv, 2014).
2.4.3 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum duoc phan lập từ mẫu bệnh có biểu hiện bệnh mạnh trong quá trình chủng Koch làm cho cây bị thối lá mầm, thân mam không phát triển và thối, rễ dần hóa nâu được lựa chọn dé đánh giá tính đối kháng. Tính đối kháng vi khuẩn của các vi khuẩn phân lập từ đất được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
Nguyên tac: Phương pháp này dựa trên kha năng đối kháng của vi khuẩn đất phân lập với vi khuân bệnh. Vi khuẩn đối kháng có khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn bệnh. Vi khuẩn đối kháng được vi khuẩn bệnh sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.
Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn mẫu nhiên với mỗi dòng vi khuẩn phân lập được là một nghiệm ứng với 1 dia petri.
Mỗi dia thé hiện 3 lần lặp lai của một dòng vi khuẩn phân lập và đối chứng âm.
Với 25 dòng vi khuẩn phân lập từ dat, với 3 lần lặp lai, tong 95 dia petri.
23
Cách tiến hành
Tiến hành bằng phương pháp cấy khuếch tán giếng thạch
Dùng micropipet vô trùng hút 6 yl từ huyền phù vi khuân 8. solanacearum có mật độ đạt 10° CFU/ml cay vào dia petri chứa 20 ml môi trường SPA đã chuan bi san.
Cấy trang bang que cấy tam giác cho dich vi khuan tràn đều trên bề mặt thạch. Chú ý không dé dịch vi khuân dính vào thành dia petri. Đợi 20 - 30 phút cho bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng đường kính khoảng 5 mm khoan 4 16 thạch, loại bỏ phan thạch vừa khoan. Lưu ý dùng que cấy vô trùng có mũi nhọn tách và gạt nhẹ nhàng khỏi thạch, tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh lỗ đục.
Dùng pipet vô trùng hút 6 pl nước cất vào lỗ trung tâm. Tiếp đến hút 6 ul dịch vi sinh vật đối kháng đưa vào 3 lễ khoan còn lại trong đĩa, giữ ở điều kiện nhiệt độ từ 30°C đến 37°C và thời gian từ 48 đến 72 giờ tuỳ thuộc vào loài vi sinh vật cần xác định hoạt tính. Lưu ý trong quá trình chuyên dịch mẫu cần giữ cho các đĩa petri trên mặt phẳng, không dé dich vi sinh vật đối kháng tràn trên bề mặt đĩa thạch.
Vi khuân R. solanacearum
O Vi khuẩn đối kháng
O Nước cất
Hình 2.2 Bồ trí vi sinh vật đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đĩa petri bằng phương pháp cấy khuếch tán giếng thạch
Đọc kết quả: Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng được thê hiện thông qua vòng vô khuẩn (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ khoan chứa dịch vi sinh vật đối kháng) sau 24 giờ được tinh bằng trung bình cộng giá trị kích thước vòng vô khuan của 3 lần lặp lại trên 1 dia petri biéu thị bằng công thức:
Kích thước vòng vô khuẩn (mm) = D - d
Trong đó: D là đường kính vòng vô khuân (mm) d là đường kính lỗ thạch (mm)
Tính kháng khuẩn được biểu hiện khi vòng vô khuẩn rộng hơn 2 mm Kích thước vòng vô khuẩn < 5 mm: tính kháng yếu
Kích thước vòng vô khuẩn từ 5 đến 10 mm: tính kháng trung bình Kích thước vòng vô khuẩn > 10 mm: tính kháng mạnh
2.4.4 Định danh mau vi khuẩn đối kháng trong đất 2.4.4.1 Định danh vi khuẩn theo đặc điểm hình thái
Tiến hành phương pháp định danh vi khuẩn theo Bergey (Gogoi, 2017).
Xác định Gram bằng dung dịch KOH 3%
Nguyên tắc: dựa vào khả năng tạo nhay (kéo sợi) giữ sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuan Gram âm sé bị phân hủy làm giải phóng DNA và tao dịch nhay, còn vi khuẩn
Gram dương không có kéo sợi.
Cách thực hiện: tương tự cách thử KOH trên.
Đánh giá kết quả: ghi nhận khả năng kéo sợi của vi khuẩn.
Xác định Gram của vi khuẩn
Mục đích: phương pháp nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào.
Cách tiến hành: tương tự cách nhuộm Gram trên.
Đánh giá kết qua: Vi khuân Gram âm có màu đỏ hồng, vi khuẩn Gram dương
có màu tím.
25