PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Trichoderma asperellum ĐỐI VỚI TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÂY CÓ NGUỒN GỐC TRONG ĐẤT

Vietnam J Agri Sci 2017, Vol 15, No 12: 1593-1604 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2017, 15(12): 1593-1604 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Trichoderma asperellum ĐỐI VỚI TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÂY CÓ NGUỒN GỐC TRONG ĐẤT Nguyễn Đức Huy1*, Phạm Quang Nguyên2, Nguyễn Thị Thanh Hồng1, Hà Giang3, Nguyễn Văn Viên1, Nguyễn Tất Cảnh1 Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Học viên cao học, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Trung tâm Bệnh nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Email*: ndhuy@vnua.edu.vn Ngày gửi bài: 10.12.2017 Ngày chấp nhận: 16.01.2018 TÓM TẮT Nấm đối kháng, Trichoderma spp., ghi nhận tác nhân phòng chống sinh học chủ yếu để kiểm soát tác nhân gây bệnh hại trồng có nguồn gốc đất có hiệu so với hóa học Trichoderma spp phân bố rộng đất hệ sinh thái vùng rễ trồng Trong nghiên cứu này, chín mẫu đất thu thập từ đất trồng hàng năm lâu năm năm tỉnh miền Bắc Việt Nam để phân lập nấm Trichoderma spp Các mẫu nấm đối kháng xác định dựa vào đặc điểm hình thái phân tử Trên sở phân tích trình tự vùng ITS, mẫu xác định T asperellum mẫu T harzianum Kết nghiên cứu cho thấy T asperellum có tốc độ phát triển nhanh, khả sinh bào tử nhiều loại chất có hiệu đối kháng mạnh tác nhân gây bệnh lở cổ rễ nấm Rhizoctinia solani thối hạch nấm Sclerotinia sclerotiorum điều kiện in vitro Hơn nữa, đánh giá tính an toàn sinh học cho thấy nấm T asperellum an toàn với chuột liều lượng 20 g/kg Nghiên cứu cho thấy nấm T asperellum phân bố phổ biến miền Bắc Việt Nam Từ khóa: Trichoderma asperellum, phịng trừ sinh học, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani Isolation and Evaluation of Antagonistic Ability of Trichoderma asperellum against Soil Borne Plant Pathogens ABSTRACT Antagonistic fungi, Trichoderma spp., have been reported as potential bio-control agents to control soil borne plant pathogens more effectively than chemicals Trichoderma spp were widely spread in soil and rhizospehre of plants In this study, Trichoderma spp were isolated from nine samples of soils cultivated with annual and perennial crops in five different provinces in the North of Vietnam Trichoderma spp were identified based on morphology and molecular characterizations Based on the sequence analysis of ITS region, the results showed that eight isolates were identified as T asperellum and one isolate was T harzianum The results indicated that T asperellum exhibited a high growth rate and high sporulation on three different substrates and strong inhibitory effect against pathogens that cause root rot disease by Rhizoctinia solani and Sclerotinia stem rot by Sclerotinia sclerotiorum in vitro Moreover, biosecurity assessment showed that T asperellum was safe in rats at 20 g/kg Our results revealed that T asperellum is widely distributed in Northern provinces of Vietnam Keywords: Trichoderma asperellum, bio-control, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia nông nghiệp, đa dạng giống trồng với nhiều lồi chủ lực có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên sản xuất nông nghiệp, suất chất lượng trồng bị đe dọa dịch hại, đặc biệt bệnh hại Để bảo vệ suất chất lượng trồng, biện pháp hóa học sử dụng rộng rãi sử dụng nhiều thuốc hóa học tạo tính kháng dịch hại gây nhiễm mơi trường khó phịng trừ nhóm nấm gây bệnh hại trồng có nguồn gốc đất 1593 Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất Chính thế, vi khuẩn nấm đối kháng sử dụng rộng giới Việt Nam để phòng trừ bệnh hại trồng nhằm thân thiện với môi trường phù hợp với sản xuất nông nghiệp theo hướng hữu Trong số vi sinh vật đối kháng, nấm Trichoderma spp sử dụng nhiều phòng trừ bệnh hại trồng giới Việt Nam T viride, T harzianum T hamatum Các loài nấm thuộc chi Trichoderma (Hypocreales, Ascomycota) có phạm vi phân bố rộng khắp đất hệ sinh thái vùng rễ trồng Những nghiên cứu trước cho thấy nấm Trichoderma spp có tác dụng đối kháng chống lại 18 chi 29 lồi nấm gây bệnh cây, loạt vi khuẩn gây bệnh Cơ chế đối kháng Trichoderma spp chủ yếu bao gồm cạnh tranh dinh dưỡng, ký sinh nấm gây bệnh, tạo kháng sinh, tăng sinh tưởng kích thích phản ứng kháng trồng (Harman, 2006) Nhiều lồi Trichoderma spp có tốc độ phát triển nhanh khả đối kháng số loài nấm bệnh hại vùng rễ trồng có nguồn gốc đất nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ (Anees et al., 2010; Asad et al., 2014), Sclerotinia sclerotiorum gây bệnh thối hạch bắp cải (Troian et al., 2014; Zhang et al., 2016), Sclerotium rolfsii gây bệnh héo rũ gốc mốc trắng cà chua, khoai tây, đậu tương, dưa chuột (Kotasthane et al., 2015), Fusarium solani gây bệnh thối gốc thân lạc (Rojo et al., 2007) Một loài nấm đối kháng mới, T asperellum, phát năm gần T asperellum có tốc độ phát triển nhanh, hình thành số lượng bào tử phân sinh lớn có khả đối kháng cao tác nhân gây bệnh thối rễ nấm Pythium myriotylum (Mbaga et al., 2012), bệnh thán thư xoài (Santos-Villalobos et al., 2013), bệnh héo fusarium cà chua (Komy et al., 2015), bệnh héo fusarium dưa chuột thối rễ ngô (Wu et al., 2017) Hơn nữa, T asperellum tiết chitinase, glucanase protease, làm phá hủy vách tế bào nấm ký sinh sợi nấm gây bệnh Ngoài ra, chất xylanases T asperellum tiết có tác dụng làm tính kháng miễn dịch trồng tác nhân gây bệnh (Wu et al., 2017) Trong đất nông nghiệp, nấm Trichoderma có nhiều lồi phân bố rộng vùng sinh thái Ở Việt Nam, trước đây, phân lập giám định nấm Trichoderma spp dựa vào hình thái cho thấy chủ yếu lồi T harzianum T viride Các thử nghiệm phòng ứng dụng ngồi đồng ruộng để phịng trừ nấm gây bệnh hại vùng rễ trồng chủ yếu sử dụng nấm T harzianum T viride (Trần Thị Thuần, 1999; Trần Kim Loang cs., 2009; Nguyễn Văn Viên cs., 2012) Gần đây, nấm T asperelum phát Tây Nguyên (Phạm Ngọc Dung 1594 cs., 2012), Quảng Trị Thừa Thiên Huế (Loc et al., 2011; Trần Thị Thu Hà Phạm Văn Hòa, 2012) Mục đích nghiên cứu nhằm i) thu thập, phân lập xác định nấm Trichoderma spp năm tỉnh phía Bắc Việt Nam dựa vào hình thái kết hợp với giải trình tự gen vùng rDNA-ITS, ii) đánh giá hiệu lực ức chế loài T asperellum lần phát miền Bắc Việt Nam nấm R solani S sclerotiorum iii) đánh giá an toàn sinh học loài T asperellum chuột PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập mẫu đất phân lập nấm Trichoderma spp Các mẫu đất để phân lập nấm Trichoderma spp thu thập độ sâu - 20 cm (300 g/mẫu) xung quanh gốc trồng khỏe đất trồng hàng năm lâu năm năm tỉnh miền Bắc Việt Nam gồm Hà Nội, Hải Dương, Bắc Ninh, Cao Bằng Hịa Bình (Bảng 1) Các mẫu đất đựng túi nilon, dán nhãn, mang phòng thí nghiệm bảo quản 4oC sử dụng Nấm Trichoderma spp phân lập theo phương pháp Kumar et al (2012) Theo đó, mẫu đất pha lỗng lần nước cất vơ trùng Tiếp theo, 0,5 ml dung dịch pha loãng nhỏ lên đĩa môi trường TSM (Trichoderma Specific Medium) Các đĩa ủ 28 ± 2°C 96 Tản nấm khác hình thái cấy chuyển sang môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) Nấm Trichoderma spp giám định sơ dựa vào hình thái Sau cùng, nấm Trichoderma spp phân lập kỹ thuật cấy đơn bào tử sử dụng kim thủy tinh với hỗ trợ kính hiển vi quang học Các mẫu nấm bảo quản 4°C sử dụng trình nghiên cứu 2.2 Định danh nấm Trichoderma spp PCR giải trình tự gen vùng ITS 2.2.1 Chiết DNA giải trình tự gen vùng ITS DNA chiết từ mẫu nấm Trichoderma spp sau ngày nuôi cấy môi trường PDA theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) Doyle & Doyle (1987) Cặn DNA hòa 50 µl đệm TE bảo quản -20oC Phản ứng PCR thực với cặp mồi ITS4 ITS5 (White et al., 1990) để nhân toàn vùng gen ITS mẫu nấm Phản ứng PCR thực với tổng thể tích phản ứng 25 µl 12,5 µl 2x PCR Master mix (INtRON), 0,5 µl mồi ITS5, 0,5 µl mồi ITS4, 0,5 µl DNA khn 11,0 µl dH2O Phản ứng PCR thực theo chu trình: (94oC phút) x chu kỳ, (94o 40 giây, 52o 40 giây, 72oC phút) x 35 chu kỳ, (72oC Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Tất Cảnh phút) x chu kỳ, dừng phản ứng nhiệt độ phòng Sản phẩm PCR tinh chiết từ agarose gel dùng kít tinh chiết thương mại DNA Gel Extraction Kit (NORGEN) theo hướng dẫn nhà sản xuất Hàm lượng DNA ước lượng nồng độ điện di agarose Sản phẩm PCR giải trình tự trực tiếp với cặp mồi dùng phản ứng PCR (ITS4 ITS5) với kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) máy PCR (gửi thực phản ứng giải trình tự hãng Macrogen, Hàn Quốc) 2.2.2 Phân tích trình tự xác định tên lồi nấm Trichoderma spp Dựa trình tự thu được, tìm kiếm sở liệu ngân hàng gen (Genbank) phần mềm trực tuyến BLAST NCBI (the National Center for Biotechnology Information) Trình tự mẫu nấm thu mẫu tương đồng ngân hàng gen sử dụng để phân tích trình tự phả hệ phần mềm BioEdit 7.0, ClustalX2 MEGA 7.0 2.3 Đánh giá hiệu lực đối kháng Trichoderma asperellum nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ nấm Sclerotinia sclerotiorum gây bệnh thối hạch Các nguồn nấm gây bệnh lở cổ rễ (R solani) phân lập từ bắp cải (2 thật) bị bệnh vườn ươm Bảo Thắng, Lào Cai nấm gây bệnh thối hạch (S sclerotiorum) phân lập từ bắp cải giai đoạn đóng bắp Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội Những nguồn nấm phân lập thuần, nuôi cấy bảo quản phịng thí nghiệm Bộ mơn Bệnh cây, Khoa Nông học Học viện Nông nghiệp Việt Nam Nguồn nấm T asperellum xác định Thí nghiệm thiết kế gồm công thức (T) đối chứng (C) Đối chứng, nấm gây bệnh nấm T asperellum cấy riêng rẽ Công thức (T1) nấm gây bệnh nấm T asperellum cấy cách cm, công thức (T2) nấm T asperellum cấy trước nấm R solani (R.s) nấm S sclerotiorum (S.s) 24 công thức (T3) nấm T asperellum cấy sau nấm R solani 24 Mỗi công thức nhắc lại lần theo dõi phát triển nấm T asperellum, R solani S sclerotiorum Thí nghiệm thực theo phương pháp Komy et al (2015) có sửa đổi để phù hợp nghiên cứu Tồn thí nghiệm tiến hành đĩa Petri đường kính 8,0 cm chứa môi trường PDA giữ nhiệt độ 25 ± 2oC - ngày Sự phát triển nấm gây bệnh đo đường kính tản nấm hàng ngày cơng thức thí nghiệm đối chứng Hiệu lực ức chế tính theo cơng thức I = (C-T/C) x 100 Trong đó, I phần trăm hiệu lực hực chế, C đường kính tản nấm gây bệnh công thức đối chứng T đường kính tản nấm cơng thức thí nghiệm 2.4 Đánh giá khả phát triển hình thành bào tử phân sinh nấm Trichoderma asperellum số chất Nấm T asperellum sử dụng nhiều phịng trừ bệnh hại trồng có nguồn gốc đất Để có số lượng sinh khối lớn nấm sản xuất chế phẩm sinh học, nấm T asperellum thường nhân nuôi chất Trong nghiên cứu này, chất sử dụng để khảo sát phát triển hình thành bào tử phân sinh nấm T asperellum bã mía, thóc luộc, bột ngô, trấu - cám gạo vỏ hoa diêm mạch Khả hình thành sinh khối theo dõi sau ngày nuôi cấy đếm số lượng bào tử phân sinh hình thành gam chất sử dụng buồng đếm hồng cầu 2.5 Thử nghiệm tính an toàn sinh học nấm đối khối Trichoderma asperellum Thử nghiệm tính an tồn sinh học nấm đối kháng T asperellum tiến hành chuột nhắt trắng giống Swiss với số lượng 40 con, cân nặng 18 20 gam/con, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Phương pháp thử theo thường quy kỹ thuật Thử nghiệm độc tính cấp Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương VKN/TQKT-DL/03 Tồn thí nghiệm tiến hành Khoa Dược lý, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương 2.6 Xử lý số liệu Số liệu trình bày dạng giá trị trung bình cộng trừ độ lệch chuẩn (mean ± SD) xử lý thống kê phép phân tích biến chiều (one-way ANOVA) với hậu kiểm (post-hoc) Newman-Keuls test xử lý thống kê trắc nghiệm Student sử dụng phần mềm Prism phiên 6.0 (Graph Pad Software) Giá trị P < 0,05 coi có ý nghĩa thống kê KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thu thập mẫu đất để phân lập nấm đối kháng Trichoderma spp năm tỉnh miền Bắc Việt Nam Nấm Trichoderma spp có nhiều đất tự nhiên, nhiều lồi Trichoderma viride, T harzianum, T aperellum, có khả đối kháng lại tác nhân gây bệnh hại trồng có nguồn gốc đất nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Fusarium solani, F oxysporum, Pythium sp., Phytophthora nicotiana Trong nghiên cứu này, chín mẫu đất cánh đồng trồng hàng năm lâu 1595 Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất năm (Bảng 1) thu thập năm tỉnh miền Bắc Việt Nam làm vật liệu để phân lập nấm Trichoderma spp Các mẫu đất thu thập đựng túi nilon, dán nhãn mang phịng thí nghiệm bảo quản điều kiện 4oC sử dụng để phân lập nấm Trichoderma spp Bảng Danh mục mẫu đất thu thập để phân lập nấm Trichoderma spp năm tỉnh miền Bắc Việt Nam Địa điểm thu thập Ký hiệu mẫu Đất trồng Giai đoạn sinh trưởng Năm Số mẫu Vn.01 Gia Lâm, Hà Nội Tỏi thật 2015 01 Vn.02 Lương Sơn, Hịa Bình Mía Vươn lóng 2015 01 Vn.03 Thuận Thành, Bắc Ninh Đậu tương Ra hoa 2015 01 Vn.04 Đông Anh, Hà Nội Cà chua Ra hoa 2015 01 Vn.05 Cao Bằng Diêm mạch thật 2016 01 Vn.06 Gia Lâm, Hà Nội Tỏi thật 2016 01 Vn.07 Kinh Môn, Hải Dương Ổi năm tuổi 2016 01 Vn.08 Đông Anh, Hà Nội Rau cải Sau gieo 20 ngày 2017 01 Vn.09 Võ Cường, Bắc Ninh Cà chua Ra hoa 2017 01 3.2 Kết phân lập nấm đối kháng Trichoderma spp từ mẫu đất thu thập số tỉnh miền Bắc Các mẫu đất sau thu thập phơi khô, nghiền mịn phân lập theo phương pháp Kumar et al (2012) trình bày mục 2.1 Sau cùng, để làm nấm Trichoderma sp., kỹ thuật cấy đơn bào tử sử dụng kim thủy tinh hỗ trợ kính hiển vi quang học kỹ thuật cấy ria sử dụng Kết bước đầu cho thấy mẫu đất thu thập có nấm Trichoderma sp dựa vào đặc điểm hình thái mơi trường PDA (Bảng 2) Quan sát mẫu nấm Trichoderma sp môi trường PDA cho thấy lúc đầu tản nấm có màu trắng, xốp hình thành cành bào tử phân sinh Sau ngày nuôi cấy, tản nấm chuyển dần sang màu xanh, hình thành nhiều bào cành tử phân sinh Bào tử phân sinh nấm có dạng hình cầu hình trứng, bề mặt nhẵn Thể bình có dạng hình trụ Đa số mẫu thu thập hình thành nhiều bào tử phân sinh, sau ngày nuôi cấy đến ngày thứ thứ nấm mọc kín đĩa chuyển mầu xanh hoàn toàn Ngoài ra, quan sát đặc điểm phát triển nấm môi trường PDA, mẫu Vn.Tri08 có đặc điểm phát triển cành bào tử phân sinh mẫu nấm khác so với mẫu nấm cịn lại Vì vậy, dựa vào hình thái khó để định danh tên lồi nấm Trichoderma sp Như vậy, dựa vào đặc điểm phát triển tản nấm môi trường PDA, đặc điểm cành bào tử phân sinh thể bình hình thành sau ni cấy mơi trường PDA, lồi nấm Trichoderma phân lập từ mẫu đất thu thập Tiếp theo, kỹ thuật giải trình tự dựa vùng gen ITS sử dụng để xác định xác tên lồi 3.3 Kết xác định mẫu nấm đối kháng dựa vào giải trình tự gen vùng rDNA-ITS Các mẫu nấm sau xác định Trichoderma sp dựa vào hình thái sử dụng tiếp tục để định danh xác tên lồi dựa vào giải trình tự vùng ITS (internal transcribed spacer) Chiết DNA nấm thực phản ứng PCR mô tả phương pháp nghiên cứu (mục 2.2) Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy tất mẫu Trichoderma sp xuất băng sản phẩm với kích thước khoảng 600 bp (Hình 1) Tám băng sản phẩm PCR cắt gel để tinh DNA giải trình tự gen theo mơ tả mục 2.2 2.3 phần phương pháp nghiên cứu Kết giải trình tự gen cho thấy mẫu nấm có chất lượng trình tự tốt, rõ nét, khơng bị nhiễu trình tự đọc 500 - 550 nts (nucleotides) Các trình tự tìm kiếm Bảng Kết phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp từ mẫu đất thu thập Ký hiệu mẫu Vn.Tri01 Gia Lâm, Hà Nội Vn.Tri02 Lương Sơn, Hòa Bình 1596 Địa điểm thu thập Đặc điểm tản nấm mơi trường PDA Xanh, nhiều BTPS*, thể bình mọc thành chùm - (Hình 3b) Xanh, nhiều BTPS, thể bình mọc thành chùm - Kết phân lập Trichoderma sp Trichoderma sp Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Tất Cảnh Vn.Tri03 Vn.Tri04 Vn.Tri05 Vn.Tri06 Vn.Tri07 Vn.Tri08 Vn.Tri09 Thuận Thành, Bắc Ninh Đông Anh, Hà Nội Cao Bằng Gia Lâm, Hà Nội Kinh Môn, Hải Dương Đông Anh, Hà Nội Võ Cường, Bắc Ninh Xanh, nhiều BTPS, thể bình mọc thành chùm - Xanh, nhiều BTPS, thể bình mọc thành chùm - Xanh, nhiều BTPS, thể bình mọc thành chùm - Xanh, nhiều BTPS, thể bình mọc thành chùm - Xanh, nhiều BTPS¸ thể bình mọc thành chùm - Xanh, nhiều BTPS, thể bình mọc đỗi xứng (Hình 3c) Xanh, nhiều BTPS, thể bình mọc thành chùm - Trichoderma sp Trichoderma sp Trichoderma sp Trichoderma sp Trichoderma sp Trichoderma sp Trichoderma sp Ghí chú: *Bào tử phân sinh Hình Sản phẩm điện di 08 mẫu nấm đối kháng Trichoderma sp Vn.Tri02-Vn.Tri09 Ghi chú: Kích thước sản phẩm PCR khoảng 600 bp Thang DNA kb Mẫu Vn.Tri01 thực Đại học Shimane, Nhật Bản kiếm so sánh với chuỗi tương đồng Ngân hàng Gen (GenBank) sử dụng phần mềm trực tuyến BLAST NCBI Kết tìm kiếm trình tự tương đồng cho thấy trình tự mẫu nấm thu thập chuỗi mã hóa cho vùng gen ITS nấm T asperellum, mẫu nấm T harzianum Phần trăm đoạn so sánh 100% có mức đồng trình tự 99 - 100% với mẫu T asperellum T harzianum (Hình 2) Mẫu Vn.Tri01 thực Đại học Shimane Nhật Bản cho kết T asperellum.Phân tích phả hệ mẫu nấm Trichoderma spp thu thập cho thấy mẫu nấm phân lập tỉnh miền Bắc thuộc cụm T asperellum T harzianum (chữ in đậm hình 2) Nghiên cứu xác định mẫu T asperellum, mẫu T harzianum Trên môi trường PDA, mẫu Vn.Tri08 (T harzianum) có tản nấm phát triển mịn thưa so với tản nấm mẫu Vn.Tri01-07, 09 (T asperellum) (Hình 3a c), thể bình hình thành cành bào tử phân sinh mọc không thành chùm - thể bình T asperellum thường đối xứng (Hình 3b d) Nấm T asperellum phát đất trồng cao su Tây Nguyên (Phạm Ngọc Dung cs., 2012), Quảng Trị, Thừa Thiên Huế (Nguyễn Hoàng Lộc cs., 2011) số tỉnh miền Đông Nam Bộ (mới công bố trình tự Ngân hàng gen, NCBI) Như vậy, nấm T asperellum phân bố phổ biến Việt Nam lần phát đất trồng hàng năm lâu năm số tỉnh thuộc đồng sông Hồng miền núi phía Bắc Việt Nam Chính vậy, nghiên cứu nghiên cứu này, sử dụng mẫu nấm T asperellum Vn.Tri01 3.4 Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma asperellum Trichoderma harzianum Nấm T asperellum nuôi cấy môi trường PDA nhiệt độ 25 ± 2oC, quan sát phát triển nấm, đặc điểm tản nấm, cành bào tử phân sinh bào tử phân sinh Tản nấm T asperellum phát triển nhanh, dầy xốp T harzianum (Hình 3a c), sau - ngày ni cấy, nấm phát triển 9,0 cm hình thành nhiều bào tử phân sinh Thể bình nấm T asperellum mọc đối xứng thành chùm - thể bình đầu cành bào tử phân sinh (Hình 3a) so với T harzianum (Hình 3d) Từ thể bình hình thành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh trịn trịn hình trứng Kích thước bào tử trung bình 2,9 - 3,1 x 2,3 3,3 μm (Hình 3b) Với đặc điểm phát triển nhanh hình thành số lượng bào tử phân sinh lớn, nấm T asperellum ứng dụng để phịng trừ nhiều nấm gây bệnh quan trọng có nguồn gốc đất Để ứng dụng sản xuất, việc thử nghiệm phát triển nấm giá thể để nhân nhanh sinh khối nấm cần thiết 1597 Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất Hình Phân tích phả hệ dựa trình tự tồn vùng ITS mẫu nấm Trichoderma Ghi chú: Trong phả hệ, mẫu nấm Trichoderma Việt Nam in đậm (có ký hiệu Vn.Tri) Cây phả hệ xây dựng phương pháp Neighbor-Joining MEGA 7.0 Giá trị nốt phả hệ giá trị thống kê bootstrap dạng % (1.000 lần lặp) Thanh bar (0,20) thể khoảng cách di truyền Hình Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma asperellum Trichoderma harzianum môi trường PDA Ghi chú: Tản nấm môi trường PDA sau ngày nuôi cấy: a) Trichoderma asperellum c) Trichoderma harzianum Cành bào tử phân sinh, thể bình bào tử phân sinh: b) Trichoderma asperellum d) Trichoderma harzianum Thanh bar 10 µm 3.5 Nghiên cứu phát triển hình thành sinh khối nấm Trichoderma asperellum năm loại giá thể 1598 Nghiên cứu chọn giá thể thích hợp để nhân sinh khối nấm T asperellum phải đảm bảo nguồn chất phải dễ tìm, giá thành rẻ, thuận lợi cho Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Tất Cảnh sinh trưởng, phát triển sinh sản nấm Trong nghiên cứu này, năm loại giá thể: bã mía, vỏ hoa diêm mạch, bột ngô, trấu - cám thóc luộc sử dụng để nhân sinh khối nấm T asperellum (Bảng 3, Hình 4) Kết cho thấy sau - ngày sợi nấm màu trắng phát triển bề mặt giá thể, sau chúng chuyển dần sang màu xanh nhạt (hình thành bào tử phân sinh) màu xanh đậm (lượng bào tử phân sinh hình thành lớn nhất) Giá thể thóc luộc có độ xốp cao, thống khí hàm lượng B1 cao nên mật độ bào tử hình thành cao (7,8 x 109 cfu/g) sau 11 ngày nhân nuôi Tiếp đến giá thể bột ngô trấu cám có mật độ bào tử 7,2 x 108 cfu/g 7,0 x 108 cfu/g Nấm T asperellum không phát triển bã vỏ hoa diêm mạch, nguyên nhân vỏ hoa diêm mạch có chứa chất ức chế phát triển nấm 3.6 Đánh giá hiệu lực đối kháng nấm Trichoderma asperellum nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ Sclerotinia sclerotiorum gây bệnh thối hạch cải bắp Một biện pháp hiệu để phịng trừ nhóm nấm gây bệnh hại trồng có nguồn gốc đất sử dụng vi sinh vật đối kháng Trong nghiên cứu này, nấm T asperellum sử dụng để đánh giá khả ức chế phát triển nấm R solani gây bệnh lở cổ rễ nấm S sclerotiorum gây bệnh thối hạch cải bắp điều kiện in vitro (Bảng 4, Hình 5a-b) Bảng Sự phát triển hình thành bào tử (cfu/g) nấm Trichoderma asperellum năm loại giá thể Giá thể Ngày theo dõi Bã mía Vỏ hoa diêm mạch Bột ngơ Trấu - cám - - - - - - - 2,4 x 104 1,9 x 103 2,3 x 104 1,1 x 102 - 4,5 x 105 4,3 x 106 4,9 x 106 1,8 x 10 - 5,1 x 10 5,3 x 108 2,5 x 10 7,0 x 10 7,8 x 109 11 5,5 x 10 - 7,2 x 10 Thóc luộc Ghi chú: - chưa/không phát triển Bảng Hiệu lực đối kháng nấm Trichoderma asperellum nấm Rhizoctonia solani môi trường PDA Đường k nh tản nấm (mm) Ngày theo dõi Tri R.s Tri R.s HLĐK Tri R.s HLĐK Tri R.s HLĐK 31,0 30,3 35,0 23,0 24,2 35,0 100 29,3 3,40 50,0 56,5 46,3 10,7 81,1 49,3 10,0 82,3 22,0 50,3 11,0 80,0 80,0 74,0 6,0 92,5 71,5 100 34,5 45,5 43,1 - - 80,0 100 80,0 - - 44,0 36,0 55,0 - - - - - - - - 45,0 35,0 56,3 - - - - - - - - 49,0 31,0 61,3 - - - - - - - - 75,0 5,0 93,8 C T1 T2 T3 Ghi chú: HLĐK: Hiệu lực đối kháng, T1: cơng thứ thí nghiêm (nấm T asperellum (Tri) nấm R solani (R.s) cấy thời gian), T2: cơng thức thí nghiệm (nấm Tri cấy trước nấm R.s 24 giờ) T3: công thức thí nghiệm (nấm Tri cấy sau nấm R.s 24 giờ) 1599 Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất Hình Nhân nuôi nấm Trichoderma asperellum năm loại giá thể Ghi chú: a) bã mía, b) vỏ hoa diêm mạch, c) trấu - cám, d) bột ngơ e) thóc luộc Kết cho thấy nấm T asperellum cấy trước sợi nấm R solani ký sinh trực tiếp nấm R solani 24 hiệu đối kháng đạt cao giết chết sợi nấm R solani (100%) sau ngày ni cấy (Bảng 4, Hình 5a) Nấm Cùng với nấm R solani, nấm S sclerotiorum T asperellum lấn át phát triển lan sang nấm R gây bệnh thối hạch nhiều trồng gây thiệt solani Như vậy, xử lý chế phẩm nấm T hại có ý nghĩa kinh tế cải bắp Trong nghiên asperellum đồng ruộng nên xử lý bón cứu này, hiệu lực đối kháng nấm T asperellum vào đất trước gieo hạt/trồng - ngày, nấm thử nghiệm nấm S sclerotiorum T asperellum phát triển ngăn chặn nấm gây (Bảng 5, Hình 5b) Nghiên cứu cho thấy kết bệnh hạt gieo trồng vào đất tương tự, nấm T asperellum cấy trước nấm S cho hiệu phòng trừ bệnh cao Những sclerotiorum 24 liệu lực ức chế đạt 100% sau nghiên cứu trước cho thấy nấm T ngày nuôi cấy Tản nấm T asperellum lấn át asperellum có hiệu đối kháng cao nấm R xâm lấn hết tản nấm S sclerotiorum (Hình 5b) Nghiên solani (Asad et al., 2014; Yang., 2014) Theo đó, T cứu Lopes et al (2012) cho thấy nấm T asperellum tiết enzyme phá hủy vách tế bào asperellum có khả tiêu diệt nấm S sclerotiorum Bảng Hiệu lực đối kháng nấm Trichoderma asperellum nấm Sclerotinia sclerotiorum môi trường PDA Ngày theo dõi 1600 C Tri 31,0 S.s 20,0 Tri 32,0 T1 S.s 24,0 Đường k nh tản nấm (mm) T2 HLĐK Tri S.s HLĐK 30,0 - Tri T3 S.s 20,1 HLĐK 79,9 Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Tất Cảnh 50,0 80 - 48,0 67,0 80 60,0 80 - 20,0 - 58,3 100 - 57,0 80 - 11,0 - 81,1 100 - 38,0 39,5 46,0 43,7 36,3 30,7 46,1 63,7 69,3 - - - - - - - - 64,0 18,3 81,7 Ghi chú: HLĐK: Hiệu lực đối kháng, C: công thức đối chứng (cấy T asperellum (Tri) nấm S sclerotiorum (S.s) riêng T1: cơng thứ thí nghiêm (nấm Tri nấm S.s cấy thời gian), T2: cơng thức thí nghiệm (nấm Tri cấy trước nấm S.s 24 giờ) T3: công thức thí nghiệm (nấm Tri cấy sau nấm S.s 24 giờ) a b Hình a) Khả đối kháng nấm Trichoderma asperellum nấm Rhizoctonia solani môi trường PDA b) Khả đối kháng nấm T asperellum nấm Sclerotinia sclerotiorum môi trường PDA Ghi chú: Từ trái phải, từ xuống dưới: a) đối chứng (nấm R solani), đối chứng (nấm T asperellum), T asperellum cấy trước nấm R solani 24 giờ, T asperellum cấy nấm R solani T asperellum cấy sau nấm R solani 24 giờ; b) đối chứng (nấm T asperellum), đối chứng (nấm S sclerotiorum), T asperellum cấy trước nấm S sclerotiorum 24 giờ, T asperellum cấy sau nấm S sclerotiorum 24 T asperellum cấy nấm S sclerotiorum 3.7 Đánh giá an tồn sinh học nấm Trichoderma Thí nghiệm thực chuột nhắt trắng asperellum chuột mô tả phương pháp nghiên cứu Kết thí nghiệm trình bày bảng Căn vào kết đánh giá hiệu lực đối kháng nấm T asperellum hai nấm R solani S Kết theo dõi khối lượng trung bình sclerotiorum cho thấy hiệu lực đối kháng đạt 100% chuột trình thử nghiệm ngày cho thấy: (Bảng 4, 5) Các nghiên cứu giới cho Trước uống mẫu thử, khối lượng trung bình thấy T asperellum có khả tiêu diệt nhiều nấm chuột khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê so bệnh hại trồng có nguồn gốc đất Như vậy, với so với nhóm đối chứng (PANOVA trước > ứng dụng T asperellum để phòng trừ nhiều 0,05; P (T-C) trước > 0,05; P (T-T) trước > 0,05) Sau uống bệnh nấm hại trồng quan trọng sản xuất mẫu thử ngày, chuột nhóm đối chứng nhóm Khi ứng dụng sản xuất, việc đánh giá an toàn thử tăng cân Có khác sinh học nấm động vật cần thiết Bảng Kết so sánh khối lượng chuột nhóm đối chứng nhóm thử nghiệm cho uống nấm đối kháng Trichoderma asperellum Nhóm Đối chứng (C) Thử (T1) Trước thử nghiệm Khối lượng (g) Ptrước thử nghiệm 20,8 ± 0,8 PANOVA > 0,05 20,4 ± 0,6 PT1-C > 0,05 PT1-T2 > 0,05 PT1-T3 > 0,05 Sau thử nghiệm Khối lượng (g) Psau thử nghiệm 31,9 ± 1,8 PANOVA > 0,001 30,4 ± 1,9 PT1-C > 0,05 PT1-T2 > 0,05 PT1-T3 < 0,001 Tăng khối lượng (%) 153,6 149,4 P < 0,001 P < 0,001 Ptrước-sau Thử (T2) 20,7 ± 0,8 PT2-C > 0,05 PT2-T3 > 0,05 30,6 ± 1,9 PT2-C > 0,05 PT2-T3 < 0,001 147,5 P < 0,001 Thử (T3) 20,5 ± 0,8 PT3-C > 0,05 30,1 ± 2,5 PT3-C < 0,001 129,3 P < 0,001 khác biệt có ý nghĩa thống kê khối lượng chuột so sánh với trước thử nghiệm nhóm (Ptrước-sau < 0,001) Đồng thời có khác biệt có ý nghĩa thống kê cân nặng trung bình sau thử 1601 Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất nghiệm nhóm thử liều cao so với nhóm liều thấp so với nhóm đối chứng (PANOVA sau < 0,001; P (T3-C) sau < 0,001; P (T3-T1) sau < 0,001, P (T3-T2) sau < 0,001) Khơng có khác biệt cân nặng trung bình nhóm thử liều thấp (T2 T3) với so với nhóm đối chứng (P (T-C) sau > 0,05; P (T2-T3) sau > 0,05) Như vậy, cho chuột uống mẫu thử với mức liều 10 g 20 g mẫu thử/kg chuột không nhận thấy biểu khác thường so với nhóm đối chứng, khơng nhận thấy có biểu ngộ độc chuột thí nghiệm thời gian theo dõi Tất chuột ăn uống, hoạt động bình thường KẾT LUẬN Đã xác định hai loài nấm đối kháng T asperllum T harzianum dựa vào đặc điểm hình thái trình tự vùng gen ITS Nấm T asperllum phân bố phổ biến miền Bắc Việt Nam Nấm T asperllum phát triển nhanh hình thành sinh khối bào tử phân sinh nhiều chất thóc luộc (7,8 x 109 cfu/g), bột ngô (7,2 x 108 cfu/g) trấu cám (7,0 x 108 cfu/g) Nấm T asperllum có khả ức chế tốt phát triển nấm R solani gây bệnh lở cổ rễ nấm S sclerotiorum gây bệnh thối hạch bắp cải điều kiện invitro, mức độ ức chế 100% sau - ngày nuôi cấy) Nấm T asperellum an toàn chuột liều lượng 20 g chế phẩm/kg chuột LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tài trợ đề tài trọng điểm cấp Học viện mã số T2015-01-01TĐ Chúng xin chân thành cảm ơn GS TS Makoto Ueno, Trường đại học Shimane, Nhật Bảnđã giúp đỡ xác định mẫu Vn.Tri01 Khoa Dược lý, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương hỗ trợ kỹ thuật đánh giá tính an tồn sinh học nấm T asperellum chuột TÀI LIỆU THAM KHẢO Anees M., Tronsmo A., Edel-Hermann V., Hjeljord L.G., Héraud C and Steinberg C (2010) Characterization of field isolates of Trichoderma antagonistic against Rhizoctonia solani Fungal Biol., 114(9): 691-701 Asad S.A., Ali N., Hameed A., Khan S.A., Ahmad R., Bilal M., Shahzad M and Tabassum A (2014) Biocontrol efficacy of different isolates of Trichoderma against soil borne pathogen Rhizoctonia solani Pol J Microbiol., 63(1): 95-103 1602 Doyle J.J and Doyle J.L (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull., 19: 11-15 Harman G.E (2006) Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp Phytopathol., 96: 190-194 Komy M.H.E., Saleh A.A., Eranthodi A and Molan Y.Y (2015) Characterization of Novel Trichoderma asperellum Isolates to Select Effective Biocontrol Agents Against Tomato Fusarium Wilt Plant Pathol J., 31(1): 50-60 Kotasthane A., Agrawal T., Kushwah R and Rahatkar O.V (2015) In-vitro antagonism of Trichoderma spp against Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani and their response towards growth of cucumber, bottle gourd and bitter gourd European J of Plant Pathol., 141(3): 523-543 Kumar K., Amaresan N., Bhagat S., Madhuri K and Srivastava R.C (2012) Isolation and Characterization of Trichoderma spp for Antagonistic Activity Against Root Rot and Foliar Pathogens Indian J Microbiol., 52(2): 137-144 Lopes F.A., Steindorff A.S., Geraldine A.M., Brandão R.S., Monteiro V.N., Lobo M Jr., Coelho A.S., Ulhoa C.J and Silva R.N (2012) Biochemical and metabolic profiles of Trichoderma strains isolated from common bean crops in the Brazilian Cerrado, and potential antagonism against Sclerotinia sclerotiorum Fungal Biol., 116(7): 15-24 Mbarga J.B., Hoopen G.M.T, Kuaté J., Adiobo A., Ngonkeu M.E.L., Ambang Z., Akoa A., Tondje P.R and B.A.D Begoude (2012) Trichoderma asperellum: A potential biocontrol agent for Pythium myriotylum, causal agent of cocoyam (Xanthosoma sagittifolium) root rot disease in Cameroon Crop Protection, 36: 18-22 Nguyen Hoang Loc, Hoang Tan Quang, Nguyen Bao Hung, Nguyen Duc Huy, Truong Thi Bich Phuong and Tran Thi Thu Ha (2011) Trichoderma asperellum Chi42 Genes Encode Chitinase Mycobiology, 39(3): 182-186 ùi V n Công (2012) sả x ất sử dụ c ế p ẩm ấm đố k Trichoderma viride p ò trừ số bệ ấm ù r câ khoai tây, lạc đậ tươ ạp c í K oa ọc P át tr ể , 10(1): 95-102 P ạm ọc ết ao a r oa (2012) sử dụ ấm đố k Trichoderma asperellum p ò trừ ấm Phytophthora spp â bệ tr câ cao s ạp c í Bảo ệ t ực ật ộ ô ệp P át tr ể ô t ô 12 Rojo F.G., Reynoso M.M., Ferez M and Chulze S.N (2007) Biological control by Trichoderma species Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Tất Cảnh of Fusarium solani causing peanut brown root rot under field conditions Crop Protection., 26(4): 549-555 Santos-Villalobos S., Guzmàn-Ortiz D.A., Gomez-Lim M.A., Délano-Frier J.P., de-Folter S., SànchezGaría P and Pa-Cabriales J.J (2013) Potential use of Trichoderma asperellum (Samuels, Liechfeldt et Nirenberg) T8a as a biological control agent against anthracnose in mango (Mangifera indica L.) Biol Control., 64: 37-44 r m oa ô a am ô â ế r (2009) P ò trừ bệ ấm P top t ora tr câ t bằ c ế p ẩm s ọc Trichoderma (Trico) tạ â ạp chí chuyên ngành BVTV, 2: 22-27 r P ạm a òa (2012) ả đố k ấm Trichoderma ấm bệ câ tr Sclerotium rolfsii Sacc đ ề k ệ in vitro ạp c í K oa ọc ọc ế, 6: 75 r (1999) P ươ p áp sả x ất sử dụ c ế p ẩm ấm T viride để p ò trừ bệ câ tr ạp c í ảo ệ t ực ật tr 33 - 34 Troian R.F., Steindorff A.S., Ramada M.H., Arruda W and Ulhoa CJ (2014) Mycoparasitism studies of Trichoderma harzianum against Sclerotinia sclerotiorum: evaluation of antagonism and expression of cell wall-degrading enzymes genes Biotechnol Lett., 36(10): 2095-101 White T.J., Bruns T., Lee S and Taylor J.W (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, editor PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications New York: Academic Press Inc., pp 315-322 Wu Q., Sun R., Ni M., Yu J., Li Y., Yu C., Dou K., Ren J., and Chen J (2017) Identification of a novel fungus, Trichoderma asperellum GDFS1009, and comprehensive evaluation of its biocontrol efficacy PLoS One 12(6): e0179957 Yang P (2014) Antagonism of Trichoderma asperellum against Rhizoctonia solani Advanced Materials Res., pp 955-959 : 775-778 Zhang F., Ge H., Zhang F., Guo N., Wang Y., Chen L., Ji X and Li C (2016) Biocontrol potential of Trichoderma harzianum isolate T-aloe against Sclerotinia sclerotiorum in soybean Plant Physiol Biochem., 100: 64-74 1603 ... cám - - - - - - - 2,4 x 10 4 1, 9 x 10 3 2,3 x 10 4 1, 1 x 10 2 - 4,5 x 10 5 4,3 x 10 6 4,9 x 10 6 1, 8 x 10 - 5 ,1 x 10 5,3 x 10 8 2,5 x 10 7,0 x 10 7,8 x 10 9 11 5,5 x 10 - 7,2 x 10 Thóc luộc Ghi chú: -... HLĐK Tri R.s HLĐK 31, 0 30,3 35,0 23,0 24,2 35,0 10 0 29,3 3,40 50,0 56,5 46,3 10 ,7 81, 1 49,3 10 ,0 82,3 22,0 50,3 11 ,0 80,0 80,0 74,0 6,0 92,5 71, 5 10 0 34,5 45,5 43 ,1 - - 80,0 10 0 80,0 - - 44,0... PANOVA > 0,0 01 30,4 ± 1, 9 PT1-C > 0,05 PT1-T2 > 0,05 PT1-T3 < 0,0 01 Tăng khối lượng (%) 15 3,6 14 9,4 P < 0,0 01 P < 0,0 01 Ptrước-sau Thử (T2) 20,7 ± 0,8 PT2-C > 0,05 PT2-T3 > 0,05 30,6 ± 1, 9 PT2-C