Phân lập nhận diện Agrobacterium rhizogenes có khả cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn

Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 Phân lập nhận diện Agrobacterium rhizogenes có khả cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn (Catharanthus roseus) in vivo  Nguyễn Nhƣ Nhứt Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG–HCM- Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường, Bình Dương  Bùi Văn Lệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG–HCM (Nhận ngày 25 tháng 07 năm 2016, đăng ngày 10 tháng 04 năm 2017) TÓM TẮT Agrobacterium rhizogenes loài vi khuẩn ứng dụng rộng rãi kỹ thuật chuyển gene vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo thành rễ tơ Tổng cộng phân lập 274 dòng khuẩn lạc khác môi trường chọn lọc MG-Te từ 235 mẫu đất khác Trong có mười ba dịng có đặc điểm hình thái, sinh hóa bệnh học thuộc lồi A rhizogenes có khả cảm ứng tạo thành rễ tơ dừa cạn in vivo Các dịng nhận diện thuộc lồi A rhizogenes giải trình tự 16S rRNA có mang gene rolABC plasmid chúng Kết nghiên cứu cho thấy A rhizogenes diện phổ biến đất vùng rễ trồng Việt Nam giúp làm phong phú thêm công cụ chuyển gene cho nghiên cứu rễ tơ dừa cạn tương lai Từ khóa: Agrobacterium rhizogenes, Dừa cạn, họ đậu, phân lập, rễ tơ MỞ ĐẦU Rễ tơ (hairy root) hình thành thực vật bị Agrobacterium rhizogenes xâm nhiễm vào vết thương Vi khuẩn chuyển phần gene vào tế bào thực vật chủ làm cho tế bào phát sinh thành rễ gọi rễ tơ Hiên nay, nuôi cấy rễ tơ kỹ thuật đầy tiềm sản xuất hợp chất thứ cấp từ thực vật Trong đó, rễ tơ Dừa cạn (Catharanthus roseus) ngồi giúp sản xuất alkaloid có hoạt tính cao chữa trị ung thư người mà sử dụng cơng cụ mơ hình để nghiên cứu đường sinh tổng hợp alkaloid [1] Các báo cáo trước cho thấy khả sinh tổng hợp alkaloid thay đổi dòng rễ tơ khác từ Dừa cạn Mặc dù chưa có nghiên cứu báo cáo, thay đổi cho có khác số lượng vị trí chèn gene A rhizogenes vào gen thực Trang 48 vật chủ [3] Cho đến nay, nhiều nghiên cứu cho thấy nguyên nhân dẫn đến đa dạng rễ tơ khác chủng A rhizogenes điều kiện chuyển gene vào tế bào thực vật chứng minh tạo thành dòng rễ tơ [14, 15] Mặc dù xem công cụ chuyển gene hiệu quả, nghiên cứu sử dụng vài chủng A rhizogenes định loài vi khuẩn diện khắp nơi đất [8, 12, 15] Một số báo cáo cho thấy A rhizogenes hoang dại có khả chuyển gene cao vài loài thực vật chủ [9, 10, 16] Do đó, nghiên cứu thực nhằm vào việc thu nhận chủng A rhizogenes có đất vùng rễ số loại trồng làm công cụ cho kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ dừa cạn sau TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Mẫu đất mẫu thực vật in vivo Các mẫu đất vùng rễ số loại trồng thu từ tỉnh thành Long An, Tiền Giang, Bình Dương thành phố Hồ Chí Minh Đất lấy vùng rễ có độ sâu khoảng 10–15 cm Mẫu sử dụng để phân lập mẫu trộn chung đất lấy từ điểm khác ruộng Mỗi mẫu khoảng 100 g chứa túi nylon vô trùng Mẫu bảo quản kín thùng lạnh 8–10 oC Cây đậu đen Dừa cạn in vivo sử dụng làm thực vật chủ để nhận dạng sàng lọc chủng vi khuẩn phân lập có khả gây cảm ứng tạo rễ tơ Tám giống thực vật chủ gồm bốn giống họ đậu [đậu đen (Vigna cylindrica), đậu nành (Glycine max), đậu phộng (Arachis hypogaea) đậu xanh (Vigna radiata)] bốn giống dừa cạn (Catharanthus roseus VIN002, VIN005, VIN072 VIN077) công ty FVN cung cấp Hạt giống gieo khay chuyên dùng để ươm giống đặt nhà lưới Phân lập Các chủng Agrobacterium có đất phân lập theo Wang [15] José [8 ] cách sử dụng môi trường MG-Te bán chọn lọc Agrobacterium Cho 0,5 mL nước cất vô trùng vào 0,5-1,0 g mẫu đất để yên 30 phút cho mẫu mềm Sau đó, pha lỗng mẫu nước cất vơ trùng Cho 50-100 µL mẫu thành dạng vết mơi trường MG-Te Ủ Ở 28 oC 3-4 ngày (do tellurite có xu hướng làm giảm tốc độ tăng trưởng Agrobacterium) Sau đó, tách lấy khuẩn lạc riệng lẻ đặc trưng Agrobacterium có dạng trịn với màu đen có ánh kim để tiếp tục làm thêm bước Các chủng vi khuẩn thu nhận dạng dựa đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa, khả gây bệnh rễ tơ đậu đen dừa cạn Sau chủng nhận diện cách giải trình tự DNA Nhận diện Agrobacterium kiểm tra đặc điểm hình thái sinh hóa Agrobacterium rhizogenes nhận diện theo mô tả George [6], Emanuel Lorrence [4], Murugesan et al [12], José [8] Theo đó, dịng khuẩn lạc đặc trưng kiểm tra khả phát triển môi trường 2E-Te (không bổ sung Te) nhằm loại bỏ dòng khuẩn lạc thuộc loài khác giống Agrobacterium (José, [8]) Các dòng khuẩn lạc phát triển 2E-Te tiếp tục kiểm tra hình thái sinh hóa đặc trưng Agrobacterium theo Emanuel Lorrence [4], hình dạng tế bào, nhuộm Gram, khả phát triển môi trường TSA, lên men glucose sinh acid môi trường TSI, oxidase khả phát triển môi trường MacConkey Agar (MAC) Các dòng thu được kiểm tra khả bắt màu với Congo red môi trường Yeast Extract Mannitol Agar (YEMA), phát triển môi trường kiềm pH 11 Hofer‟s agar khả tổng hợp 3-ketolactose theo Murugesan et al [12] Ngoài ra, chủng vi khuẩn đánh giá khả sinh tổng hợp curdlan, khả phát triển số môi trường thạch peptone glucose, potato glucose agar (PGA), mơi trường có nồng độ muối cao khả di động theo George [6] Tất dòng mang đặc tính phù hợp với A rhizogenes ni cấy bảo quản môi trường thạch Yeast Mannitol Broth (YMB) Nhận diện A rhizogenes xét nghiệm bệnh học Các dịng vi khuẩn có đặc điểm phù hợp với A rhizogenes xác nhận dựa khả gây bệnh rễ tơ in vivo theo phương pháp báo cáo Janse J D [7], Georgina et al [5], Kereszt et al [9], Manijeh et al [11], có biến đổi Sau nẩy mầm ngày, đậu tạo vết thương trụ mầm dao mổ sau cho nhiễm với sinh khối vi khuẩn trích từ khuẩn lạc thu sau ni cấy ngày môi Trang 49 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 trường thạch YMB Theo dõi hình thành rễ tơ sau tuần gây nhiễm Mỗi nghiệm thức lặp lại 10 lần, lần 100 Đối chứng thực tương tự vi khuẩn Khả xâm nhiễm gây bệnh tạo rễ tơ chủng vi khuẩn đánh giá thơng qua tỷ lệ có biểu triệu chứng rễ tơ (%) tính số lượng có rễ tơ xuất hiện/tổng số gây nhiễm Sàng lọc A rhizogenes có khả cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn Với Dừa cạn in vivo, sau nẩy mầm 7– tuần gây nhiễm tương tự họ đậu Vị trí gây nhiễm đoạn thân cặp thật thứ nhất, thứ hai thứ ba tùy theo đường kính đốt thân Sự hình thành rễ tơ ghi nhận sau 3–4 tuần gây nhiễm Xác nhận A rhizogenes giải trình tự gene 16S ribosome RNA xác định diện gene rol Các dịng vi khuẩn có khả cảm ứng tạo rễ tơ dừa cạn tiếp tục xác nhận kỹ thuật sinh phân tử thông qua giài trình tự gene 16S ribosom DNA diện gene rol đặc trưng cho A rhizogenes RNA 16S ribosom tách chiết kit QIAgen Trình tự 16S rRNA khuếch đại phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự 27F (5‟-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3‟) 1492R (5‟-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3‟) Sản phẩm PCR tinh chế gửi giải trình tự Các trình tự nucleotide hồn chỉnh BLAST ngân hàng liệu gene NCBI Plasmid DNA vi khuẩn tách chiết phương pháp CTBA Các gene rolA, rolB rolC plasmid khuếch đại cặp mồi có trình tự rolAF (5‟-CGT TGT CGG AAT GGC CCA GAC C-3‟), rolAR (5‟-CGT Trang 50 AGG TCT GAA TAT TCC GGT CC-3‟), rolBF (5‟GCT CTT GAC GTG CTA GAT TT-3‟), rolBR (5‟GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-3‟), rolCF (5‟CTC CTG ACA TCA AAC TCG TC-3‟) rolCR (5‟-TGC TTC GAG TTA TGG GTA CA-3‟) Sản phẩm PCR nhận diện cách điện di gel agarose % với đệm TAE 1X Phát gene gel cách ngâm dung dịch ethidium bromide chụp đèn UV Xử lý số liệu Số liệu thu từ kết thí nghiệm xử lý thống kê phần mềm SPSS (version 20.0) trình bày dạng số trung bình KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập A rhizogenes Từ 235 mẫu thu (Bảng 1), sau phân lập môi trường chọn lọc MG-Te, kết quan sát cho thấy quần thể vi khuẩn mục tiêu diện mẫu sau 4–5 ngày ủ 25oC Các khuẩn lạc vi khuẩn xuất rời rạc với số lượng thấp tương tự báo cáo José [5] Có mẫu có dạng khuẩn lạc khác nhau, nhưng, đa số mẫu có dạng khuẩn lạc Một số mẫu khác có dạng khuẩn lạc khác Ngồi cịn có số mẫu khơng thấy có diện khuẩn lạc (chủ yếu mẫu đất vùng rễ lúa, đậu bắp đậu que) Dạng thứ với khuẩn lạc tròn lồi, mép liền, bóng, màu đen ánh kim, đường kính khuẩn lạc nhỏ mm (Hình 1) Dạng khuẩn lạc thứ hai tương tự có đường kính trung bình lớn hơn, 2–3 mm Dạng thứ ba chiếm đa số với khuẩn lạc trịn lồi, bóng nhầy, có ánh kim, tâm khuẩn lạc có màu đen, vùng ngồi màu đen nhạt suốt có đường kính trung bình 2–3 mm Cả ba dạng khuẩn lạc có mặt ph ng, khơng ăn sâu khơng tiết sắc tố vào mơi trường TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 Bảng Kết phân lập Agrobacterium môi trường MG-Te Ký hiệu mẫu đất Số mẫu đất Đặc điểm mẫu Số dòng khuẩn lạc DHa1→30 30 Đất vùng rễ dưa hấu Dạng khuẩn lạc DLe1→20 20 Đất vùng rễ dưa leo 16 24 ĐBa1→35 35 Đất vùng rễ đậu bắp 17 28 ĐĐe1→5 Đất vùng rễ đậu đen 10 ĐĐu1→18 18 Đất vùng rễ đậu đũa 12 27 ĐNa1→10 10 Đất vùng rễ đậu nành 14 ĐPh1→30 30 Đất vùng rễ đậu phộng 23 30 62 ĐQu1→25 25 Đất vùng rễ đậu que 0 0 ĐXa1→22 22 Đất vùng rễ đậu xanh 18 19 44 Lua1→40 40 Đất vùng rễ lúa nước 12 26 43 84 147 274 Tổng cộng 235 Dạng Dạng Dạng khuẩn lạc Dạng khuẩn lạc 29 Tổng cộng 39 Dạng Hình Ba dạng khuẩn lạc khác môi trường MG-Te mang đặc trưng Agrobacterium A B C D Trang 51 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 E F I G J K H L Hình Minh họa số kiểm tra hình thái sinh hóa A rhizogenes A: phát triển mơi trường 2E-Te có erythritol nguồn carbon sau ngày nuôi cấy; B: nhuộm Gram; C: phát triển môi trường TSA sau ngày nuôi cấy; D: phản ứng oxidase; E: khả chuyển hóa lactose thành 3-ketolactose (màu vàng dương tính); F: phát triển trên môi trường Hofer‟s pH 11; G: phát triển bắt màu sinh khối với thuốc thử Congo môi trường YEMA; H: phát triển môi trường PGA; I: khả tổng hợp curdlan (màu xanh dương tính); J: khả di động; K: phát triển môi trường TSI sau ngày nuôi cấy L: phản ứng catalase Trong giống Agrobacterium, có A rhizogenes có khả sử dụng erythritol làm nguồn carbon [15] Kết kiểm tra cho thấy số 274 dòng khuẩn lạc phân lập có 64 dịng có khả phát triển môi trường 2E-Te với erythritol nguồn carbon Các dòng khuẩn lạc tiếp tục kiểm tra đặc tính hình thái, sinh lý sinh hóa đặc trưng cho giống Agrobacterium theo Emanuel Lorrence [4] thu 59 dịng khuẩn lạc có đặc điểm phù hợp với giống Agrobacterium Gram âm, hình que ngắn dài, phát triển tốt môi trường TSA, không phát triển môi trường MAC, không lên men glucose sinh acid môi trường TSI sau 24 Tuy nhiên, Rhizobium có đặc điểm tương tự với Agrobacterium [4] Agrobacterium phân biệt với Rhizobium thông qua đặc điểm có khả chuyển hóa tạo thành 3-ketolactose từ lactose mơi trường Lactose agar Agrobacterium, có khả Trang 52 bắt màu đỏ với thuốc thử Congo môi trường YEMA, phát triển môi trường Hofer‟s có pH 11 Ngồi ra, khả chuyển hóa lactose thành 3-ketolactose Murugesan cộng [4] ứng dụng để nhận diện A rhizogenes khỏi rhizobium loài khác giống Agrobacterium Dựa vào kiểm tra sinh hóa thu 34 dịng có đặc điểm phù hợp với A rhizogenes Cả 34 dòng thu cho thấy phát triển tốt mơi trường PGA, mơi trường thạch glucose peptone, có khả di động, dương tính với catalase mơ tả khóa phân loại Bergey năm 2004 có 19 dịng có khả tổng hợp polysaccharide ngoại bào dạng curdlan Nhận diện A rhizogenes xét nghiệm bệnh học in vivo Hiện nay, khả gây bệnh thực vật sử dụng đặc điểm TAÏP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 để nhận diện đến loài chủng Agrobacterium [4, 14, 15] A rhizogenes nhận dạng thông qua khả xâm nhiễm vào vết thương gây cảm ứng hình thành rễ tơ vị trí nhiễm Thơng thường nhận diện khả gây bệnh Agrobacterium thực hai nhiều loài thực vật chủ khác (Burr Katz, 1983) Các họ đậu dễ dàng bị bệnh rễ tơ xâm nhiễm A rhizogenes biểu bệnh (Hình 3) rõ ràng lồi khác [2, 5, 9, 16] nên chúng sử dụng mơ hình nghiên cứu chức gene rễ tơ Do đó, nghiên cứu này, dòng vi khuẩn thu được tiếp tục nhận diện dựa khả gây bệnh rễ tơ bốn loài họ đậu khác nhằm sàng lọc dịng có khả Dựa số liệu thu cho thấy số 34 dòng sau nhận dạng kiểm tra hình thái sinh hóa có 14 dịng (chiếm 41,2 %) có khả gây triệu chứng rễ tơ họ đậu sau 10 ngày xâm nhiễm Trong đó, dịng C04 khơng có khả xâm nhiễm đậu xanh, dịng C09 khơng có khả xâm nhiễm đậu phộng đậu xanh dịng C24 khơng có khả xâm nhiễm đậu nành (Bảng 2) Các dòng A rhizogenes hoang dại phân lập có khả xâm nhiễm gây bệnh rễ tơ đậu nành với tỷ lệ đáp ứng 1–21 %, chủng A rhizogenes K599 hoang dại gây đáp ứng đến 100 % [16] Trong bốn loài đậu sử dụng, đậu đen có đáp ứng bệnh rễ tơ với 14 dòng tỷ lệ có biểu nhìn chung cao so với ba lồi họ đậu cịn lại (tỷ lệ đáp ứng dao động từ 25 % đến 76 %) Dựa vào kết giúp sàng lọc 14 dòng vi khuẩn phân lập có khả cảm ứng tạo rễ tơ Ngoài ra, kết cho thấy đậu đen thích hợp đậu nành, đậu xanh đậu phộng sàng lọc nhận diện A rhizogenes Trang 53 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 Hình Minh họa xuất triệu chứng rễ tơ đậu đen (trái) đậu phộng (phải) in vivo mười ngày sau gây nhiễm với dòng vi khuẩn C18 phân lập Bảng Khả xâm nhiễm gây bệnh rễ tơ họ đậu dòng vi khuẩn phân lập Dòng Dạng khuẩn lạc C02 C04 C05 C09 C10 C12 C15 Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Trang 54 Đậu đen 25h 46def 54cd 38fg 52cde 43efg 59bc Tỷ lệ có biểu triệu chứng rễ tơ (%) Đậu nành Đậu phộng 9cde 31c 13bc 8d a 21 65a 2f 0d f 50b 7cdef 46b def 8d Đậu xanh 14fgh 0i 12gh 0i 27cde 40b 34bcd TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng 67ab 48de 50cde 54cd 76a 70a 35g 1f 3ef 0f 21a 18ab 2ef 13bcd 50b 49b 24c 65a 4d 8d 2d 54a 37bc 37bc 12gh 6hi 21efg 24def Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 Sàng lọc A rhizogenes có khả cảm ứng rễ tơ cây Dừa cạn in vivo Trong thời gian gần đây, thông qua rễ tơ chuyển gene A rhizogenes, dừa cạn (Catharanthus roseus) xem mơ hình cho nghiên cứu in vitro chức gene liên quan đến đường biến dưỡng alkaloid thực vật Ngồi ra, ni cấy rễ tơ từ dừa cạn xem hướng có tiềm sản xuất alkaloid có hiệu cao điều trị nhiều bệnh ung thư người Tuy nhiên, hiệu cảm ứng tạo rễ tơ A rhizogenes vào tế bào thực vật nói chung phụ thuộc nhiều yếu tố [15] Trong đó, chủng A rhizogenes phân lập từ nguồn khác có khả cảm ứng [13] Các số liệu thu sau ba tuần gây nhiễm cho thấy có 13 dịng số 14 dịng vi khuẩn sàng lọc có khả gây xâm nhiễm bệnh rễ tơ bốn giống dừa cạn VIN002, VIN005, VIN072 VIN077 (Bảng 3) Dòng C05 hồn tồn khơng gây đáp ứng bốn giống dừa cạn Biểu đáp ứng dừa cạn dễ dàng nhận biết họ Đậu (Hình 4) So với họ Đậu (Bảng 2), nhìn chung, tỷ lệ đáp ứng dừa cạn cao với thời gian xuất rễ tơ dài kể từ gây nhiễm Kết cho thấy có tương đồng với nghiên cứu in vitro in vivo, dòng vi khuẩn khác có khả cảm ứng tạo rễ tơ khác giống dừa cạn với dịng vi khuẩn khả cảm ứng tạo rễ tơ khác giống dừa cạn Trang 55 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 VIN002 VIN005 VIN072 VIN077 Hình Minh họa đáp ứng bốn giống Dừa cạn in vivo xâm nhiễm dòng C18 phân lập sau tuần gây nhiễm Bảng Khả xâm nhiễm gây bệnh rễ tơ Dừa cạn in vivo dòng vi khuẩn phân lập Chủng Dạng khuẩn lạc C02 C04 C05 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng VIN002 cd 44 35ef 0i 33fg 42cd 67a 46cd 47bc 0i 15h 40de 16h 53b 28g Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 Nhận diện A rhizogenes kỹ thuật sinh học phân tử Trang 56 Tỷ lệ có xuất triệu chứng rễ tơ (%) VIN05 VIN072 cd d VIN077 43 38 16ef cde f 37 26 9gh 0i 0j 0i 41cd 19g 27c fg c 25 48 19de 44c 33e 39b cde j 38 10fgh 61b 81a 48a ef h 31 13 0i 11h 6i 10fg a b 69 59 49a 18gh 13h 3hi cd j 42 23cd 36de 16gh 20de Dự kết kiểm tra hình thái, sinh hóa bệnh học, kết sàng lọc 13 dịng có đặc điểm nhận diện phù hợp với loài A rhizogenes chúng có khả cảm ứng tạo rễ tơ dừa cạn Kết giải trình tự gen 16S rRNA chúng cho thấy dòng vi khuẩn thu có độ tương đồng cao với lồi A rhizogenes (Bảng 4) Ngồi ra, TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 kết xác định diện gene rol có plasmid Ri đặc trưng cho A rhizogenes cho thấy 13 dịng thu có chứa gene rolABC (Hình 5) Bảng Kết so sánh bắt cặp đoạn gene 16s ribosome ngân hàng liệu NCBI nhận diện gene rolABC 13 chủng vi khuẩn có khả tạo rễ tơ dừa cạn Trình tự 16S ribosom DNA Lồi tương đồng Độ tương đồng Dòng C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes rolA A Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có 99% 100% 100% 100% 99% 99% 99% 100% 99% 99% 99% 100% 99% Sự diện gen rol B C Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có rolB rolC Đối chứng Hình Kết phân tích PCR xác nhận diện gene rolABC plasmid mười ba dòng vi khuẩn sàng lọc rolA, rolB rolC: Xác nhận diện gene rol; giếng từ trái sang phải tương ứng với dòng vi khuẩn C02, C04, C09, C10, C12, C15, C18, C20, C24, C26, C29, C32, C34 thang chuẩn; Đối chứng: giếng từ trái sang phải tương ứng với rolA, rolB, rolC, nước thang chuẩn Trang 57 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy Agrobacterium rhizogenes phân lập từ đất trồng nhiều loại trồng khác nước ta Trên mơi trường chọn lọc MG-Te, lồi vi khuẩn có ba dạng khuẩn lạc khác phân biệt mắt thường Trong số ba mươi bốn dòng phân lập được, qua kiểm tra bệnh học kết phân tích sinh học phân tử cho thấy có mười ba chủng A rhizogenes khác hình dạng khuẩn lạc khả cảm ứng tạo rễ tơ giống dừa cạn in vivo Tiềm chúng cho nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy rễ tơ cần tiếp tục nghiên khảo sát sâu Isolation and identification of Agrobacterium rhizogenes inducing hairy roots of Catharanthus roseus in vivo  Nguyen Nhu Nhut University of Scicence, VNU-HCM - Gia Tuong Company, Binh Duong branch  Bui Van Le University of Scicence, VNU-HCM ABSTRACT Agrobacterium rhizogenes is a common tool for on the morphological, biochemical, and transforming foreign genes into plant cell and pathogenicity tests These thirteen colonies were inducing hairy root formation A total of 274 colonies identified as A rhizogenes based on 16S rRNA of Agrobacterium species was isolated on selective sequence and possessing rolABC genes The results MG-Te medium from 235 samples of rhizophere soils indicated A rhizogenes was universal in rhizophere There were only thirteen colonies belonged to A soil in Vietnam and riched transgenic tools for rhizogenes being able to efficiently induce the hairy researching C roseus hairy roots in the future root formation of Catharanthus roseus in vivo based Keywords: Agrobacterium rhizogenes, Catharanthus roseus, hairy root, isolation, leguminous plant TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] B.Y Binder, C.A Peebles, J.V.Shanks, K.Y San, The effects of UV-B stress on the production of terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus hairy roots Biotechnol Prog., 25, 3, 861– 865 (2009) Trang 58 [2] T.J Burr, B.H Katz., Isolation of Agrobacteriumtume faciensbiovar from grapevine galls and sap, and from vineyard soil Phytopathology, 73, 163-165 (1983) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 [3] S Chandra, H Lata, A Varma., Biotechnology for Medicinal Plants Springer, London (2013) [4] G Emanuel, H.G Lorrence, Practical handbook of microbiology CRC Press (2009) [5] G.E Navarrete, X.A Affantranger, O.J Elías, G Gabriel, C.D Camino, C.Francisco, Q Carmen, G.M Peter, S Federic, Fast, efficient and reproducible genetic transformation of Phaseolus spp by Agrobacterium rhizogenes Nature Protocols, 2, 1819–1824, (2007) [6] M.G George, Bergey‟s manual of systematic bacteriology, Springer (2005) [7] J.D Janse., Phytobacteriology–Principles and practice CABI Publishing (2005) [8] C José, Jiménez-López, Biochemical testing Intech, (2012) [9] Kereszt, D Li, A Indrasumunar, D.T.C Nguyen., Nontachaiyapoom, K.S Mark., M.P Gresshoff, Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology Nature Protocols, 2, 948–952 (2007) [10] S Majumdar, S Garai, S Jha, Genetic transformation of Bacopa monnieri by wild type strains of Agrobacterium rhizogenes stimulates production of bacopa saponins in transformed calli and plants Plant Cell Rep, 30, 5, 941–54 (2011) [11] M.M Dehcheshmeh, E Esmaeil, D.T Stephen, N.K Brent, A novel method based on combination of semi-in vitro and in vivo conditions in Agrobacterium rhizogenesmediated hairy root transformation of Glycine species In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 50, 2, 282–291 (2014) [12] S Murugesan, C Manoharan, R Vijayakumar, A Panneerselvam, Isolation and characterization of Agrobacterium rhizogenes from the root nudules of some leguminous plants International Journal of Microbiological Research, 1, 3, 92–96 (2010) [13] M Sun, J.J Zeng, A study on the hairy root culture and antitumor alkaloids production of Catharanthus roseus, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 30, 10, 741–755 (2005) [14] T Tzvi, C Vitaly, Agrobacterium–From biology to biotechnology Springer (2008) [15] W Kan, Agrobacterium protocols, Humana Press (2006) [16] X.T He, W.L Lin, P.J Liang, M Chen, C Xu., Hairy root induced by wild-type Agrobacterium rhizogenes K599 in soybean, cucumber and garden balsam in vivo Yi Chuan, 27, 5, 783–786 (2005) Trang 59