Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid và cảm ứng tạo rễ tơ ở cây thổ nhân sâm (talinum paniculatum) tt

1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) loại thân thảo biết đến với giá trị dược liệu cao Các nghiên cứu thành phần hóa học Thở nhân sâm cho thấy, rễ có nhiều hợp chất có hoạt tính dược học khác như: alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, phytosterol, phytol; phytol chiếm tỷ lệ cao (69,32 %) Từ lâu, Thổ nhân sâm sử dụng y học cổ truyền, đặc biệt điều trị bệnh tiểu đường type 2, viêm da, rối loạn tiêu hóa, yếu sinh lý rối loạn sinh sản Galactogue có tác dụng chống viêm, kích thích tăng tiết sữa phụ nữ cho bú có khả chữa bệnh viêm loét Rễ Thổ nhân sâm sử dụng để thúc đẩy khả sinh sản chữa bệnh phụ khoa bất thường chu kỳ kinh nguyệt Steroid saponin rễ Thổ nhân sâm có tác dụng phòng chữa bệnh xơ vỡ động mạch, đồng thời ngun liệu để tởng hợp nên hormone sinh dục Flavonoid hợp chất có vai trò quan trọng người có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư… Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu thu nhận flavonoid Thổ nhân sâm hàm lượng flavonoid lồi thuộc chi Talinum, có Thở nhân sâm thấp Vấn đề đặt làm để nâng cao hàm lượng flavonoid lồi thuộc chi Talinum nói chung Thở nhân sâm (T paniculatum) nói riêng để sử dụng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Cho đến nay, có số cách tiếp cận chủ yếu áp dụng dược liệu để làm tăng hàm lượng flavonoid Đó sử dụng phương pháp chọn lọc từ quần thể lai hữu tính hay đột biến thực nghiệm, từ chọn lọc dòng có hàm lượng flavonoid cao Tuy nhiên, Thổ nhân sâm chưa thấy công bố ứng dụng phương pháp để nâng cao hàm lượng flavonoid; việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật chuyển gen nuôi cấy mô tế bào thực vật dược liệu quan tâm mang lại hiệu cao thu nhận dược chất, có flavonoid Ở thực vật, flavonoid tổng hợp qua đường phenylpropanoid, chuyển phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA sau 4-coumaroylCoA vào q trình tởng hợp flavonoid Có nhiều enzyme tham gia vào đường tổng hợp flavonoid phenylalanine ammonialyase, cinnamate 4-hydroxylase, 4-Coumarate CoA ligase, chalcone synthase, chalcone isomerase… Trong đó, chalcone isomerase (CHI) enzyme chìa khóa cho sinh tổng hợp flavonoid việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở đóng vòng để hình thành naringenin Sau đó, hợp chất chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid flavanone, flavonol anthocyanin Do vậy, biểu mạnh gen mã hóa enzyme CHI làm tăng hoạt độ enzyme chìa khóa CHI hàm lượng loại flavonoid chuyển gen cải thiện Ngồi ra, Thở nhân sâm lồi có rễ củ, nhiều hợp chất thứ cấp tập trung rễ, có flavonoid Do vậy, để tăng thu nhận flavonoid Thổ nhân sâm, cách tiếp cận ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ nhằm tăng sinh khối quan tâm nghiên cứu Khi mô thực vật (lá, đoạn thân, mầm ) bị lây nhiễm Agrobacterium rhizogenes T-DNA cấu trúc Ri-plasmid mang gen rol gen mã hóa sinh tởng hợp auxin loại IAA chuyển vào mô thực vật Sự biểu đồng thời gen rol gen tởng hợp auxin tạo nên kiểu hình rễ tơ mô tế bào thực vật lây nhiễm A rhizogenes Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum)” 3 Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng chuyển gen GmCHI có hàm lượng flavonoid cao đối chứng không chuyển gen xác định điều kiện thích hợp cảm ứng tạo rễ tơ in vitro Thổ nhân sâm Nội dung nghiên cứu (i) Nghiên cứu định danh mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phương phương pháp hình thái so sánh, kết hợp với nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA (trình tự vùng ITS; đoạn gen matK, rpoB, rpoC1) (ii) Nghiên cứu chuyển gen GmCHI tạo dòng Thở nhân sâm chuyển gen Phân tích biểu protein tái tở hợp CHI Thổ nhân sâm chuyển gen hệ T1 (iii) Nghiên cứu tạo rễ tơ Thổ nhân sâm nhờ Agrobacterium rhizogenes Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu có hệ thống, từ định danh mẫu Thổ nhân sâm thu thập số địa phương tạo nguồn vật liệu ban đầu để nuôi cấy in vitro đến chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào Thổ nhân sâm phân tích biểu gen GmCHI có nguồn gốc từ đậu tương Thổ nhân sâm chuyển gen Cụ thể là: 1) Định danh mẫu Thổ nhân sâm thu địa phương Việt Nam thuộc loài T paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) 2) Lần biểu thành cơng gen GmCHI có nguồn gốc từ đậu tương Thổ nhân sâm tạo dòng Thở nhân sâm chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao đối chứng không chuyển gen 3) Tạo dòng rễ tơ từ Thở nhân sâm làm vật liệu phục vụ chọn dòng rễ tơ có hàm lượng dược chất cao Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Kết đạt luận án có giá trị khoa học thực tiễn cách tiếp cận cải thiện hàm lượng flavonoid kỹ thuật chuyển gen mã hóa enzyme chìa khóa q trình tởng hợp flavonoid tạo dòng rễ tơ in vitro Thở nhân sâm Về mặt khoa học, kết nghiên cứu luận án sở ứng dụng kỹ thuật tạo dòng rễ tơ chuyển gen vào việc nâng cao hàm lượng dược chất Thổ nhân sâm số loại dược liệu khác Về mặt thực tiễn, dòng rễ tơ dòng Thở nhân sâm chuyển gen làm vật liệu cho chọn giống Thở nhân sâm có hàm lượng flavonoid cao Kết nghiên cứu mở triển vọng ứng dụng kỹ thuật tạo dòng rễ tơ kỹ thuật biểu mạnh gen vào việc nâng cao hàm lượng dược chất dược liệu Cấu trúc luận án Luận án có 129 trang (kể phụ lục), chia thành chương, phần: Mở đầu (4 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (37 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3: Kết thảo luận (41 trang); Kết luận đề nghị (2 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (3 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang); Phụ lục (12 trang) Luận án có 16 bảng, 33 hình tham khảo 131 tài liệu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tởng kết 131 tài liệu, có tài liệu tiếng Việt, 125 tài liệu tiếng Anh ba vấn đề bản, là: (1) Nghiên cứu nuôi cấy in vitro Thổ nhân sâm; (2) Flavonoid đường tổng hợp flavonoid thực vật; (3) Enzyme CHI biểu gen mã hóa CHI Cây Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum Gaertn.) chứa flavonoid saponin có khả chống oxy hóa mạnh sử dụng điều trị số bệnh viêm nhiễm, dị ứng, loét dày… Hiện chưa có cơng trình nghiên cứu cơng bố hàm lượng flavonoid Thở nhân sâm, nhiên, lồi Talinum triangulare xác định có hàm lượng flavonoid thấp (khoảng 0,897 mg/g tươi) (Afolabi cs, 2014) Flavonoid tổng hợp qua đường phenylpropanoid chalcone isomerase enzyme chìa khóa cho sinh tởng hợp flavonoid việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở đóng vòng để hình thành naringenin Để cải thiện hàm lượng dược chất Thổ nhân sâm (trong có flavonoid), nghiên cứu chủ yếu tiếp cận theo hướng tăng sinh khối tế bào, rễ tơ Nghiên cứu Zhao cs (2009) vật liệu thích hợp nồng độ chất kích thích tăng trưởng tối ưu đến hình thành mơ sẹo, cụm chồi, tỷ lệ rễ, tỷ lệ sống sót vườn ươm; Muhallilin cs (2013) nghiên cứu cảm ứng tạo rễ Thổ nhân sâm từ mô với điều chỉnh chất kích thích tăng trưởng auxin ni cấy in vitro Trong đó, Yosephine cs (2012) nghiên cứu ảnh hưởng việc sục khí mật độ cấy đến sinh khối rễ tơ Thở nhân sâm bình bioreactor cách biến nạp A rhizogenes vào mẫu Thổ nhân sâm Ở Việt Nam, chưa tìm thấy cơng bố tạo dòng rễ tơ Thở nhân sâm Ngoài cách tiếp cận cải thiện hàm lượng flavonoid ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào tạo sinh khối để tăng thu nhận flavonoid, kĩ thuật biểu mạnh gen mã hóa enzyme chìa khóa CHI đường tổng hợp flavonoid quan tâm nghiên cứu Trên giới có số cơng trình nghiên cứu biểu mạnh gen CHI Cà chua (Muir cs, 2001), Thuốc (Li cs, 2006), Mẫu đơn (Lin cs 2014) … Kết thu hàm lượng flavonoid tổng số, flavonol, anthocyanin tăng nhiều lần so với đối chứng không chuyển gen Hiện nay, chưa tìm thấy cơng trình nghiên cứu chuyển gen CHI vào Thổ nhân sâm Do vậy, hướng ứng dụng công nghệ tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa đường chuyển hóa tổng hợp flavonoid Thổ nhân sâm cần quan tâm tập trung nghiên cứu Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Hạt mẫu Thổ nhân sâm thu từ tháng 9/2015 đến tháng 3/2016 địa phương: huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang (BG); thành phố Thái Nguyên (TN1); huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên (TN2); thị xã Sơn Tây, Hà Nội (HT); huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh (QN) Tiến hành gieo trồng mẫu Thổ nhân sâm phục vụ nhận diện tạo nguyên liệu cho phân tích hình thái sinh học phân tử 6 Chủng A rhizogenes ATTC 15834 cung cấp từ Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen pCB301-GmCHI cung cấp Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất sử dụng nghiên cứu mua từ hãng nổi tiếng giới hãng Fermentas, Bio-Neer, Invitrogen, Trizol Reagents, kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis, ; Các thí nghiệm ni cấy in vitro chuyển gen vào Thổ nhân sâm thực Phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Các thí nghiệm phân tích chuyển gen tiến hành phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, phòng Cơng nghệ Tế bào thực vật Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp định danh mẫu Thổ nhân sâm phương pháp hình thái so sánh theo Phạm Hoàng Hộ (1999), Đỗ Tất Lợi (2004), tra cứu http://www.tropicos.org/Name/26200178 phương pháp phân loại học phân tử dựa vào số mã vạch DNA vùng ITS, đoạn gen matK, rpoC1, rpoB 2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy in vitro: (1) Phương pháp khử trùng hạt; Phương pháp tái sinh đa chồi Thổ nhân sâm; (3) Phương pháp nuôi cấy tạo rễ tơ Thổ nhân sâm 2.3.3 Phương pháp chuyển gen GmCHI vào Thổ nhân sâm qua nách mầm nhờ A.tumefaciens tiến hành dựa nghiên cứu Olhoft cs (2006) 2.3.4 Phương pháp phân tích chuyển gen: Kiểm tra có mặt gen chuyển kĩ thuật PCR Xác định hợp gen chuyển GmCHI vào hệ gen Thổ nhân sâm thực theo phương pháp Southern blot Southern (1975) Phân tích biểu protein GmCHI tái tở hợp Thổ nhân sâm chuyển gen phương pháp điện di theo Laemmli (1970) Western blot Định lượng protein GmCHI tái tổ hợp chuyển gen ELISA theo phương pháp Sun cs (2006) Xác định hàm lượng flavonoid chuyển gen kĩ thuật quang phổ hấp thụ theo Kalita cs (2013) 2.3.5 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu: Các số liệu nghiên cứu xử lí thống kê phần mềm SPSS để xác định giá trị trung bình, phương sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU THỔ NHÂN SÂM 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phương Kết so sánh năm mẫu Thổ nhân sâm thu từ địa phương (Tân Yên, tỉnh Bắc Giang; thành phố Thái Nguyên; huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên; thị xã Sơn Tây, Hà Nội; huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh) cho thấy, mẫu Thở nhân sâm giống hình thái, gồm rễ, thân, lá, hoa (Hình 3.1 A) Rễ Thở nhân sâm rễ củ, hình trụ mang nhiều rễ (Hình 3.1 B) Thân Thở nhân sâm mọc thẳng, thân màu xanh, chia thành nhiều cành (Hình 3.1 A) Lá mọc so le, hình trứng ngược, hình thìa hình muỗng, khơng lơng, khơng có bẹ, phiến dày, thẫm, hai mặt bóng, đầu nhọn tù, phía cuống hẹp lại, cuống ngắn (Hình 3.1 C) Đầu cành xuất cụm hoa hình chùm nhiều hoa nhỏ, đường kính mm, cánh hoa màu tím nhạt, 10 nhị dài mm, bầu hoa hình cầu, hoa có đài (Hình 3.1 D) Quả nhỏ, chín có màu xám tro, đường kính ước mm (Hình 3.1 E) Hạt Thở nhân sâm nhỏ, màu đen nhánh dẹt, mặt có vân nởi (Hình 3.1 F) 8 Hình 3.1 Cây Thổ nhân sâm A: Thổ nhân sâm; B: rễ, củ; C: cành, lá; D: nụ hoa; E: quả; F: hạt Sau đối chiếu đặc điểm hình thái quan sát mẫu Thở nhân sâm với đặc điểm Thổ nhân sâm theo mơ tả Phạm Hồng Hộ (1999), Đỗ Tất Lợi (2004) đồng thời tra cứu http://www.tropicos.org/Name/26200178 cho thấy mẫu Thổ nhân sâm BG, TN1, TN2, HT, QN thuộc loài T paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) Tuy nhiên, sử dụng phương pháp hình thái so sánh khó xác định mẫu Thở nhân sâm giai đoạn phát triển (chưa hoa) dễ nhầm lẫn với loài T triangulare Vì vậy, để tránh nhầm lẫn với thảo dược khác, cần kết hợp phương pháp hình thái so sánh với việc sử dụng mã vạch DNA nhận diện mẫu Thổ nhân sâm 3.1.2 Đặc điểm trình tự nucleotide vùng ITS đoạn gen matK 3.1.2.1 Đặc điểm trình tự vùng ITS Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose % cho thấy chạy xuất băng với kích thước khoảng 600 bp, tương ứng với kích thước dự kiến vùng ITS (Hình 3.2) Kết giải trình tự nucleotide xác định vùng ITS có kích thước 643 bp Bằng BLAST NCBI cho thấy vùng ITS phân lập từ mẫu nghiên cứu (ITS-TN1, ITS-TN2, ITS-BG, ITS-HT, ITS-QN) có tỷ lệ tương đồng 99 % với ba trình tự vùng ITS lồi T paniculatum, mang mã số JF508608, L78094, EU410357 GenBank; kết khẳng định trình tự nucleotide phân lập vùng ITS thuộc lồi T paniculatum 9 Hình 3.2 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân vùng ITS M : Marker kb; 1: ITS-TN1, 2: ITS-TN2, 3: ITS-BG, 4: ITS-HT, 5: ITS-QN Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK M: Marker kb; 1: matK-TN1, 2: matK-TN2, 3: matK-BG, 4: matK-HT, 5: matK-QN 3.1.2.2 Đặc điểm trình tự đoạn gen matK Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose % cho thấy chạy xuất băng với kích thước khoảng 800 bp tương ứng với kích thước dự kiến đoạn gen matK (Hình 3.5) Kết giải trình tự nucleotide thu đoạn DNA mẫu Thở nhân sâm có kích thước 808 nucleotide Bằng BLAST NCBI cho thấy trình tự đoạn DNA phân lập từ mẫu nghiên cứu (matK-TN1, matK-TN2, matKBG, matK-HT, matK-QN) có tỷ lệ tương đồng 99 % với trình tự gen matK lồi T paniculatum, mang mã số AY015274, KY952520, GQ434150 GenBank, kết cho thấy trình tự nucleotide phân lập đoạn gen matK lồi T paniculatum Ngồi trình tự vùng ITS (trong nhân) đoạn gen matK (gen lục lạp), chúng tơi giải trình tự hai đoạn gen lục lạp rpoC1 rpoB Hai đoạn gen rpoC1 rpoB phân lập có kích thước tương ứng 595 bp 518 bp Bằng BLAST NCBI cho thấy trình tự hai đoạn gen 10 rpoB rpoC1 phân lập từ mẫu nghiên cứu (TN1, TN2, BG, HT, QN) đoạn gen rpoB rpoC1 thuộc loài T paniculatum 3.1.3 Thảo luận kết định danh mẫu Thổ nhân sâm tự nhiên Bằng phương pháp hình thái so sánh, mẫu Thở nhân sâm xác định có đặc điểm quan dinh dưỡng, quan sinh sản giống giống với đặc điểm mô tả Thổ nhân sâm theo Phạm Hoàng Hộ (1999), Đỗ Tất Lợi (2004) Tuy nhiên, số đặc điểm mẫu Thổ nhân sâm có nhiều điểm tương đồng với lồi T triangulare chi Talinum, nên chưa thể nhận diện mẫu Thở nhân sâm thuộc lồi hay khác lồi Vì vậy, việc kết hợp phương pháp hình thái so sánh với phương pháp phân loại học phân tử sử dụng mã vạch DNA (vùng ITS, đoạn gen matK, rpoC1 rpoB) sử dụng để nhận diện mẫu Thổ nhân sâm Từ hệ gen mẫu Thở nhân sâm, vùng ITS phân lập có kích thước 643 bp; ba đoạn gen matK, rpoC1 rpoB có kích thước tương ứng 808 bp, 595 bp 518 bp Bằng BLAST NCBI cho thấy trình tự đoạn gen matK, rpoC1 rpoB năm mẫu nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng 97 %, 99 %, 99 % với trình tự gen lục lạp loài T paniculatum Liu cs (2018) giải trình tự, mang mã số MG710385 GenBank Kết làm sở để khẳng định mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phương phía Bắc Việt Nam thuộc lồi T paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) 3.2 TẠO DÒNG THỔ NHÂN SÂM CHUYỂN GEN GmCHI 3.2.1 Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen Thổ nhân sâm 3.2.1.1 Kết khử trùng hạt Kết bảng 3.3 cho thấy, điều kiện khử trùng tối ưu hạt Thổ nhân sâm dung dịch javel 60 % 10 phút (tỷ lệ bình khơng bị nhiễm 92,23 %, tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 91,55 %, chồi mầm phát triển tốt) 11 Bảng 3.3 Ảnh hưởng javel 60 % HgCl2 0,1 % đến tỷ lệ nảy mầm hạt sau 10 ngày nuôi cấy (n=30) Thời gian khử trùng (phút) 10 Tỷ lệ Tỷ lệ hạt Kích thước Hình thái mầm bình nảy mầm mầm sau 10 không bị (%) ngày (cm) nhiễm (%) Ảnh hưởng javel 60 % đến tỷ lệ nảy mầm hạt 92,23c 91,55c 1,58b Mập, xanh bình thường Ảnh hưởng HgCl2 0,1 % đến tỷ lệ nảy mầm hạt 91,25b 82,26c 1,39c Mập, xanh bình thường Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện sai khác với p < 0,05 3.2.1.2 Kết tạo đa chồi rễ in vitro Thổ nhân sâm 3.2.2.1 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ nách mầm Kết bảng 3.4 cho thấy, môi trường MS bở sung 1,5 mg/l BAP có khả tạo chồi kích thích sinh trưởng chồi lớn từ mầm, số chồi/mẫu đạt 1,68 (giai đoạn tuần) 1,78 (giai đoạn tuần) Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ mầm (n=30) Số mẫu Số % so Chiều Số Chất Nồng tạo chồi chồi/mẫ với đối cao lá/chồi lượng độ BAP u chứng chồi chồi (mg/l) (cm) Sau tuần Mập, 1,5 23,56d 1,68a 136,58 0,87a 4,74b XBT Sau tuần Mập, 1,5 24,12d 1,78a 132,83 2,88c 6,14a XBT 12 Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05; XBT: xanh bình thường Ảnh hưởng BAP, kết hợp BAP IBA đến phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Kết phân tích ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (n=30) Nồng Số chồi/ % so Chiều cao Số lá/ Chất lượng độ BAP mẫu với ĐC chồi (cm) chồi chồi (mg/l) Sau tuần 2,0 3,04d 218,7 0,87a 5,22c Mập, XBT Sau tuần 2,0 3,24c 216,00 2,88b 6,52a Mập, XBT Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05; XBT: xanh bình thường Kết bảng 3.5 cho thấy môi trường MS bở sung mg/l BAP có khả tạo chồi kích thích sinh trưởng chồi lớn nhất, số chồi/mẫu đạt 3,04 (giai đoạn tuần) 3,24 (giai đoạn tuần) So sánh kết bảng 3.4 bảng 3.5 cho thấy phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên hiệu phát sinh sinh trưởng chồi từ nách mầm nồng độ BAP Như vậy, BAP mg/l chất kích thích tăng trưởng thích hợp tạo đa chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Thổ nhân sâm Kết ảnh hưởng IAA NAA đến khả rễ Thổ nhân sâm in vitro Kết phân tích ảnh hưởng IAA đến khả rễ Thở nhân sâm trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IAA đến khả rễ Thổ nhân sâm (n=30) Nồng độ IAA Tỷ lệ chồi rễ Chiều dài rễ Số rễ/chồi (mg/l) (%) (cm) Sau tuần 0,5 80,17d 5,13d 0,92b Sau tuần 13 0,5 98,12d 13,23d 3,79c Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05 Bảng 3.7 cho thấy, môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IAA cho tỷ lệ rễ cao đạt 80,17 % tăng 2,66 lần (giai đoạn tuần) 98,12 % tăng 1,09 lần (ở giai đoạn tuần) so với đối chứng Vậy nồng độ IAA tối ưu kích thích rễ in vitro Thổ nhân sâm 0,5 mg/l Kết phân tích ảnh hưởng NAA đến khả rễ in vitro Thổ nhân sâm bảng 3.8 cho thấy, môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA cho tỷ lệ rễ cao đạt 58,33 % tăng 1,93 lần (giai đoạn tuần) 94,36 % tăng 1,05 lần (ở giai đoạn tuần) so với đối chứng Như nồng độ NAA 0,5 mg/l thích hợp kích thích rễ Thổ nhân sâm Bảng 3.8 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Thổ nhân sâm (n=30) Nồng độ NAA (mg/l) 0,5 0,5 Tỷ lệ chồi rễ Số (%) rễ/chồi Sau tuần 58,33e 3,21c Sau tuần 94,36c 10,43c Chiều dài rễ (cm) 0,31a 2,79c Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện sai khác với p < 0,05 Khi so sánh tiêu tỷ lệ rễ số rễ thời điểm nồng độ tối ưu 0,5 mg/l IAA 0,5 mg/l NAA cho thấy IAA hiệu NAA Vậy chất kích thích rễ tối ưu Thổ nhân sâm 0,5 mg/l IAA 3.2.2 Kết chuyển gen GmCHI tạo Thổ nhân chuyển gen 3.2.2.1 Kết khảo sát vật liệu chuyển gen thông qua A tumefaciens 14 Kết tạo đa chồi từ mầm đoạn thân mang mắt chồi bên sau biến nạp A tumefaciens thể qua bảng 3.9 hình 3.9 Bảng 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn thân mang mắt chồi bên sau lây nhiễm A tumefaciens (n=150) Số lá/ Vật liệu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi chồi Sau tuần Lá mầm 3,02b 1,34a 5,21b Mập a a Đoạn thân 1,40 1,13 3,43a Gầy Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05 Kết bảng 3.9 hình 3.9 cho thấy, hiệu tạo đa chồi từ mầm sau biến nạp A tumefaciens cao gấp 2,15 lần (ở giai đoạn tuần) so với đoạn thân mang mắt chồi bên Đồng thời chồi tạo từ mầm có chiều cao, số lá, chất lượng chồi tốt so với chồi tạo từ đoạn thân mang mắt chồi bên Như vậy, mầm vật liệu thích hợp tạo đa chồi phục vụ chuyển gen Thở nhân sâm Số chồi/ mẫu Hình 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn thân mang mắt chồi bên sau lây nhiễm A tumefaciens A, B: Sự phát sinh sinh trưởng chồi từ mầm biến nạp A tumefaciens sau tuần tuần C, D: Sự phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên biến nạp A tumefaciens sau tuần tuần 15 3.2.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen GmCHI tạo Thổ nhân sâm chuyển gen Kết chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào Thổ nhân sâm thông qua A.tumefaciens lây nhiễm qua nách mầm thể bảng 3.10 hình 3.10 Bảng 3.10 cho thấy, 730 mẫu biến nạp qua giai đoạn tái sinh sinh trưởng chồi, chọn lọc kháng sinh tạo 18 dòng chuyển gen GmCHI gồm 28 điều kiện nhà lưới, chiếm 2,46 % Song song với thí nghiệm chuyển gen GmCHI, tiến hành hai lô đối chứng ĐC0 ĐC1 Ở lơ ĐC1 thu 35 sống sót vườn ươm Hình 3.10 Hình ảnh biếp nạp tái sinh Thổ nhân sâm chuyển gen A: hạt khử trùng nảy mầm môi trường GM; B: đồng nuôi cấy tối môi trường CCM; C: cảm ứng tạo chồi; D: tái sinh đa chồi sau tuần; E, F: rễ tạo hoàn chỉnh môi trường RM; G: chuyển gen trồng giá thể; H: trồng vườn ươm điều kiện nhà lưới Bảng 3.10 Kết biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào Thổ nhân sâm Số Số Số Đối chứng Tổng số Số Số sống mẫu chồi sống thí mẫu chồi sót tạo kéo giá nghiệm biến nạp rễ nhà lưới chồi dài thể ĐC0 40 0 0 ĐC1 40 30 70 68 40 35 Thí nghiệm 730 200 102 63 43 28 16 lần Ghi chú: ĐC0: mẫu Thổ nhân sâm không chuyển gen cấy mơi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1: mẫu Thổ nhân sâm không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh 3.2.3 Kết phân tích Thổ nhân sâm chuyển gen 3.2.3.1 Xác định hợp gen chuyển GmCHI hệ gen Thổ nhân sâm hệ T0 Kết kiểm tra Thổ nhân sâm chuyển gen PCR Kết phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu CHI-NcoI-F/CHINotI-R hình 3.11 thu đoạn DNA với kích thước khoảng 0,66 kb tương ứng với kích thước gen GmCHI chuyển vào Thổ nhân sâm Thổ nhân sâm (T0-2.1, T0-2.2, T0-4, T0-7, T0-10, T012, T0-14 T0-16) Kết kiểm tra Thổ nhân sâm chuyển gen Southern blot Tám Thổ nhân sâm chuyển gen hệ T0 dương tính với PCR T0- 2.1; T0- 2.2; T0- 4; T0- 7; T0- 10; T0- 12; T0- 14; T0- 16 đối chứng không chuyển gen sử dụng để phân tích Southern blot, kết thể hình 3.12 Kết hình 3.12 cho thấy, băng DNA xuất chuyển gen T0- 2.1; T0- 2.2; T0- 4; T07; T0- 10; T0- 14 Hiệu suất chuyển gen tính đến thời điểm phân tích lai Southern 5/730 = 0,68 % Như vậy, khẳng định gen chuyển GmCHI gắn vào hệ gen chuyển gen Các Thổ nhân sâm chuyển gen cho kết lai Southern tiếp tục chăm sóc ưu tiên phát triển phục vụ phân tích khả hoạt động biểu mạnh gen chuyển GmCHI chuyển gen Hình 3.11 Hình ảnh điện di kiểm Hình 3.12 Kết phân tích 17 tra sản phẩm PCR nhân gen GmCHI từ Thổ nhân sâm chuyển gen hệ T0 cặp mồi CHI-NcoI-F/CHI- NotI-R Thổ nhân sâm chuyển gen lai Southern chuyển gen dương tính với PCR với đoạn dò GmCHI đánh dấu biotin 3.2.3.2 Phân tích biểu protein CHI tái tổ hợp dòng Thổ nhân sâm chuyển gen hệ T1 Thu hạt Thở nhân sâm có kết dương tính với Southern blot hệ T0 (T0- 2.1; T0- 2.2; T0- 4; T0- 7; T0- 10; T0- 14) đem gieo trồng có hạt (T1- 2.2; T1- 4; T1- 10; T1- 14) nảy mầm tạo dòng chuyển gen T1 Kết lai Western phân tích biểu protein tái tở hợp dòng Thổ nhân sâm chuyển gen đối chứng khơng chuyển gen hình 3.13 cho thấy, màng lai xuất băng màu vị trí kích thước khoảng 25 kDa dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1- 2.2; T1- 10 hệ T1 Dòng T1- 4; T1- 14 đối chứng khơng chuyển gen khơng xuất băng protein Điều chứng tỏ gen chuyển GmCHI di truyền từ hệ T0 sang T1 dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1 (T1- 2.2; T1- 10) dịch mã tổng hợp protein GmCHI tái tổ hợp Như vậy, hiệu suất chuyển gen giai đoạn đạt 0,27 % (2/730) Hình 3.13 Kết phân tích Western blot từ dòng Thở nhân sâm chuyển gen hệ T1 đối chứng khơng chuyển gen Hình 3.14 Kết phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tở hợp CHI hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen (T1- 2.2; T1- 10) đối chứng không chuyển gen (WT) Hàm lượng protein tái tổ hợp GmCHI hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1- 2.2, T1- 10 phân tích phương pháp 18 ELISA, kết thể hình 3.14 Biểu đồ hình 3.14 cho thấy hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen (T1- 2.2, T1- 10) tổng hợp protein tái tở hợp GmCHI có hàm lượng 6,14 µg/mg 4,29 µg/mg Dòng T1- 2.2 có hàm lượng protein GmCHI cao dòng T1- 10 Kết chứng minh hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen, protein GmCHI tăng cường biểu 3.2.3.3 Xác định hàm lượng flavonoid tổng số dòng Thổ nhân sâm hệ T1 Kết xác định hàm lượng flavonoid hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen (T1- 2.2; T1- 10) đối chứng thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Hàm lượng flavonoid tổng số hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1- 2.2; T1- 10 đối chứng không chuyển gen Hàm lượng % so với đối Các mẫu nghiên cứu flavonoid tổng số chứng không (mg/g) chuyển gen Các đối chứng không 0,57a 100 chuyển gen Dòng T1- 2.2 4,24c 743,86 Dòng T1- 10 2,74b 480,70 Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05 Bảng 3.11 cho thấy dòng Thở nhân sâm chuyển gen GmCHI hệ T1 (T1-2.2 T1-10) có hàm lượng flavonoid 4,24 mg/g 2,74 mg/g tăng 743,86 % 480,70 % so với đối chứng không chuyển gen Kết chứng minh biểu mạnh gen GmCHI hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1-2.2 T1-10 tác động làm tăng tổng hợp flavonoid chuyển gen 3.2.4 Thảo luận kết biến nạp tạo dòng Thổ nhân sâm chuyển gen Ở Thở nhân sâm hướng nghiên cứu chủ yếu tập trung vào nuôi cấy in vitro để tăng sinh khối mà chưa thấy cơng trình nghiên cứu thiết lập phương pháp chuyển gen hiệu để cải thiện 19 hàm lượng dược chất Thổ nhân sâm, có flavonoid Nghiên cứu chọn cách tiếp cận ứng dụng nguyên lý biểu mạnh gen nhằm nâng cao hiệu biểu protein tái tở hợp mục đích tăng cường hoạt động enzyme chìa khóa tham gia vào đường sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp thực vật GmCHI mã hóa enzyme chìa khóa CHI phân lập từ đậu tương lựa chọn chuyển vào Thổ nhân sâm Thổ nhân sâm thực vật hai mầm, kĩ thuật chuyển gen thông qua A.tumefaciens sử dụng có hiệu lây nhiễm qua nách mầm (Olhoft cs, 2006) Trong tổng số 730 mẫu biến nạp, tạo 28 Thổ nhân sâm chuyển gen tương ứng với 18 dòng chuyển gen sống sót Kết phân tích tác động enzyme tái tổ hợp đến tổng hợp flavonoid hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1 cho thấy, hàm lượng flavonoid tởng số hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1- 2.2; T1- 10 4,24 mg/g 2,74 mg/g tăng 7,4 lần 4,8 lần so với đối chứng không chuyển gen Kết phù hợp với nghiên cứu số tác giả giới Li cộng (2006) nghiên cứu chuyển gen SmCHI loài S medusa vào Thuốc lá, kết làm tăng hàm lượng flavonoid tổng số gấp lần so với không chuyển gen Nghiên cứu chuyển gen CHI phân lập từ Dạ yến thảo chuyển vào Cà chua Muir cs (2001) tạo Cà chua chuyển gen có hàm lượng flavonol tăng đến 78 lần vỏ so với không chuyển gen Như thấy, chuyển gen CHI phân lập từ loài sang loài khác làm tăng hàm lượng flavonoid, flavonol flavone chuyển gen cách tiếp cận lựa chọn kỹ thuật biểu mạnh gen GmCHI có nguồn gốc từ đậu tương làm tăng hàm lượng enzyme CHI tham gia tổng hợp flavonoid dẫn đến tăng hàm lượng flavonoid Thở nhân sâm hợp lý Ngồi cách tiếp cận cải thiện hàm lượng flavonoid Thổ nhân sâm kĩ thuật biểu mạnh gen mã hóa CHI, công nghệ tạo rễ tơ hướng nghiên cứu nhằm tăng sinh khối in vitro để thu nhận flavonoid Thở nhân sâm 3.3 TẠO DỊNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM 20 3.3.1 Kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 3.3.1.1 Khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Thổ nhân sâm Kết khảo sát loại mơ thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ thể qua bảng 3.12 hình 3.16 Bảng 3.12 Kết khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Thổ nhân sâm (n=150, sau tuần) Loại mô Tỷ lệ mẫu tạo Số Chiều dài rễ rễ tơ (%) rễ/mẫu (cm) Lá 65,9c 3,45c 3,25c Đoạn thân mang 55,6a 1,89a 1,59a mắt chồi bên Lá mầm 58,2b 2,32b 1,82b Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05 Hình 3.16 Khảo sát vật liệu thích hợp để tạo rễ tơ Thổ nhân sâm sau tuần biến nạp A: rễ tơ cảm ứng từ mầm, B: rễ tơ cảm ứng từ đoạn thân mang mắt chồi bên, C: rễ tơ cảm ứng từ mô Kết bảng 3.12 hình 3.16 cho thấy, loại mô khảo sát cho cảm ứng tạo rễ tơ mơ cho tỷ lệ tạo rễ tơ cao 65,9 % (4 tuần tuổi), thấp đoạn thân mang mắt chồi bên cho tỷ lệ tạo rễ tơ 55,6 % (4 tuần tuổi) Đồng thời rễ tơ sinh trưởng phát triển tốt từ mô chuyển gen Như vậy, mô in vitro sau - tuần nuôi cấy nguồn vật liệu thích hợp cho tạo rễ tơ Thổ nhân sâm 21 3.3.1.2 Ảnh hưởng mật độ A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian lây nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ từ mô Thổ nhân sâm Kết phân tích ảnh hưởng mật độ A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian lây nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ từ mô Thổ nhân sâm cho thấy, mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600 = 0,6; nồng độ AS 100 μmol/l; thời gian nhiễm khuẩn 10 phút; thời gian đồng nuôi cấy ngày; nồng độ cefotaxime 500 mg/l cho tỷ lệ mô cảm ứng tạo rễ tơ cao (65,9 %) Bảng 3.13 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ từ mô Thổ nhân sâm (n=150, sau tuần) Ảnh hưởng mật độ khuẩn OD600 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Ảnh hưởng nồng độ AS Ảnh hưởng thời Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn gian đồng nuôi cấy Thời gian Thời gian Tỷ lệ Nồng Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ mẫu nhiễm đồng mẫu tạo độ AS mẫu tạo mẫu tạo tạo rễ tơ khuẩn nuôi cấy rễ tơ (%) (μmol/l) rễ tơ (%) rễ tơ (%) (%) (phút) (ngày) a b d 23,42 50 43,23 45,23 36,12d 34,56c 75 47,32c 10 65,9e 65,9e 65,9e 100 65,9d 15 40,07c 23,34c 43,24d 125 45,14c 20 34,12b 14,12b b a a 29,43 150 40,10 25 12,51 4,12a Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05 3.3.1.3 Nghiên cứu xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime Kết xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime bảng 3.14 cho thấy, nồng độ cefotaxime tối ưu diệt khuẩn 500 mg/l cho tỷ lệ đĩa cấy không bị nhiễm 93,76 % tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ 65,9 % Kết phù hợp với nghiên cứu Yosephine cs (2015) Bảng 3.14 Xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime sau tuần Nồng độ cefotaxime Tỷ lệ đĩa cấy không bị Tỷ lệ mẫu tạo (mg/l) nhiễm (%) rễ tơ (%) 500 93,76d 65,9d Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05 22 3.3.1.4 Phân tích dòng rễ tơ mang gen rolC kĩ thuật PCR Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hai cặp mồi nhân gen rolC gen VirD2 cho thấy, đoạn gen rolC có kích thước khoảng 0,5 kb đoạn gen VirD2 có kích thước khoảng 0,3 kb khuếch đại giếng đối chứng dương (pRi plasmid 15834); giếng chạy sản phẩm PCR dòng rễ tơ (dòng 2, 3, 6, 7, 8) (Hình 3.17 A) có diện băng DNA sáng rõ nét vị trí 520 bp (cùng vị trí với đối chứng dương gen rolC) khơng có băng DNA vị trí 338 bp gen VirD2 (Hình 3.17 B); ngược lại với giếng đối chứng dương, giếng đối chứng âm đối chứng rễ khơng chuyển gen (rễ bất định) khơng có băng vạch vị trí 338 bp 520 bp A B Hình 3.17 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen rolC (A) đoạn gen virD2 (B) M: Thang chuẩn 1kb; (-): nước; (+): sản phẩm PCR Ri plasmid; Rễ không chuyển gen; Các giếng từ đến (A): sản phẩm PCR nhân gen rolC dòng rễ tơ Thổ nhân sâm; Các giếng 2, 3, 6, 7, (B): sản phẩm PCR nhân gen virD2 dòng rễ tơ mang gen rolC 3.3.1.5 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng trưởng rễ tơ Thổ nhân sâm Trong ba trạng thái môi trường thử nghiệm gồm đặc, bán lỏng lỏng rễ tơ mơi trường lỏng nuôi lắc cho tốc độ tăng trưởng cao (4,11 g rễ tươi), tiếp sau môi trường bán lỏng (3,02 g rễ tươi) cuối môi trường đặc (2,12 g rễ tươi) tăng 7,47; 5,49 3,85 lần so với khối lượng rễ ban đầu sau tuần nuôi cấy (Bảng 3.15) Như vậy, môi trường lỏng nuôi lắc giúp rễ tơ Thở nhân sâm tăng trưởng tốt Hình ảnh thể kết nuôi cấy tạo rễ tơ Thở nhân sâm thể hình 3.18 Bảng 3.15 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng trưởng rễ tơ Thổ nhân sâm Trạng thái Khối Khối lượng Khối Khối lượng rễ 23 môi trường lượng rễ rễ tươi sau lượng rễ khô (g) ban đầu (g) tuần (g) tăng (lần) Lỏng nuôi lắc 0,55 4,11c 7,47 0,34b b Bán lỏng 0,55 3,02 5,49 0,23a a Đặc 0,55 2,12 3,85 0,18a Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hiện khơng có sai khác với p < 0,05 Hình 3.18 Hình ảnh cảm ứng ni cấy rễ tơ Thổ nhân sâm A- mô Thổ nhân sâm; B- rễ tơ cảm ứng sau tuần; C- nuôi cấy rễ tơ môi trường bán lỏng sau tuần; D- nuôi rễ tơ môi trường lỏng nuôi lắc sau tuần; E- rễ tơ tăng trưởng sau tuần 3.3.2 Thảo luận kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm Ni cấy sinh khối rễ tơ nhờ vi khuẩn A rhizogenes để thu nhận hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học giải pháp hiệu quả, khắc phục hạn chế phương pháp nhân giống truyền thống phương pháp nuôi cấy tăng sinh khối tế bào Đối với Thổ nhân sâm, nghiên cứu rễ tơ ứng dụng kỹ thuật nhân nuôi tăng sinh khối rễ tơ Yosephine cs (2012) cơng bố Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo dòng rễ tơ từ thực vật đặc biệt Thở nhân sâm mẻ Trong nghiên cứu này, mơ vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Thổ nhân sâm Mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD 600 = 0,6; nồng độ AS 100 μmol/l; thời gian nhiễm khuẩn 10 phút; thời gian đồng nuôi cấy ngày; nồng độ cefotaxime 500 mg/l điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ từ mô Thổ nhân sâm Kết phù hợp với nghiên cứu Yosephine cs (2015) Môi trường MS trạng thái lỏng khơng bở sung chất điều hòa sinh trưởng, ni điều kiện lắc thích hợp cho tăng trưởng rễ tơ Thổ nhân sâm Kết kiểm tra có mặt gen rolC phương pháp PCR vắng mặt gen virD2 24 khẳng định dòng rễ tơ (dòng 2, 3, 6, 7, 8) tạo từ Thổ nhân sâm, kết phù hợp với nghiên cứu Thwe cs (2016) Tuy nhiên, để sử dụng dòng rễ tơ Thở nhân sâm sản xuất thu nhận flavonoid nói riêng chất chuyển hóa thứ cấp nói chung cần tiếp tục nghiên cứu, so sánh hàm lượng dược chất dòng rễ tơ với rễ Thổ nhân sâm tự nhiên KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Các mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phương xác định thuộc loài T paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) phương pháp hình thái so sánh kết hợp với phân tích mã vạch DNA Các mã vạch DNA sử dụng để định danh mẫu Thở nhân sâm vùng ITS, đoạn gen matK, ropC1, rpoB 1.2 Lá mầm đoạn thân mang mắt chồi bên vật liệu thích hợp tạo đa chồi in vitro Thổ nhân sâm Môi trường MS + 50 ml/l nước dừa + 1,5 mg/l BAP thích hợp cho phát sinh sinh trưởng chồi từ nách mầm Môi trường MS + 50 ml/l nước dừa + mg/l BAP thích hợp cho phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Khảo sát vật liệu chuyển gen thông qua A tumefaciens xác định mầm vật liệu nhận gen thích hợp Từ 730 mẫu biến nạp tạo 28 chuyển gen GmCHI điều kiện nhà lưới Protein tái tổ hợp GmCHI biểu hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1-2.2 T1-10 hệ T1 với hàm lượng 6,14 µg/mg 4,29 µg/mg Hai dòng Thở nhân sâm chuyển gen T1-2.2 T1-10 có hàm lượng flavonoid tởng số 4,24 mg/g 2,74 mg/g, tăng 7,4 lần 4,8 lần so với đối chứng không chuyển gen 1.3 Mơ vật liệu thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm Lây nhiễm mô A rhizogenes với OD600 = 0,6; nồng độ AS 100 μmol/l; thời gian nhiễm khuẩn 10 phút; thời gian đồng nuôi cấy ngày; nồng độ cefotaxime 500 mg/l điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm dòng rễ tơ tạo Mơi trường MS trạng thái lỏng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, ni điều kiện lắc thích hợp cho tăng trưởng rễ tơ Thổ nhân sâm Đề nghị 25 2.1 Tiếp tục phân tích đánh giá dòng Thở nhân sâm chuyển gen (T12.2; T1- 10) hệ T2, T3,… nhằm chọn dòng Thở nhân sâm chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao ởn định 2.2 Tiếp tục phân tích so sánh hàm lượng flavonoid dòng rễ tơ rễ khơng chuyển gen Thổ nhân sâm  ... rhizogenes Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) 3 Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng... TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM 20 3.3.1 Kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 3.3.1.1 Khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Thổ nhân sâm Kết khảo sát loại mơ thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ thể qua bảng... ảnh cảm ứng nuôi cấy rễ tơ Thổ nhân sâm A- mô Thổ nhân sâm; B- rễ tơ cảm ứng sau tuần; C- nuôi cấy rễ tơ môi trường bán lỏng sau tuần; D- nuôi rễ tơ môi trường lỏng nuôi lắc sau tuần; E- rễ tơ