Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid và cảm ứng tạo rễ tơ ở cây thổ nhân sâm (talinum paniculatum)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu Các kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố Tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tơi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn nội dung số liệu trình bày luận án Thái Nguyên, ngày 12 tháng năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Như Trang ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu trực tiếp hướng dẫn thường xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để tơi có tự tin lòng đam mê khoa học giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Được học tập sinh hoạt chuyên môn tập thể khoa học nghiêm túc, tơi nhận nhiều góp ý quý báu, trang bị thêm phương pháp nghiên cứu có hiểu biết sâu sắc vấn đề Sinh học đại Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh học, thầy cán phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khố học Cuối cùng, tơi xin tỏ lòng tri ân người thầy, đồng nghiệp, gia đình bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn ln đồng hành tơi q trình học tập Thái Nguyên, ngày 12 tháng năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Như Trang iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH .x MỞ ĐẦU Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM 1.1.1 Cây Thổ nhân sâm 1.1.2 Nghiên cứu định danh Thổ nhân sâm 1.1.3 Tái sinh in vitro Thổ nhân sâm 1.1.4 Nuôi cấy rễ tơ Thổ nhân sâm 1.2 FLAVONOID VÀ CON ĐƯỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở THỰC VẬT 1.2.1 Flavonoid 1.2.2 Con đường tổng hợp flavonoid thực vật 1.3 ENZYME CHI VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHI 1.3.1 Enzyme CHI 1.3.2 Gen CHI 1.3.3 Nghiên cứu biểu gen CHI Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu thực vật 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu iv 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp định danh mẫu Thổ nhân sâm 2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy in vitro 2.3.3 Phương pháp chuyển gen GmCHI Thổ nhân sâm 2.3.4 Phương pháp phân tích chuyển gen 2.3.5 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU THỔ NHÂN SÂM 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phương 3.1.2 Đặc điểm trình tự nucleotide vùng ITS đoạn gen matK 3.1.3 Thảo luận kết định danh mẫu Thổ nhân sâm tự nhiên 3.2 TẠO DÒNG THỔ NHÂN SÂM CHUYỂN GEN GmCHI 3.2.1 Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen Thổ nhân sâm 3.2.2 Kết chuyển gen GmCHI tạo Thổ nhân sâm chuyển gen 3.2.3 Kết phân tích Thổ nhân sâm chuyển gen 3.2.4 Thảo luận kết tạo dòng Thổ nhân sâm chuyển gen GmCHI 3.3 TẠO DÒNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM 3.3.1 Kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 3.3.2 Thảo luận kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98 Kết luận Đề nghị PHỤ LỤC 116 v DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, viết tắt AS BAP bp CCM cDNA CHI C4H CHS 4CL cs CTAB Tiếng Anh Acetosyringone Benzylaminopurine base pairs Co-cultivation medium Complementary Chalcone isomerase Cinnamate 4-hydroxylase Chalcone synthase 4-Coumarate CoA ligase Nghĩa tiếng Việt Cặp bazơ nitơ Môi trường đồng nuôi cấy DNA bổ sung Cộng Cetyltrimethyl ammonium 2,4 D bromide 2,4-Dichlorophenoxyacetic DFR acid Dihydroxyflavonol 4- DNA dNTP reductase Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside FAP F3H ELISA triphosphate Fatty-acid-binding proteins Flavanone-3-hydroxylase Enzyme-linked FLS FNS II GA3 GM GmCHI immunosorbentassay Flavonol synthase Flavone synthase II Gibberellic acid Germination medium Glycine max chalcone IAA IBA IFS ITS Kb kDa LB isomerase Idole acetic acid Idolbutylic acid Isoflavone synthase Internal transcribed spacers Kilo base Kilo Dalton Luria Bertani Xét nghiệm ELISA Axit gibberellic Môi trường nảy mầm Axit idole acetic Axit idolbutylic Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn vi Kí hiệu, viết tắt LDOX Tiếng Anh Leucoanthocyanidin L-Tyr mRNA MS oxygenase L-tyrosine Messenger ribonucleic acid Murashige Skoog, 1962 NAA OD Ori PAL PCR Ri-plasmid RM RNA Rol rpm scFv Naphthaleneacetic acid Optical density Origin Phenylalanine ammonia- lyase Polymerase chain reaction Root inducing- plasmid Rooting medium Ribonucleic acid Root locus Revolutions per minute Single-chain variable SDS SEM SIM Taq DNA fragment Sodium dodecyl sulfate Shoot elongation medium Shoot induction medium Thermus aquaticus DNA polymerase T-DNA polymerase Transfer DNA Nghĩa tiếng Việt Axit amin L-tyrosine RNA thông tin Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật Axit naphthaleneacetic Mật độ quang Điểm khởi đầu chép Phản ứng chuỗi trùng hợp Môi trường tạo rễ Axit ribonucleic Gen rol Số vòng/ phút Mơi trường kéo dài chồi Môi trường cảm ứng tạo chồi Đoạn DNA chuyển vào thực vật TDZ Ti-plasmid T0, T1 T0 Thidiazuron Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u Các hệ chuyển gen Cây chuyển gen tái sinh từ T1 chồi ống nghiệm Hạt chuyển gen T0 TL-DNA Transfer left -DNA nảy mầm thành T1 Vùng biên trái đoạn DNA TR-DNA Transfer right -DNA chuyển vào thực vật Vùng biên phải đoạn DNA UV Vir vvm Ultraviolet Virus interferon resistance Volume volume minute chuyển vào thực vật Tia cực tím Gen vir Thể tích khí/thể tích chất vii Kí hiệu, viết tắt WPM Tiếng Anh Woody plant medium WT X-gal Wild type 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ZT β-D-galacto-pyranoside Zeatin Nghĩa tiếng Việt lỏng/ phút Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy thân gỗ Cây không chuyển gen viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Sự sai khác trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ mẫu Thổ nhân sâm so với T paniculatum, mã số EU410357 Error: Reference source not found2 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide đoạn gen matK phân lập từ mẫu Thổ nhân sâm so với T paniculatum, mã số AY015274 Error: Reference source not found4 Bảng 3.3 Ảnh hưởng javel 60 % HgCl2 0,1 % đến tỷ lệ nảy mầm hạt Error: Reference source not found8 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ mầm 70 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Error: Reference source not found1 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tổ hợp mg/l BAP IBA đến phát sinh, sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Error: Reference source not found3 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IAA đến khả rễ Thổ nhân sâm Error: Reference source not found4 Bảng 3.8 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Thổ nhân sâm Error: Reference source not found5 Bảng 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn thân mang mắt chồi bên sau lây nhiễm A tumefaciens Error: Reference source not found7 Bảng 3.10 Kết biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào Thổ nhân sâm Error: Reference source not found9 Bảng 3.11 Hàm lượng flavonoid tổng số hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen T1- 2.2; T1- 10 đối chứng không chuyển genError: source not found6 Reference 114 105 Shyamkumar B., Anjaneyulu C., Giri C C (2003), “Multiple shoot induction from cotyledonary node explants of Terminalia chebula”, Biologia Plantarum, 47, pp 585 - 588 106 Siddique I., Anis M (2006), “Thidiazuron induced high frequency shoot bud formation and plant regeneration from cotyledonary node explants of Capsicum annuum L.”, Indian J Biotechnol, 5, pp 303 - 308 107 Siddique I., Anis M (2009), “Morphogenic response of the alginate encapsulated nodal segment and antioxidative enzymes analysis during acclimatization of Ocimum basilicum L.”, Journal of Crop Science and Biotechnology, 12, pp 233 - 238 108 Smith S A., Brown J W., Yang Y., Bruenn R., Drummond C P., Brockington S F., Walker J F., Last N., Douglas N A., Moore M J (2018), “Disparity, diversity, and duplications in the Caryophyllales”, New Phytol, 217, pp 836 - 854 109 Southern E M (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, J Mol Biol, 98, pp 503 - 517 110 Sun H J., Cui M., Ma B., Ezura H (2006), “Functional expression of the tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Lett, 580, pp 620 - 626 111 Tatiana D Veselova, Khalima K D., Margarita V R., Alexander C T (2012), “Embryology of Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn and T triangulare (Jacq.) Willd (Portulacaceae s.l., Caryophyllales)”, Wulfenia, 19, pp.107 - 129 112 Thiruvengadam M., Praveen N., Kim E H., Kim S H., Chung I M (2014), “Production of anthraquinones, phenolic compounds and biological activities from hairy root cultures of Polygonum multiflorum Thunb”, Protoplasma, 251(3), pp 555 - 566 113 Thwe A., Arasu M V., Li X., Park C H., Kim S J., Al-Dhabi N A., Park S U (2016), “Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn)”, Front Microbiol, 7, e65349 115 114 Timonin A C (2005), “Cymoid evolution resulting in (closed) thyrse: Talinum Adans (Portulacaceae) versus Wilhelm Troll”, Wulfenia, 12, pp 1-19 115 Tomilov A., Tomilova N., Yoder J I (2007), “Agrobacterium tumefaciens and A rhizogenes transformed roots of the parasitic plant Triphysaria versicolor retain parasitic competence”, Planta, 225, pp 1059 - 1071 116 Tsumura Y., Kawahara T., Wickneswari R., Yoshimura K (1996), “Molecular phylogeny of Dipterocarpaceae in Southeast Asia using RFLP of PCR-amplified chloroplast genes”, Theor Appl Genet, 93, pp 22 - 29 117 Vanhala L., Hiltunen R., Oksman-Caldentey K M (1995), “Virulence of different Agrobacterium strains on hairy root formation of Hyoscyamus muticus”, Plan Cell Rep, 14, pp 236 - 240 118 Veena V., Taylor C G (2007), “Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 43, pp 383 - 403 119 Vijayan K., Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Curr Sci, 99, pp 1530 - 1540 120 Wang R K., Zhan S F., Zhao T J., Zhou X L., Wang C E (2015), “Positive selection sites in tertiary structure of Leguminosae Chalcone isomerase 1”, Genet Mol Res, 14, pp 1957 - 1967 121 Yao L H., Jiang Y M., Shi J (2004), “Flavonoid in food and their health benefits”, Plant Food Hum Nutr, 59, pp 113 - 122 122 Yogananth N., Jothi Basu M (2009), “TLC method for determination of plumbagin in hairy root culture of Plumbago rosea L.”, Glob J Biotechnol Biochem, 4, pp 66 - 69 123 Yosephine S W M., Yachya A., Kristanti A N (2012), “Effect of aeration and inoculum density on biomass and saponin content of Talinum paniculatum Gaertn hairy roots in balloon-type bubble bioreactor”, J Pharm Biomed Sci, 2(4), pp 47 - 52 124 Yosephine S W M., Nike O S S., Alfinda N K (2014), “Production of adventitious root and saponin of Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn in 116 temporary immersion bioreactor”, Scholars Academic Journal of Biosciences (SAJB), 2(4), pp 246 - 250 125 Yosephine S W M., Kristanti A N., Utami E S W (2015), “Optimization of culture conditions of Talinum paniculatum Gaertn adventitious roots in balloon type bubble bioreactor using aeration rate and initial inoculum density”, Asian J Biol Sci, 8, pp 83 - 92 126 Yosephine S W M., Kristanti A N., Utami E S W., Yachya A (2015), “Effect of sucrose and potassium nitrate on biomass and saponin content of Talinum paniculatum Gaertn hairy root in balloon-type bubble bioreactor”, Asian J Biol Sci, 5, pp 1027 - 1032 127 Yulia W I., Razief N (2005), “Study of phytochemistry of Java ginseng compare to Korean ginseng in: Development of animal health and production for improving the sustainability of livestock farming in the integrated agriculture system”, German institute for tropical and subtropical agriculture, pp 45 - 49, Indonesia 128 Zenn Z C., Yi C C., Yi H C., Yen L (2006), “cDNA cloning and molecular characterization of 4-Coumarate: Coenzyme A ligase in Eucalyptus camaldulensis”, Taiwan J For Sci, 21, pp 87 - 100 129 Zhang X., Wang X., An L., Fan S., Xiang W (1995), “Plant regeneration from protoplasts of Talinum paniculatum”, Acta Botanica Sinica, 37(10), pp 754760 130 Zhao J., Ma L., Liu X., Wu H (2009), “Induction of calluses and establishment of plantlet rapid propagation in Talinum paniculatum”, Journal of Southwest University of Science and Technology, 1, pp 103 - 107 131 Zhu W., Jia Q., Wang Y., Zhang Y., Xia M (2012), “The anthocyanin cyanidin3-O-β-glucoside, a flavonoid, increases hepatic glutathione synthesis and protects hepatocytes against reactive oxygen species during hyperglycemia: involvement of a cAMP-PKA-dependent signaling pathway”, Free Radical Bio Med, 52, pp 314 - 327 PHỤ LỤC 117 Phụ lục Hình ảnh mẫu Thổ nhân sâm thu thập số địa phương phía Bắc Việt Nam TN1 TN2 HT QN BG Hình P1.1 Năm mẫu Thổ nhân sâm thu thập địa phương phía Bắc Việt Nam TN1: thành phố Thái Nguyên; TN2: huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên; QN: huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh; HT: thị xã Sơn Tây, Hà Nội; BG: huyện Tân Yên tỉnh Bắc Giang Phụ lục Kết xác định vùng ITS, đoạn gen matK, rpoB, rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI 118 Hình P2.1 Kết xác định vùng ITS mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.2 Kết xác định đoạn gen matK mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI 119 Hình P2.3 Kết xác định đoạn gen rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.4 Kết xác định đoạn gen rpoB mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI 120 Phụ lục Kết so sánh vùng ITS, đoạn gen matK, rpoB, rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm với trình tự GenBank 121 Hình P3.1 Trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide vùng ITS mang mã số EU410357 loài T paniculatum GenBank 122 123 124 Hình P3.2 Trình tự nucleotide đoạn gen matK phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen matK mang mã số AY015274 loài T paniculatum GenBank 125 Hình P3.3 Trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 mang mã số GQ436061 loài T paniculatum GenBank 126 127 Hình P3.4 Trình tự nucleotide đoạn gen rpoB phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen rpoB mang mã số MG710385 loài T paniculatum GenBank 128 Phụ lục Thành phần môi trường tái sinh Thổ nhân sâm chuyển gen Hỗn hợp Stock I (N1) Stock II (N2) Thành phần cho lít dung dịch 16,6 g CaCl2.2 H2O 95 g KNO3 + 8,5 g KH2PO4 + 82,5 g (NH4)NO3 + 18,5 g MgSO4.7H2O 1,24 g H3BO3 + 4,46g MnSO4.4H2O + mg CuSO4.7H2O Stock III (N3) + 1,72g ZnSO4.7H2O + 50 mg Na2MoO4.2H2O + 166 mg Stock IV (N4) KI + mg CoCl2.6H2O 5,56 g FeSO4.7H2O + 7,46 g Na2EDTA 20 mg Thiamine HCl + 100 mg pyridoxine HCl + 100 mg Stock V (N5) MS0 GM CCM nicotic acid + 0,4 g glycine + 20 g Myoinositol 20 ml stock I/l + 20 ml stock II/l + 5ml stock (III, IV, V)/l + g agarose MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa MS0 + 30 g/l sucrose + 100 μmol/l acetosyringon + 50 ml/l nước dừa Môi trường SIM lần 1: MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l SIM kanamycine Môi trường SIM lần 2: MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l SEM RM kanamycine MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycine MS0 + 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l IAA + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycine * Ghi chú: Các môi trường chuẩn pH = 5,8 khử trùng Thí nghiệm tiến hành nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 sáng/ngày ... A rhizogenes Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng... PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số:... tích hợp biểu gen chuyển GmCHI Thổ nhân sâm chuyển gen; Phân tích, so sánh hàm lượng flavonoid tổng số dòng Thổ nhân sâm chuyển gen không chuyển gen (iii) Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ từ Thổ nhân