Đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HỒNG ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TICH LŨY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Bích Ngọc Viện Cơng nghệ sinh học PGS.TS Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn PGS.TS Phạm Bích Ngọc PGS.TS Chu Hồng Hà Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn số liệu, nội dung trình bày luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Minh Hồng i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Bích Ngọc PGS.TS Chu Hồng Hà hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Bên cạnh đó, xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trung tâm tài nguyên thực vật, Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế tạo điều kiện cho tiến hành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ tài điều kiện làm việc khuôn khổ đề tài: “Khai thác phân lập nguồn gen có sẵn tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển giống sắn có khả chống chịu bệnh suất cao công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ, Bộ Khoa học Công nghệ; thời gian thực từ 6/2012 đến 6/2015 PGS.TS Phạm Bích Ngọc làm chủ nhiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Bộ phận phụ trách đào tạo tạo điều kiện thuận lợi để tơi học tập, nghiên cứu hồn thiện luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa, Lãnh đạo khoa cán môn Khoa học trồng, Bảo vệ thực vật, khoa Nông Lâm Ngư nghiệp, ĐH Hồng Đức tạo điều kiện thuận lợi để tơi n tâm cơng tác, học tập hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Hồng ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây sắn số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột sắn 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái di truyền 1.1.3 Giá trị sắn 1.1.4 Tình hình sản xuất sắn giới Việt Nam 1.1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột sắn 13 1.1.6 Một số hướng cải tạo giống sắn 15 1.2 Quá trình hình thành tích luỹ tinh bột sắn 19 1.2.1 Cấu tạo vai trò tinh bột thực vật 19 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột gen liên quan 20 1.3 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống sắn biến đổi gen 27 1.3.1 Hệ thống nuôi cấy in vitro sắn 27 1.3.2 Một số phương pháp chuyển gen sắn 32 1.3.3 Một số nghiên cứu tạo sắn biến đổi gen 35 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Vật liệu nghiên cứu 43 2.1.1 Vật liệu thực vật 43 2.1.2 Chủng vi khuẩn, vector 43 2.1.3 Hoá chất thiết bị thí nghiệm 43 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 44 2.1.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 45 2.2 Phương pháp nghiên cứu 45 2.2.1 Lựa chọn giống sắn phân nhóm giống sắn dựa vào tiêu đánh giá 45 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 45 2.2.3 Phương pháp phân lập gen promoter 51 2.2.4 Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen 52 2.2.5 Kỹ thuật canh tac, chăm soc cac giông săn phuc vu cho nghiên cưu 54 iii 2.2.6 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 54 2.2.7 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 55 2.2.8 Phương pháp phân tích có mặt gen chuyển 56 2.2.9 Phương pháp phân tích biểu chuyển gen 57 2.2.10 Phương pháp phân tích xử lí số liệu 60 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61 3.1 Lựa chọn giống sắn phân tích biểu gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột 61 3.1.1 Lựa chọn giống sắn sử dụng 61 3.1.2 Thu mẫu xử lý mẫu sắn 62 3.1.3 Tách chiết ARN tổng số 63 3.1.4 Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số lá, củ sắn giai đoạn phát triển khác đánh giá chất lượng cDNA 64 3.1.5 Thu thập thông tin, thiết kế cặp mồi thích hợp để phân tích biểu số gen liên quan tới sinh tổng hợp tích lũy tinh bột 65 3.1.6 Phân tích sở liệu biểu gen liên quan đến trình sinh tổng hợp đường tiền chất cho tổng hợp tinh bột củ sắn 66 3.2 Phân lập gen SSIV liên quan đến khả tổng hợp tinh bột thiết kế vector chuyển gen 75 3.2.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu 75 3.2.2 Phân lập gen SSIV sắn 76 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen 82 3.3 Đánh giá hoạt động vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thuốc 87 3.3.1 Chuyển gen SSIV vào thuốc đánh giá hoạt động gen chuyển 87 3.3.2 Đánh giá hoạt động gen chuyển 91 3.3 Đánh giá hoạt động vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thuốc 87 3.3.1 Chuyển gen SSIV vào thuốc đánh giá hoạt động gen 87 chuyển 3.3.2 Đánh giá hoạt động gen chuyển 92 iv 3.4 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào sắn 99 3.4.1 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro sắn 99 3.4.2 Xây dựng tối ưu quy trình chuyển gen vào sắn thông qua gen GUS 106 3.4.3 Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột 113 Chương BAN LUẬN KÊT QUA 118 4.1 Sự biểu gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột 118 4.2 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào thuốc 122 4.3 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào sắn 124 4.3.1 Hệ thống tái sinh sắn 124 4.3.2 Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A tumefaciens 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 130 TĨM TẮT TIẾNG ANH…………………………………………………… 131 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ………………………………………… …… 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO 137 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng sắn Bảng 1.2 Diện tích, suất, sản lượng sắn vùng giới năm 2014 – 2015 10 Diện tích, suất sản lượng sắn Việt Nam từ năm 2010 – 2014 12 Bảng 1.4 Một số cơng trình nghiên cứu tái sinh invitro sắn 29 Bảng 1.5 Tổng kết số cơng trình cơng bố chuyển gen vào sắn 36 Bảng 3.1 Đặc điểm số giống sắn sử dụng phân tích biểu gen 62 Nồng độ độ tinh mẫu RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn 63 Cơ sơ dư liêu cac gen liên quan đên qua trinh sinh tông hơp tinh bôt săn 66 Bảng 3.4 Trình tự cặp mồi để khuếch đại gen quan tâm 75 Bảng 3.5 Trình tự cặp mồi nhân dòng gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột thiết kế vector chuyển gen 76 Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen SSIV giống KM140 so với gen tham chiếu 78 Vị trí sai khác trình tự axit amin suy diễn protein SSIV gen phân lập 79 Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S: SSIV:T35S pBI121C54: SSIV:NOST vào thuốc lá……………………………… 90 Hàm lượng tinh bột tích luỹ rễ thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S dòng chuyển gen 97 Hàm lượng tinh bột tích luỹ rễ thuốc chuyển gen pBI121 – C54: SSIV: NOST dòng chuyển gen 98 Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu môi trường đến khả tạo mô sẹo (sau tuần) 100 Bảng 3.12 Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi môi trường CI 102 Bảng 3.13 Tỷ lệ phôi soma tạo 104 Bảng 3.14 Khả tái sinh thành hồn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa 105 Bảng 1.3 Bảng 3.2 Bang 3.3 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 vi Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 114 Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu chuyển gen giống sắn KM140 108 Ảnh hưởng Kanamycin đến khả sống sót mơ sẹo chuyển gen GUS giống sắn HB80 KM140 109 Ảnh hưởng Kanamycin đến tỷ lệ rễ chồi giống sắn HB80 KM140 110 Tạo sắn HB80 KM140 chuyển gen GUS thông qua A.tumefaciens 111 Chuyển gen pBI121- C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 2.1 Hình 2.2 Đặc điểm sắn (Manihot esculenta Crantz) Một số phương pháp phổ biến tạo sắn biến đổi gen Cơng thức hóa học tinh bột Quá trình sinh tổng hợp tinh bột enzyme liên quan Quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma sắn Kết tạo mơ sẹo phơi hố giống sắn TME 14 Trình tự đoạn cmyc vị trí mồi PCR Quá trình canh tac va thu hoach cac giông săn quan tâm tai Trai thưc nghiêm sinh học Cơ Nh phuc vu nghiên cưu Hình 2.3 Quy trình kiểm tra hàm lượng tinh bột phương pháp nhuộm iodine Hình 2.4 Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ rễ thuốc chuyển gen cấu trúc pBI121 – C54:SSIV: NOST Hình ảnh minh họa vị trí củ sắn Hình 2.5 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 RNA tổng số tách chiết từ mẫu củ (A) giống sắn (B) Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen actin từ cDNA sắn Phân tích mức độ biểu gen AGPS qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 18 20 21 31 32 53 54 58 59 60 62 63 64 67 Phân tích mức độ biểu gen AGPL qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 68 Phân tích mức độ biểu gen GBSS qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 69 Phân tích mức độ biểu gen SSI, SSIII, SSIV qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 71 Phân tích mức độ biểu gen SSII qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 72 Phân tích mức độ biểu gen SBE qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR Tách dòng đoạn gen SSIV từ củ sắn Tách dòng promoter C54 sắn Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Thiết kế vector pBI121/cmyc Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST 74 77 81 83 84 85 viii Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Hình 3.18 Hình 3.19 Hình 3.20 Hình 3.21 Hình 3.22 Hình 3.23 Hình 3.24 Hình 3.25 Hình 3.26 Hình 3.27 Hình 3.28 Hình 3.29 Hình 3.30 Hình 3.31 Hình 3.32 Hình 3.33 Hình 3.34 Quy trình chuyển gen vào thuốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 88 Một số hình ảnh chuyển gen quan tâm vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 89 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D35S:SSIV:T35S phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R 91 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pBI121C54:SSIV:NOST Kết Southern blot mẫu thuốc chuyển gen SSIV Anh điện di RNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyển gen Kết PCR nhân gen actin từ cDNA từ số dòng thuốc chuyển gen 91 92 93 94 Điên di san phâm RT-PCR gen SSIV dòng thuốc chuyển gen tương ứng 95 Nhuộm iodine số dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 96 Nhuộm iodine số dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV: NOST Mô sẹo từ nguồn nguyên liệu khác Các khối mơ sẹo phân hóa giai đoạn mơ phơi khác giống sắn thí nghiệm Chồi sắn tái sinh từ mơ sẹo phơi hóa Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả biến nạp gen GUS giống sắn HB80 KM140 98 101 103 106 107 Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 KM140 112 Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140 115 Cây sắn giống KM140 chuyển gen SSIV trồng nhà lưới 115 Điện di DNA tổng số dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST 116 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR dòng sắn chuyển gen với cặp mồi promoter C54F/SSIV-R 116 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR dòng sắn chuyển gen với cặp mồi virF/R 117 ix 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | .| | MeSSiv (Manes.15G118600.1) GAGAAATTAACGTTTTAGAGATGAAATTGGCAGAAACTGATGCAAGAATGAAAGTTGCTGCTCAAGAAAAGATGCATGTAGAACTCATGGAAGACCAATT MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) G 163 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGGAAAACTAAGAAACGAACTGGCTTACAGGGTTGGGAATCAGAACAAACTTTTGAATGAGGAAGCCCCCTTGATTCAGGACAGCACTATTCAGAACATT G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGTGAGGAGCTCAATTCATTGAGGGCAGAGAATACATCTCTGAGGACTGATATAGAAGCACTTAAGAGGGAGCTTAGTAATGTCAAGGATACAGATGAGC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GTGTTATAACACTGGAGAAAGAATGCATGCAGTTGGAGTCTTCTGTGAAAGACTTGGAATCCAAACTGTCAGTTTCTCAGGAAGATGTTTCAAAATTGTC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TAGCTTGAAAGTTGAATGTAAAGACTTGTGGGAAAAGGTGGGAAGTTTGCAAGCATTGTTAGATAAGGCAACAAAGCAAGCAGATCAGGCTATTCTAGTG MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TTGCAGCAAAATCGAGATCTTTGGAAGAAGGTTGATAAATTGGAAGAATCCTTGGAAGAGGCCAACGTCTATAAGTTATCGTCAGAAAAGTTACAGCAGT A MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATAATGAGCTAATGCAGCAAAAGATAAAACTATTGGAGGAACGTCTTCAACAATCTGATGAAGAAATATATTCTTATGTTCAGTTATACCAAGAATCTAT G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ACAGGAATTTCAAGATACACTTAATACTTTGAAAGAAGAAAGCAAGAAAAAGGCACTAGATGAACCTGTAGATGATATGCCCTGGCAATTTTGGAGTCAT MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TTATTGCTTATGATTGATGGTTGGCTTCTTGAGAAGAAGCTAACACTAGATGATGCAAAACTGTTGAGAGATATGGTATGGAAAAGAGAGAGGCGTATTC C 1610 1700 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 164 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATGACATATACTTAGAGTGCAAGGAAAAGAATGAGCATGAAGCTGTTTCTATGTTTCTCAAGCTGACATCATCACCAAAAAGTCAAGGATTATATGTCGT G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CCATATTGCAGCGGAGATGGCACCAGTTGCTAAGGTTGGTGGCTTGGGAGATGTTGTGACTGGTCTTGGAAAAGCACTCCAAAAGAGAGGACATCTTGTG C MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GAAATTATTCTGCCAAAGTATGACTGCATGCAATATGATGGTATTGGCAATTTAAGGGCCCTAGATGTGGTGTTGGAATCTTATTTTGATGGAAAATTAT MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ACAAAAACGAAGTATGGGTTGGCACCATTGAAGGTCTTCCTGTTTACTTTATTGAGCCTCATCACCCCGGCAAGTTCTTTTGGAGAGGGCAGTTCTACGG C MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGAACATGATGATTTCAAACGCTTTTCATTTTTCAGCCGTGCTGCACTTGAATTGCTTCTTCAAGCTGGCAAAAAACCAGACATAATTCATTGCCATGAC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TGGCAGACAGCTTTTGTTGCACCACTTTATTGGGATATATACGCCCCAAAAGGATTGAATTCAGCTAGAATATGTTTTACCTGTCACAACTTTGAGTACC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGGGGAGTGCACCAGCATCAGAATTGGCATCTTGTGGACTTGATGTCCAGCAGCTAAACAGACCAGATAGAATGCAGGACAACTCAGCACATGATAGGAT MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CAATCCTATTAAGGGTGCAGTGGTGTTCTCAAACATTGTGACAACAGTATCACCCACCTATGCACAAGAAGTGCGGACTTCTGAGGGCGGAAAAGGTCTC 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 165 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) CATTCGACGCTTAACTTTCATGCCAAGAAGTTCATTGGAATCCTAAATGGTATTGATACTGATGTGTGGAATCCTGCGACTGATACTCTTCTCGAAGTCC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGTACAATGCTAACGATCTTCAAGGAAAAGCAGAAAACAAAATAGCTACAAGGCAGCATCTTGGGTTATCAACTGCAGATGCTAGGCAGCCACTGGTTGG A MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CTGCATAACAAGATTGGTGCCACAGAAAGGTGTACATCTTATTAGACATGCAATATACCGTACGCTGGAGTTGGGAGGACAATTTCTACTTCTTGGCTCA MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGCCCAGTTGCACATATACAGAGGGAATTTGAGGGTATTGCAAATCACTTTCAGAATCATGAGCACATTCGGCTGGTATTGAAGTATGATGAATCTCTCG MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CTCATTCCATTTATGCAGCATCTGACATGTTCATCATCCCATCTATCTTTGAGCCTTGTGGCCTTACACAGATGATAGCAATGAGATATGGTTCCATACC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 3000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CATTGCAAGAAAAACCGGTGGTCTAAATGATAGTGTTTTTGATGTTGATGATGACACAATTCCTCTTCAGTTTCGAAATGGATATACATTCTTGAATCCT G G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 3100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GATGAGCAGGGAGTGAATAGTGCTTTAGAACGTGCATTTAACCATTATAGAAACGATCCTGAGAGCTGGCAGCAGCTTGTTCAAAGGGACATGGACATAG G A .A MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 3200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATTTTAGTTGGGAATCTTCAGCATCACAGTATGAGGAGCTCTACTCAAAATCAGTGGCCAGAGCAAGAGCGGCAGCAAGTAGGTCTTAATTATGGTAAAT 3210 | | | | | M e S S i v ( M a n e s G 1 0 3220 ) MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ASKLSTWFLSQGFTALNYNFDTNKQTATRFLLPSHRLLPASCKMRQRNLSSSQHKRQQLKKASPEQPPNTVGFHSRGGGGGDD-IGDDDNDSETESTAVH - - .S .D D MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | SVPSLNLDVESNEEVVDVSVDVEHAQHTGANDVERNVDMEHVQDVGAKDLYSLTQEMKTLGIDGAEKLSSIPDEMKPLVLNKDGGEQLSSFQLEDLIGMI MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | RNAEKNILLLNQARVHALEDLERILAEKEILQGEINVLEMKLAETDARMKVAAQEKMHVELMEDQLGKLRNELAYRVGNQNKLLNEEAPLIQDSTIQNIS .E .G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | EELNSLRAENTSLRTDIEALKRELSNVKDTDERVITLEKECMQLESSVKDLESKLSVSQEDVSKLSSLKVECKDLWEKVGSLQALLDKATKQADQAILVL MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | QQNRDLWKKVDKLEESLEEANVYKLSSEKLQQYNELMQQKIKLLEERLQQSDEEIYSYVQLYQESIQEFQDTLNTLKEESKKKALDEPVDDMPWQFWSHL I R MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | LLMIDGWLLEKKLTLDDAKLLRDMVWKRERRIHDIYLECKEKNEHEAVSMFLKLTSSPKSQGLYVVHIAAEMAPVAKVGGLGDVVTGLGKALQKRGHLVE .L R MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | IILPKYDCMQYDGIGNLRALDVVLESYFDGKLYKNEVWVGTIEGLPVYFIEPHHPGKFFWRGQFYGEHDDFKRFSFFSRAALELLLQAGKKPDIIHCHDW S MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | QTAFVAPLYWDIYAPKGLNSARICFTCHNFEYQGSAPASELASCGLDVQQLNRPDRMQDNSAHDRINPIKGAVVFSNIVTTVSPTYAQEVRTSEGGKGLH 810 900 820 830 840 850 860 870 880 890 167 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | STLNFHAKKFIGILNGIDTDVWNPATDTLLEVQYNANDLQGKAENKIATRQHLGLSTADARQPLVGCITRLVPQKGVHLIRHAIYRTLELGGQFLLLGSS MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | PVAHIQREFEGIANHFQNHEHIRLVLKYDESLAHSIYAASDMFIIPSIFEPCGLTQMIAMRYGSIPIARKTGGLNDSVFDVDDDTIPLQFRNGYTFLNPD L MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 | | | | | | | | | | | | | | | EQGVNSALERAFNHYRNDPESWQQLVQRDMDIDFSWESSASQYEELYSKSVARARAAASRS*LW*MAFSWKAKDX .* * .K N * * 168 Kết xác định trình tự promoter C54 phân lập (so sánh với trình tự truy vấn C54 (AY217353)) kết blasn (NCBI) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter ggatccacgggtgtgggccaactccaccgcccaagagaaaacctaaaatggagaaatttgtcaaagctttttcaactttacagactaggcataggtcctg - 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter gggcaaacagaacagagctcaggacgctgcctccctgcttgcccacctggaatcattgttctccgcttcctgcttatgtcatattctccgatgatttttt 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter attttttaattttgcgtttctctttctttgcaggtaaaataagcccatctcaaattcagatttgggtaatcatgcgatttgagaaacattatagaaaaaa 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter ggtgatcaactccaattgtgtgataattttgtagatgtggcaattaaggtcggtttggcttttataagaaattagaattaaccaatttcataattatatc R 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter attcatgactattgattataatatctgacaaatcctgtaatgatttttaacccatttcagtatgatttactcatcccattctttatggctgcttcaatat Y 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter acagagttcatgacatgtgaatctgaatttaaatattaatttctctgtttaattaataattaataatccatttcatataatttttttaaattaattaatt 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter aattaaagaagaaaataagaagctgggaacatgataataataaaggtcacctacattaccgactgcacaaagcacataagcacaaaaaaccaaaagaaag 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter atgatggcttagctgaaaaaggccctccattatttacacttttcgatcaaaaacaaatatcatgggtaatttaaaaagataaagtacagcttacttattt t .TA C Y 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter gaaaaaaaatttttaattcacnattcttaaaatgttgatntattcctattgattttgatttcagagagatgtgaggtcaaatcccaagattcctcttcct 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter taggtagagttcccacctctctccctctcacatgaagcttactggcctctactcctctctctatataagccactctcagttaccctctctctgcaccaaa C54 Referen C54 Promoter tacactctaagctctctcttcacttcctctttgcttctcaccatttacttttagtttctatttcattttctcttgctttctatg 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | | | | | 169 Kết phân tích promoter C54 phần mềm TSSP C C5 >5 > te st se qu en ce te st se qu en ce L e n g t h L e n g t h o f o f s e q u e n c e - s e q u e n c e - T h r e s h o l d s f o r T A T A + p r o m o t e r s , f o T h r e s h o l d s f o r T A T A + p r o m o t e r s , f o 170 for promoter at position 815 (+) RSP00005 979 (+) RSP00016 703 (-) RSP00512 cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc for promoter at position 1004 993 815 (+) RSP00005 979 (+) RSP00016 CTWWWWWWGT caTGCAC CTWWWWWWGT caTGCAC 876 (-) gcttttgaTGACtTcaaacac RSP00026 876 (-) gcttttgaTGACtTcaaacac RSP00026 943 (+) atccattcTATATAAGaaacata RSP00046 943 (+) atccattcTATATAAGaaacata RSP00046 790 (+) cttaatatATTTTTAattattttattctcttaa RSP00098 794 (+) RSP00117 aattATTTTTAaa 795 (+) RSP00125 aatATTTTTAtt 786 (+) RSP00126 gaaaattttaatATTTTTAtttagtatt 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc 794 (+) RSP00117 795 (+) RSP00125 aattATTTTTAaa aatATTTTTAtt 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc 794 (+) RSP00140 706 (+) RSP00161 aattATTTTTAtt WAAAG 763 (+) RSP00161 769 (+) RSP00161 WAAAG WAAAG 732 (-) RSP00161 966 (+) RSP00240 WAAAG CAGTTA 918 (+) RSP00252 774 (-) RSP00265 CACATG ACTTTA 711 (-) RSP00305 826 (-) RSP00308 CCTTTT CAACA 798 (+) RSP00339 743 (-) RSP00339 RTTTTTR RTTTTTR 864 (+) RSP00383 787 (+) RSP00398 GGTCAAA TTTGAA 863 (+) RSP00467 862 (+) RSP00468 tGGTCAatTc ttGGTCAatTc 908 (-) RSP00469 759 (+) RSP00477 GNGGTG TTTAA 801 (+) RSP00477 820 (-) RSP00477 TTTAA TTTAA 764 (-) RSP00477 796 (+) RSP00508 TTTAA gcaTTTTTatca 801 (-) RSP00508 800 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 794 (+) RSP00140 763 (+) RSP00161 aattATTTTTAtt WAAAG 732 (-) RSP00161 966 (+) RSP00240 WAAAG CAGTTA 918 (+) RSP00252 826 (-) RSP00308 CACATG CAACA 798 (+) RSP00339 743 (-) RSP00339 RTTTTTR RTTTTTR 864 (+) RSP00383 787 (+) RSP00398 GGTCAAA TTTGAA 863 (+) RSP00467 862 (+) RSP00468 tGGTCAatTc ttGGTCAatTc 908 (-) RSP00469 759 (+) RSP00477 GNGGTG TTTAA 801 (+) RSP00477 820 (-) RSP00477 TTTAA TTTAA 764 (-) RSP00477 796 (+) RSP00508 TTTAA gcaTTTTTatca 801 (-) RSP00508 800 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 799 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 799 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 798 (-) RSP00508 769 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 798 (-) RSP00508 769 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 745 (-) RSP00508 712 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 745 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 703 (-) RSP00512 cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc 171 Phụ lục Sơ đồ vector mang gen SSIV tổng hợp nhân tạo pK7WG2D-35S:SSIV:T35 pBI121-C54:SSIV:NOST 172 Phụ lục Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) C a Cl K H K N M gN H F e S O H K IM n Z C n 11 o C u 12 N a 13 M 41 nG 51 ly T 61 hi M y 17 P yr H 173 ... 3.3 Đánh giá hoạt động vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thuốc 87 3.3.1 Chuyển gen SSIV vào thuốc đánh giá hoạt động gen chuyển 87 3.3.2 Đánh giá hoạt. .. hoạt động gen chuyển 91 3.3 Đánh giá hoạt động vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thuốc 87 3.3.1 Chuyển gen SSIV vào thuốc đánh giá hoạt động gen 87 chuyển. .. tổng hợp tích lũy tinh bột 65 3.1.6 Phân tích sở liệu biểu gen liên quan đến trình sinh tổng hợp đường tiền chất cho tổng hợp tinh bột củ sắn 66 3.2 Phân lập gen SSIV liên quan