Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong bacillus subtilis ứng dụng trong cô ng nghiệp xử lý vải bông

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ TRỌNG TÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM ƯNG DUNG TRONG CÔNG NGHIÊP XƯ LY VAI BÔNG Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN TRƯỜNG Hà Nội - 2015 http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Trọng Tài http://www.lrc.tnu.edu.vn i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Trường, người thầy hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (nay Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học luận văn Tơi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp tơi vượt qua khó khăn để hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình bè bạn - người ln bên tơi, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả Lê Trọng Tài http://www.lrc.tnu.edu.vn ii MỤC LỤC LƠI CAM ĐOAN i LƠI CAM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MUC TƯ VIÊT TĂT v DANH MUC BANG vi DANH MUC HINH vii MƠ ĐÂU TÔNG QUAN TAI LIÊU 1.1 Sơ lược Bacillus subtilis 1.2 Hệ biểu Bacillus subtilis 1.3 Pectin 1.4 Pectinase 1.4.1 Khái niệm pectinase 1.4.2 Phân loại chế hoạt động pectinase 1.5 Pectinase Bacillus subtilis 10 1.6 Ứng dụng pectinase kiềm 11 1.6.1 Cấu tạo sợi tự nhiên 11 1.6.2 Ứng dụng pectinase kiềm công nghiệp xử lý vải 12 1.6.3 Ứng dụng công nghiệp sản xuất bột giấy 13 1.6.4 Ứng dụng pectinase kiềm chiết xuất dầu thực vật, chế biến cà phê trà 13 1.7 Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp giới Việt Nam 13 VÂT LIÊU VA PHƯƠNG PHAP 14 2.1 14 Vật liệu 2.1.1 Các chủng vi khuẩn 14 2.1.2 Hóa chất thí nghiệm iii Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 15 2.1.3 Các vector sử dụng 15 2.1.4 Trình tự mồi 15 2.2 Môi trường nuôi cấy 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Sàng lọc chủng B subtilis có hoạt tính pectinase môi trường thạch đĩa 17 2.3.2 Thu nhận pectinase ngoại bào từ chủng B subtilis tự nhiên 17 2.3.3 Thu nhận pectinase ngoại bào từ chủng tái tổ hợp 17 2.3.4 Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11] 17 2.3.5 Xác định hoạt tính pectinase phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10] 19 2.3.6 Xác định hoạt tính pectinase phương pháp phát liên kết đôi 21 http://www.lrc.tnu.edu.vn iv 2.3.7 Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn B subtilis 22 2.3.8 Tách chiết DNA plasmid từ E coli 23 2.3.9 Tách chiết DNA plasmid từ B subtilis 23 2.3.10 Các phương pháp thao tác sinh học phân tử 23 2.3.11 Biến nạp plasmid vào E coli phương pháp xung điện 26 2.3.12 Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B subtlis 168 26 2.3.13 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) 27 KÊT QUA VA THẢO LUÂN 28 3.1 Sàng lọc chủng B subtilis phân lập từ nước có hoạt tính pectinase cao 28 3.1.1 Sàng lọc chủng B subtlis có hoạt tính pectinase đĩa thạch 28 3.1.2 Nghiên cứu khả phân cắt pectin pH kiềm dịch enzyme ngoại bào chủng nghiên cứu 29 3.1.3 Xác định hoạt tính pectinase phương pháp phát liên kết đôi 31 3.2 Tách dòng gen pectinase E coli 32 3.2.1 Tách chiết DNA tổng số chủng B subtilis 32 3.2.2 Nhân gen pectinase PCR 33 3.2.3 Tách dòng gen pel vào E coli 34 3.2.4 Giải trình tự gen pectinase 36 3.3 Tạo chủng B subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase 38 3.3.1 Thiết kế vector biểu gen pectinase B subtilis 38 3.3.2 Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B subtilis 43 3.3.3 Biểu chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase môi trường lỏng 44 3.4 So sánh tính chất enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh từ chủng tự nhiên 47 3.4.1 So sánh ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp pectinase từ chủng tự nhiên 47 3.4.2 So sánh ảnh hưởng pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp pectinase từ chủng tự nhiên 48 KÊT LUÂN VA KIÊN NGHI 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v TÀI LIÊU THAM KHẢO 50 Tài liệu tiếng Việt 50 Tài liệu tiếng Anh 50 http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MUC TƯ VIÊT TĂT a.a : Amino acid APS : Ammonium persulfate B subtilis : Bacillus subtilis BMM : Mơi trường khống chất Belisky BSA : Bovine serum albumin DEAE : Diethylethanolamine DNA : Deoxyribonucleic axit DNSA : 3,5-Dinitrosalicylic axit E coli : Escherichia coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit HTAB : Hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide ISO : International standards organization kDa : Kilo Dalton LB : Luria bertani M : Mole OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction pel : Gen pectinase Pel : Enzyme pectinase RR : Rhuthenium red rPel : Pectinase tái tổ hợp SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine U : Unit Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v DANH MUC BANG Bảng 1.1 Phân loại pectinolytic enzyme Bảng 1.2 Các thành phần cấu tạo sợi 11 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng nhân gen 23 Bảng 2.2 Chương trình nhân gen PCR 23 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC HindIII 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pJET/pel HindIII 24 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter 24 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel 24 Bảng 3.1 Kết sàng lọc chủng B subtilis có khả phân hủy pectin đĩa thạch 28 Bảng 3.2 Hoạt tính pectinase điều kiện pH phản ứng tối ưu chủng nghiên cứu 30 Bảng 3.3 Hoạt tính pectinase enzyme thu 31 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MUC HINH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học đoạn pectin Hình 1.2 Thủy phân pectin pectin methylesterases Hình 1.3 Sự thủy phân polygalacturonate endo- exopolygalacturonase Hình 1.4 Sự phân cắt polygalacturonate pectinase Hình 1.5 Sự kết nối cellulose chất cellulose lớp thứ cấp sợi Pectin tồn hai loại: pectin axit esterified pectin 11 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn protein 18 Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành amino, 5-nitrosalicylic axit 19 Hình 2.3 Đường chuẩn glucose 20 Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit pectinase 21 Hình 3.1 Hình ảnh số chủng B subtilis tạo vòng thủy phân pectin đĩa thạch LB 0,2% pectin 29 Hình 3.2 Ảnh hưởng pH đến khả phân hủy pectin pectinase từ chủng nghiên cứu 31 Hình 3.3 Điện di DNA tổng số chủng B subtlis 33 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase 34 Hình 3.5 Khuẩn lạc thể biến nạp E coli DH5α mang pJET/pel môi trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin 34 Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel HindIII 35 Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel HindIII 35 Hình 3.8 So sánh theo hàng trình tự amino acid Pel từ chủng B subtilis phân lập Việt Nam với Pel từ B subtilis 168 37 Hình 3.9 Sơ đồ thiết kế vector biểu pel B subtilis 39 Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC HindIII 40 Hình 3.11 Thu nhận pel từ pJET/pel 40 Hình 3.12 Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel PCR 41 Hình 3.13 Nhân gen dung hợp BaP-pel PCR 42 Hình 3.14 Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel pMSE/BaP-pel 42 Hình 3.15 Kiểm tra pMSE/BaP-pel tế bào B subtlis 168 tái tổ hợp 44 Hình 3.16 Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào chủng B subtilis tái tổ hợp đa Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC HindIII 1: pKTH/pUC cắt HindIII, 2: DNA marker Thang DNA chuẩn đặt bên Với mục đích thu pKTH-BaP (pKTH mang promoter BaP) plasmid pKHT/pUC cắt với HindIII để loại bỏ pUC18 (2,7 kb), băng DNA 3,7 kb băng pKTH-BaP thu nhận thí nghiệm (Hình 3.10) Thành phần phản ứng cắt ghi Bảng 2.1 phần phương pháp Thu nhận pel từ pJET/pel Gen pel pJET/pel tách dòng từ chủng VBS11 phần 3.2.3 sử dụng để thiết kế vector biểu Plasmid pJET/pel sau cắt HindIII phân tách gel 0,8% agarose Băng DNA 1,5 kb thu nhận làm gel extraction kit (Qiagen) sau kiểm tra lại điện di agarose Kết Hình 3.11 cho thấy gen pel thu có độ tinh cao, đủ chất lượng cho thí nghiệm Hình 3.11 Thu nhận pel từ pJET/pel Gen pel 1,5 kb mũi tên http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 Tạo khuôn mẫu cho phản ứng nhân gen PCR Để tạo gen dung hợp BaP-pel, trước hết pKTH-BaP pel nối với T4 ligase để tạo sợi khuôn cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng nối thực Bảng 2.3 phần phương pháp Phản ứng nối thực 16 °C, qua đêm Sau kết thúc phản ứng, sản phẩm gắn gen sử dụng để làm khuôn mẫu cho phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel Nhân gen dung hợp BaP-pel PCR Phản ứng gắn BaP với pel có hai khả xảy ra: khả thứ BaP nối với pel thuận chiều, tức promoter BaP nối trực tiếp với đầu 5’ gen pel Khả thứ hai BaP nối với pel ngược chiều, tức BaP nối trực tiếp với đầu 3’của gen pel Do mồi xuôi (mồi F) thiết kế bám vào vị trí đầu 5’ promoter BaP mồi ngược (mồi R) bám vào vị trí đầu 3’ pel (Hình 3.12) làm phản ứng PCR BaP-pel nối thuận chiều nhân lên Gen dung hợp BaP-pel mang promoter BaP terminator pel Primer F Sản phẩm ligationnối thuận chiều pKTH BaP Ter pel Primer R PCR XhoI XbaI BaP pel Ter Gen dung hợp nhân lên cặp mồi Hình 3.12 Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel PCR Vị trí bám mồi mũi tên ngang Với mục đích thiết kế vector biểu đa copy, thiết kế cặp mồi nhân gen dung hợp BaP-pel để thiết kế vào pMSE3 Trình tự nucleotid http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 mồi chi tiết phần phương pháp Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm thể Bảng 2.6 Sau thực phản ứng nhân gen cặp mồi với khuôn mẫu sản phẩm gắn gen trên, sản phẩm PCR kiểm tra điện di agarose 0,8% Kết cho thấy nhân lên đoạn gen khoảng 1,8 kb tổng chiều dài promoter BaP (0,384 kb) gen pel (1,438 kb) Điều chứng tỏ promoter BaP nối thuận chiều với gen pel gen dung hợp BaP-pel nhân lên PCR (Hình 3.13) M 1,8 kb Hình 3.13 Nhân gen dung hợp BaP-pel PCR 2: BaP-pel nhân lên cặp mồi cặp mồi 2, M : DNA marker kb (EUR) Băng DNA 1,8 kb mũi tên Thang DNA chuẩn đặt bên 3.3.1.3 Tạo vector đa copy pMSE/BaP-pel Hình 3.14 Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel pMSE/BaP-pel - 2: pMSE/BaP-pel cắt XhoI XbaI., M : DNA marker kb (EUR) Băng DNA 5,6 kb 1,8 kb mũi tên Thang DNA chuẩn đặt bên Để đưa gen BaP-pel vào pMSE3, trước hết pMSE3 BaP-pel sau nhân lên PCR mục 3.2.3 làm kit QIAGEN từ agarose sau xử lý với XhoI XbaI trước nối T4 ligase 16 ºC qua đêm Sản phẩm nối biến nạp vào DH10b phương pháp xung điện Thể biến nạp chọn lọc môi trường LB thạch đĩa bổ sung 50 µg/ml kanamycin 20 µg/ml streptomycin Các thể biến nạp sinh trưởng môi trường chọn lọc nuôi cấy môi trường lỏng để tách chiết plasmid kiểm tra enzyme giới hạn Kết điện di agarose cho thấy plasmid sau cắt XhoI XbaI cho băng vector kích thước khoảng 5,6 kb băng kích thước 1,8 kb (Hình 3.14) Điều chứng tỏ gen BaP- pel đưa thành công vào vector pMSE3 Plasmid pMSE3 mang gen BaP- pel đặt tên pMSE/Bap-pel 3.3.2 Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B subtilis 3.3.2.1 Chuẩn bị plasmid đa copy pMSE/BaP-pel Khác với biến nạp gen E coli, biến nạp gen vào B subtilis cần phải có lượng plasmid đủ lớn (30-50 µg), nồng độ plasmid phải đủ cao (khoảng µg/µl) biến nạp thành cơng Trong thí nghiệm này, plasmid pMSE/Ba-pel tách từ E coli kit tách plasmid Qiagen theo hướng dẫn hãng Kết tách plasmid đánh giá điện di agarose cho băng vector (5,6 kb ) băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.14) Điều chứng tỏ plasmid pMSE/BaP-pel tách đủ chất lượng thí nghiệm biến nạp gen 3.3.2.2 Biến nạp gen pectinase vào B Subtilis 168 Plasmid pMSE3/BaP-pel biến nạp vào tế bào B subtilis 168 theo phương pháp tế bào tương hợp tự nhiên mô tả phần phương pháp Lượng plasmid sử dụng để biến nạp µg tổng thể tích 15 µl Sau kết thúc biến nạp, thể biến nạp chọn lọc môi trường thạch đĩa bổ sung 20 µg/ml kanamycin Các thể biến nạp sinh trưởng môi trường chọn lọc nuôi cấy môi trường LB lỏng bổ sung kananmycin để kiểm tra có mặt plasmid tế bào Các plasmid sau tách phân tích XhoI XbaI kiểm tra điện di agarose Kết cho thấy plasmid tách từ thể biến nạp khác xuất băng vector (5,6 kb) băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.15) Điều chứng tỏ plasmid pMSE3/BaP-pel biến nạp vào B subtilis 168 Chủng tái tổ hợp đặt tên BSM 5,6 kb 1,8 kb Hình 3.15 Kiểm tra pMSE/BaP-pel tế bào B subtilis 168 tái tổ hợp 2: pMSE/BaP-pel cắt XhoI XbaI., : DNA marker kb Băng vector (5,6 kb) BaP-pel (1,8 kb) mũi tên 3.3.3 Biểu chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase môi trường lỏng Để đánh giá biểu pectinase môi trường lỏng chủng BSM, thể biến nạp khác trẻ hóa mơi trường LB lỏng 20 µg/ml kanamycin sau cấy chuyển sang môi trường BMM (tỉ lệ 1%) để kiểm tra biểu gen tái tổ o hợp Sau 24 ni cấy lắc 200 vòng/phút, 37 C, enzyme ngoại bào thu nhận li tâm loại bỏ sinh khối kiểm tra protein điện di SDS-PAGE khả phân hủy chất pectin Hình 3.16 Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào chủng B subtilis tái tổ hợp đa copy mơi trường LB+Kan 1-4: 15 µl dịch enzyme ngoại bào thể biến nạp khác nhau, 5: dịch lên men từ chủng B subtlis 168 Kết điện di SDS-PAGE cho thấy dịch enzyme thể biến nạp kiểm tra xuất băng protein đậm kích thước 42 kDa với kích thước pectinase tnh toán Mẫu đối chứng dịch enzyme từ chủng BS168 xuất băng mờ, điều chứng tỏ băng protein 42 kDa pectinase tái tổ hợp biểu hiện, mẫu (dịch enzyme từ chủng B subtilis 168 pectinase sinh tự nhiên nên nồng độ enzyme thấp phát điện di protein (Hình 3.16) Kiểm tra hoạt tính pectinase mẫu với chất pectin cho thấy hoạt tnh pectinase chủng đối chứng B subtilis 168 đạt 15 U/ml mẫu từ chủng tái tổ hợp đạt từ 66 - 72 U/ml (cao 4,6-4,8 lần so với chủng B subtilis 168) (Hình 3.17) Hoạt tính pectate lyase B subtilis tái tổ hợp đa co py 80.00 70.00 Hoạt tính e nzy me (U/m l) 60.00 50.00 40.00 30.00 20 00 10 00 0.00 BSM1 BSM2 BSM3 BSM4 BS168 Các thể biế n nạp k hác Hình 3.17 Kiểm tra biểu pectinase thể biến nạp đa copy tế bào B subtilis 168 sau 24 nuôi cấy BSM 1-5: thể biến nạp đa copy, BS168: chủng B subtlis 168 khơng biến nạp gen Hoạt tính pectinase thể biến nạp kiểm tra đĩa thạch có 0,2% chất pectin axit phương pháp đục lỗ Sau nhỏ 30 µl dịch enzyme ngoại bào vào lỗ thạch, mẫu ủ 42 ºC qua đêm sau nhuộm với ruthenium red 0,05% Kết cho thấy đường kính vòng hoạt tính mẫu tái tổ hợp BSM tạo cm, lớn nhiều mẫu đối chứng B subtilis 168 không mang gen (1,8 cm) (Hình 3.18) Hình 3.18 Kiểm tra hoạt tính pectinase thể biến nạp đa copy BSM chủng B subtilis 168 chất pectin axit BSM: thể biến nạp đa copy, BS168: chủng B subtilis 168 không biến nạp gen Nasser cộng (1993) biểu thành công gen pel B subtlis tế bào E coli với hệ biểu T7 promoter, nhiên sản phẩm biểu tạo protein ngun vẹn có kích thước 42 kDa protein khơng ngun vẹn kích thước 33 kDa [30] Khác với Nasser, kết biểu gen pel B subtilis cho băng protein 42 kDa, điều chứng tỏ gen pel biểu tế bào B subtlis tốt E coli Liu cộng (2011) biểu thành công gen pectinase kiềm (Apel) từ B subtilis TCCC11286 tế bào B subtilis WB600, kết biểu cho băng protein 45 kDa [27] tương tự kết biểu 3.4 So sánh tính chất enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh từ chủng tự nhiên 3.4.1 So sánh ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp pectinase từ chủng tự nhiên Để xác định nhiệt độ tối ưu cho phản ứng, dịch enzyme thu sau lên men chủng tái tổ hợp BSM chủng tự nhiên VBS11 ủ với 0,2% pectin đệm Tris 50 mM, 20 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2, pH 10 nhiệt độ khác Phản ứng enzyme thực phần phương pháp Giá trị OD 530 thu sau đo máy quang phổ chuyển đổi sang đơn vị Hoạt tính enzyme (U) hoạt tính (Unit) 14 12 100 rPel 80 60 VBS11 25 30 35 40 42 45 50 55 60 70 Nhiệt độ (ºC) Hình 3.19 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính enzyme Kết Hình 3.19 cho thấy nhiệt độ tối ưu cho phản ứng rPel o 42 C, tương tự hoạt tính tối ưu chủng tự nhiên VBS11 Hoạt tính enzyme có xu hướng giảm nhanh nhiệt độ phản ứng cao nhiệt độ tối ưu Kết giống với kết nghiên cứu trước nhiệt độ tối ưu enzyme pectinase từ B subtilis Nasser cộng [31] 3.4.2 So sánh ảnh hưởng pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp Hoạt tính enzyme (U) pectinase từ chủng tự nhiên 140 12 10 VBS11 60 rPel 0 7.5 8.5 9.5 10 10.5 11 Giá trị pH Hình 3.20 Ảnh hưởng pH tới hoạt tính enzyme Tính chất xúc tác phản ứng phân cắt enzyme phụ thuộc vào pH đệm phản ứng cần thiết phải đánh giá ảnh hưởng pH để tm pH tối ưu Trong thí nghiệm enzyme thực phản ứng với 0,2% pectin đệm tris 50 mM, 10 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2 pH khác Kết thí nghiệm cho thấy hoạt tnh enzyme rPel đạt cao pH10 (Hình 3.20) pH tối ưu rPel tương tự pH tối ưu enzyme Pel từ chủng gốc VBS11 trình bày phần 3.1 Điều chứng tỏ tính chất xúc tác phản ứng rPel không thay đổi so với enzyme từ chủng tự nhiên KÊT LUÂN VA KIÊN NGHI 4.1 Kết luận Đã sàng lọc chủng B subtlis nguồn gốc Việt Nam sinh pectinase cao Giải mã trình tự gen gen pectinase: pel6, pel8, pel11 pel13 Độ tương đồng gen phân lập với trình tự nucleotide với gen có độ tương đồng cao từ 96,3, tới 99,5% Độ tương đồng aa với trình tự aa Pel biết đạt 98,8 đến 99,7% Tạo 01 chủng B subtilis BSM tái tổ hợp đa copy sinh pectinase sản lượng cao o Nhiệt độ pH tối ưu enzyme tái tổ hợp rPel 42 C, pH 10 4.2 Kiến nghị Với kết nghiên cứu bước đầu đề tài đạt được, đề tài cần tiếp tục nghiên cứu: Nghiên cứu xử lý vải thô rPel để loại pectin Nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men chủng sinh pectinase tái tổ hợp qui mô pilot Nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ xử lý sinh học (Bioscouring) thay xút khâu nấu kiềm (alkaline scouring) TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dương Văn Tuân, Lê Thị Hoàng Linh 2012 'Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme pectinase, cellulase vi khuẩn B.subtilis, P.lantarum nấm mốc A.niger, Ph.chrysosporium để xử lý lớp nhớt vỏ cà phê' Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ Đại học Đà Nẵng năm 2012 Huỳnh Ngọc Oanh, Trần Ngọc Hùng 2008 'Thu nhận enzyme pectinase từ Asp.niger - tinh phương pháp lọc gel lọc màng' Science & Technology Development, Vol 11, No.08 - 2008 Nguyễn Nhật Minh Phương , Chế Văn Hoàng , Lý Nguyễn Bình Châu Trần Diễm Ái 2011 'Tác động enzyme pectinase đến chất lượng rượu vang xoài sau thời gian lên men chính' Tạp chí Khoa học 2011:20a 127-136 Trường, L V., Thomas, S (2010) 'Biểu cao gen mã hóa xylanase Bacillus subtilis sử dụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens', Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3A), pp 827- 832 Trường, L V., Việt, H., Hải, T.N (1998) 'Tách dòng biểu cao gen alphaamylase từ Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis', Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 36 (2), pp 12-18 Tài liệu tiếng Anh Albersheim, P and Killias, U (1962) 'Studies relating to the purification and properties of pectin transeliminase', Arch Biochem Biophys, 97, pp 107-15 Angayarkanni, J., Palaniswamy, M., Murugesan, S and Swaminathan, K (2002) 'Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp pectinase', J Biosci Bioeng, 94(4), pp 299-303 Anis, P a E., H A (2002) 'Comparison of alkaline scouring of cotton vs alkaline pectinase preparation', AATCC Review, 2(12), pp 22-28 Batra, S K (1985) in Lewin, M., and Pearce, E.M (ed.) Handbook of Fiber Science and Technology, pp 727-807 10 Bernfeld, P (1955) 'Amylases a and b In: Colowick SP, Kaplan NO (eds) ', Methods in enzymeology New York, pp 149-155 11 Bradford, M M (1976) 'A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding', Anal Biochem, 72, pp 248-54 12 Buchert, J., and Pere J., (2000) 'Scouring of cotton with pectinases, proteases and lipases', Textile Chemist and Colorist & American Dyestuff Reporter, 31(5), pp 4852 13 Burkholder, P R and Giles, N H., Jr (1947) 'Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis', Am J Bot, 34(6), pp 345-8 14 Cavaco-Paulo, A., Gübitz, G M (2003) 'Textile processing with enzyme ', Cambridge: Woodhead Publishing, pp 17–18, 30–34, 51–52, 90–95, 110, 124–125, 129–131, 158–169 15 Eters, J N., Husain, P A, N.K Lange (1999) 'Alkaline pectinase: an ecofriendly approach to cotton preparation', Textile Asia, pp 83-86 16 Finkelman, M J., J E Zajic (1978) 'Developments in Industrial', Microbiology, pp 459 17 Fu, L L., Xu, Z.R., Li, W., Shuai, J B., Lu, P., Hu, C X (2007) 'Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: imrpelication for optimization of heterologous protein secretion.', Biotechnol Adv, 25, pp 1-12 18 Guo, W., González-Candelas, L., Kolattukudy, P.E (1995) 'Cloning of a novel constitutively expressed pectinase gene pelB from Fusarium solani f sp pisi (Nectria haematococca, mating type VI) and characterization of the gene product expressed in Pichia pastoris', J Bacteriol, 177(24), pp 7070-7 19 Hartzell, M M., Hsieh, Y L (1998) 'Enzymeatic scouring to improve cotton fabric wettability', Text Res J., 68(4), pp 233-41 20 Kashyap, D R., Vohra, P.K., Chopra, S., Tewari, R (2001) 'Applications of pectinases in the commercial sector: a review', Bioresource Technology, 77, pp 215227 21 Keen, N T and S., T (1986) 'Structure of two pectinase genes from Erwinia chrysanthemi EC1 and their high-level expression in Escherichia coli', J Bacteriol 22 Klug-Santner, B G., Schnitzhofer, W., Vrsanská, M., Weber, J., Agrawal, P.B., Nierstrasz, V.A., Guebitz, G.M (2006) 'Purification and characterization of a new bioscouring pectinase from Bacillus pumilus BK2', J Biotechnol, 121, pp 390-401 23 Kunst, F., et al (1997) 'The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis', Nature, 390, pp 249-256 24 Lei, S P., Lin, H.C., Heffernan, L., Wilcox, G (1985) 'Cloning of the pectinase genes from Erwinia carotovora and their expression in Escherichia coli', Gene, 35(1-2), pp 63-70 25 Laemmli U., K 2009 “Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4” Nature 227 (5259): 680-685 26 Li, Y a H., I R (1998) 'Enzymatic Scouring of Cotton - Surfactants, Agitation, and Selection of Enzymes', Text Chem Col., 30(9), pp 23-9 27 Liu, Y., Chen, G., Wang, J., Hao, Y., Li, M., Li, Y., Hu, B., Lu, F (2012) 'Efficient expression of an alkaline pectinase gene from Bacillus subtilis and the characterization of the recombinant protein', Biotechnol Lett., 34(1), pp 109-15 28 Macmillian, J D., et al (1966) Methods in enzymeology, pp 632 29 Morozova, V.V., Semenova, M.V., Salanovich, T.N., Okunev, O.N., Koshelev, A.V., Bubnova, T.V., Krichevskiĭ, G.E., Timatkov, A.G., Barysheva, N.V., Sinitsyn, A.P (2006) 'Application of neutral-alkaline pectinase to cotton fabric boil off', Appl Biochem Microbiol, 42, pp 603-8 30 Nasser, W., Awadé, A.C., Reverchon, S., Robert-Baudouy, J (1993) 'Pectinase from Bacillus subtilis: molecular characterization of the gene, and properties of the cloned enzyme', FEBS Lett, 335(3), pp 319-26 31 Nasser, W., Chalet, F., Robert-Baudouy J (1990) 'Purification and characterization of extracellular pectinase from Bacillus subtilis', Biochimie, 72, pp 689-695 32 Pickersgill, R., Jenkins, J., Harris, G., Nasser, W., Robert-Baudouy, J (1994) 'The structure of Bacillus subtilis pectinase in complex with calcium', Nature, 1(10), pp 717 – 723 33 Reid, I., Ricard, M (2000) 'Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide', Enzyme Microb Technol, 26, pp 115-23 34 Reid, I., Ricard, M (2004) 'Purified pectinase lowers cationic demand in peroxidebleached mechanical pulp', Enzyme Microb Technol, 34, pp 499-504 35 Ricca, E., Adriano, O., Henriques and Simon M Cutting (2004) 'Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications', Horizon Bioscience Press 36 Schaechter, M., Ingraham, J.L., Neidhardt, F.C (2007) 'The road from The Microbial world to Microbe', Int Microbiol, 10(3), pp 153-6 37 Schallmey, M., Singh, A., and Ward, O P (2004) 'Developments in the use of Bacillus species for industrial production', Can J Microbiol, 50, pp 1-17 38 Schols, H A., M A Posthumus, Voragen, A.G.J (1990) 'Structural features of hairy region of pectin isolated from apple juice producted by the liquefation process', Carbohydrate Research, 206(1), pp 117-129 39 Seagull, R W., Oliveri, V., Murphy, K., Binder, A., and Kothari, S (2000) 'Cotton fiber growth and development Changes in cell diameter and wall birefringence ', J Cotton Sci 4, pp 97-104 40 Searle-van Leeuwen, M J F., Vincken, J.P., Schipper, D., Voragen, A.G.J., Beldman, G., Voragen, J.V.a.A.G.J (1996) 'Acetyl esterases of Aspergillus niger: purification and mode of action on pectins', Prog Biotechnol., pp 793–798 41 Shevchik, V E., J Robert-Baudouy, Hugouvieux-Cotte-Pattat N (1997) 'Pectinase PelI of Erwinia chrysanthemi 3937 belongs to a new family', J Bacteriol 179, pp 7321-7330 42 Somogyi, M (1952) Journal of Biological Chemistry, 195, pp 19 43 Sonenshein A.L., H J., Richard Losick (2002) 'Bacillus subtilis and its closest Relatives: From Genes to Cells', ASM Press 44 Soriano, M., Diaz, P., Pastor, F.I.J (2006) 'Pectinolytic systems of two aerobic sporogenous bacterial strains with high activity on pectin', Curr Microbiol, 50, pp 114-8 45 Traore, M K., Buschle-Diller, G (2000) 'Environmentally Friendly Scouring Processes', TCC&ADR, 32(12), pp 40-43 46 Truong, L V., Tuyen, H., Helmke, E., Binh, L.T., Schweder, T (2001) 'Cloning of two pectinase genes from the marine Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis strain ANT/505 and characterization of the enzymes', Extremophiles, 5(1), pp 35-44 47 Vigneswaran, M A., N Anbumani (2012) 'Neural Network Approach for Optimizing the Bioscouring Performance of Organic Cotton Fabric through Aerodynamic System', Journal of Textile and Apparel technology and Management, 7(3 ) 48 Waddell, R B (2002) 'Bioscouring of cotton: commercial applications of alkaline stable pectinase', AATCC Review 2, pp 28-30 49 Wang, L F., and Doi, R.H (1989) 'Heterologous gene expression in Bacillus subtilis', in Butterworth-Heinemann, R.H.D.a.M.M (ed.) Biology of bacilli: applications to industry Boston: Mass, pp 63–104 50 Whitaker, J R (1990) 'Microbial pectolytic enzymes', in William, M.F.a.G., T Kelly (ed.) Microbial enzymes and biotechnology ed 51 Wipat, A., Harwood, C R (1999) 'The Bacillus subtilis genome sequence: the molecular blueprint of a soil bacterium', FEMS Microbiology Ecology 28 (1 ), pp 1-9 52 Zhang, C., Yao, J., Zhou, C., Mao, L., Zhang, G., Ma, Y (2013) 'The alkaline pectinase PEL168 of Bacillus subtilis heterologously expressed in Pichia pastoris is more stable and efficient for degumming ramie fiber', BMC Biotechnology ... Nghiên cứu biểu cao gen mã hóa pectnase Bacillus subtlis ng dung cô ng nghiêp xư ly vải ” góp phần tạo ch ng vi khuẩn tái tổ hợp sản sinh pectinase sản lư ng cao để ng du ng cho c ng nghiệp xử... lư ng vải tốt Việc ng du ng enzyme pectinase kiềm c ng nghệ xử lý vải phát triển kho ng 10 năm gần Nh ng nhiều nhà c ng nghệ quan tâm ích lợi to lớn ch ng việc n ng cao chất lư ng vải b ng, ... c ng nghệ kh ng muốn c ng bố kết nghiên cứu mình, việc làm bình thư ng kinh doanh Gần Liu c ng c ng bố kết biểu gen pectinase từ B subtilis B subtilis WB600 hiệu suất cao mục đích ng du ng cho